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    重庆时时彩是不是搞假: 用于检测CRP浓度的免疫层析试纸条及检测试剂盒.pdf

    关 键 词:
    用于 检测 CRP 浓度 免疫 层析 试纸 试剂盒
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    摘要
    申请专利号:

    CN201710049144.X

    申请日:

    2017.01.23

    公开号:

    CN106771255A

    公开日:

    2017.05.31

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 著录事项变更IPC(主分类):G01N 33/68变更事项:申请人变更前:四川迈克生物科技股份有限公司变更后:迈克生物股份有限公司变更事项:地址变更前:611731 四川省成都市高新区百川路16号变更后:611731 四川省成都市高新区百川路16号|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/68申请日:20170123|||公开
    IPC分类号: G01N33/68; G01N33/558 主分类号: G01N33/68
    申请人: 四川迈克生物科技股份有限公司
    发明人: 李军; 王春梅
    地址: 611731 四川省成都市高新区百川路16号
    优先权:
    专利代理机构: 代理人:
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201710049144.X

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2017.08.15|||2017.06.23|||2017.05.31

    法律状态类型:

    著录事项变更|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及用于检测CRP浓度的免疫层析试纸条及检测试剂盒。具体地,本发明的免疫层析试纸条包含在底板上顺次固定且端部互相连接的样品垫、包被膜、吸水垫,所述包被膜上沿着从样品垫到吸水垫的方向在膜本体上顺次分布有互相间隔开的质控包被物包被区、CRP单克隆抗体A包被区和CRP抗原包被区。本发明的检测试剂盒包含试纸条和独立包装的样品反应液,所述样品反应液包含带有标记物的CRP单克隆抗体B,和带有标记物的与质控包被物特异性结合的物质。本发明的试纸条在超出标准操作范围的温度和时间条件下,具有更加可靠、稳定的检测性能。

    权利要求书

    1.一种用于检测CRP浓度的免疫层析试纸条,包含在底板上顺次固定且端部互相连接
    的样品垫、包被膜、吸水垫,所述包被膜上沿着从样品垫到吸水垫的方向在膜本体上顺次分
    布有互相间隔开的质控包被物包被区、CRP单克隆抗体A包被区和CRP抗原包被区。
    2.根据权利要求1所述的试纸条,其中所述质控包被物选自抗兔IgG、兔IgG、生物素、亲
    和素、或结合有生物素或亲和素的蛋白,优选抗兔IgG。
    3.根据权利要求1或2所述的试纸条,其中所述质控包被物的包被浓度为0.1-10mg/mL,
    优选0.6-4mg/mL。
    4.根据权利要求1到3中任一项所述的试纸条,其中所述CRP单克隆抗体A的包被浓度为
    0.5-10mg/mL,优选1-4mg/mL。
    5.根据权利要求1到4中任一项所述的试纸条,其中所述CRP抗原的包被浓度为0.1-
    10mg/mL,优选0.6-2mg/mL。
    6.根据权利要求1到5中任一项所述的试纸条,其中所述质控包被物包被区与CRP单克
    隆抗体A包被区之间的间隔距离为2-8mm,优选2-4mm。
    7.根据权利要求1到6中任一项所述的试纸条,其中所述CRP单克隆抗体A包被区与CRP
    抗原包被区之间的间隔距离为2-8mm,优选2-4mm。
    8.一种用于检测CRP浓度的试剂盒,包含如权利要求1到7中任一项所述的试纸条和独
    立包装的样品反应液,所述样品反应液包含带有标记物的CRP单克隆抗体B,和带有标记物
    的与所述质控包被物特异性结合的物质。
    9.如权利要求8所述的用于检测CRP浓度的试剂盒,其中所述与所述质控包被物特异性
    结合的物质是兔IgG、抗兔IgG、亲和素、生物素、或结合有生物素或亲和素的蛋白等,优选兔
    IgG。
    10.如权利要求8或9所述的用于检测CRP浓度的试剂盒,其中所述标记物为荧光、化学
    发光和/或发色标记物,优选荧光微球、荧光素、胶体金、罗丹明,更优选荧光微球,最优选其
    中包埋有稀土铕Eu的荧光微球。
    11.如权利要求8-10中任一项所述的用于检测CRP浓度的试剂盒,其中所述样品反应液
    包含0.002-0.02OD600荧光标记的兔IgG和0.01-0.05OD600荧光标记的CRP单克隆抗体B,优选
    地包含0.003-0.01OD600荧光标记的兔IgG和0.015-0.03OD600荧光标记的CRP单克隆抗体B。

    说明书

    用于检测CRP浓度的免疫层析试纸条及检测试剂盒

    技术领域

    本发明涉及一种用于检测CRP浓度的免疫层析试纸条,以及包含所述试纸条的检
    测试剂盒。

    背景技术

    C反应蛋白(C-Reactive Protein,CRP)是一种经典的急性时相反应蛋白,由肝细
    胞合成。在健康人血清中CRP浓度很低(<5mg/L),在机体受到微生物入侵或组织损伤等炎症
    性刺激时浓度显著升高。因此,CRP是临床检测上最常用的急性时相反应指标之一。

    较为早期的CRP检测方法包括胶乳凝集实验法、免疫比浊法、放射免疫测定法等
    等,但是分别存在灵敏度低、检测范围小、同位素污染等各种缺陷,已经逐渐被淘汰。

    传统上由于不同生理状况评估时对灵敏度、特异性有不同的需求,加之检测方法
    的局限性,对CRP浓度的检测通常分为超敏检测(检测线性范围0.1-10mg/L)和常规检测(检
    测线性范围3-200mg/L)。

    近年来,免疫层析法技术迅速发展,已经开发出能够同时兼顾高浓度和低浓度需
    求,同时兼顾高灵敏度和宽线性范围的检测方法,在临床和实验室中得到了广泛的应用。

    专利申请CN105891510A公开了一种CRP免疫荧光层析检测用包被膜、试纸条及其
    使用方法,解决了现有CRP免疫层析技术不能同时兼顾宽线性范围检测和高灵敏度检测的
    问题。该专利申请能够在不稀释CRP检测样品的前提下,保证CRP检测同时兼有高灵敏度和
    宽线性范围,避免了传统检测方法需要对临床样本进行几百倍稀释引起取样偏差。

    专利申请CN102023211A公开了一种全程定量检测C反应蛋白的免疫层析试纸条及
    其制备方法。所述试纸条能够快速对全程CRP进行灵敏的定量测定,能同时检测出具有hs-
    CRP和常规CRP两个结果,具有全面的线性范围和良好的检测灵敏度。

    发明内容

    但是,现有的免疫层析法在检测人血浆、血清和全血中CRP浓度时,要求必须在规
    定的反应时间、环境温度和检测时间下才能得到准确的结果。然而,由于受到检测人员、医
    院条件等不同的限制,能同时满足以上三个条件的可能性很小。

    有时候因医院检测人员工作负荷较大、无法及时处理检测试验品,或者由于检测
    人员缺乏培训、经验或熟练程度不够,有可能会在规定的检测时间上推后(1-2min)或者提
    前(1-2min)读取测定结果。如果在这种情况下读数发生显著变化,则很容易导致测定结果
    作废,浪费时间与金钱。

    在一些条件较差的基层医院中,检测室有可能并未设有暖气或者空调。在酷暑或
    者寒冬的极端天气下,无法保障检测室的常规温度。在落后地区、战乱地区等条件恶劣的地
    区,这更成为一种常态。因为这些特殊的原因,常常不能在规定的环境温度(如18℃-30℃)
    下进行CRP检测反应,甚至需要在严重偏离环境温度(例如4℃、37℃等)的温度下进行检测
    反应。另外,现有的免疫层析法绝大多数要求在冷藏条件下储存,但在检测之前必须将试剂
    与试纸条恢复至室温才能获得准确的检测结果。如果检测人员没能将试剂与试纸条充分恢
    复至室温就进行检测,也可能导致读数不够准确。

    上述这些因素使得免疫层析法的反应时间、反应温度无法保障,严重影响检测结
    果的准确性。

    本发明人惊讶地发现,本发明的免疫层析试纸条在不同的环境温度下进行反应时
    保持了稳定的测定准确度。本发明人还惊讶地发现,本发明的免疫层析试纸条在不同的测
    定时间进行读数时,也保持了良好的读数稳定性。

    本发明提供了一种用于检测CRP浓度的免疫层析试纸条,包含在底板上顺次固定
    且端部互相连接的样品垫、包被膜、吸水垫,所述包被膜上沿着从样品垫到吸水垫的方向在
    膜本体上顺次分布有互相间隔开的质控包被物包被区(C线)、CRP单克隆抗体A包被区(T1
    线)和CRP抗原包被区(T2线)。本领域技术人员应当明白,在实践操作中包被区往往使用仪
    器或者手动划线制得,其线状外观的线条宽度相对于整个试纸条的长度而言可以忽略不
    计。

    本发明的试纸条中,质控包被物选自抗兔IgG、兔IgG、生物素、亲和素、或结合有生
    物素或亲和素的蛋白等,优选抗兔IgG。

    本发明的试纸条中,质控包被物的包被浓度为0.1-10mg/mL,优选0.6-4mg/mL。

    本发明的试纸条中,CRP单克隆抗体A的包被浓度为0.5-10mg/mL,优选1-4mg/mL。

    本发明的试纸条中,CRP抗原的包被浓度为0.1-10mg/mL,优选0.6-2mg/mL。

    本发明的试纸条中,质控物包被区与CRP单克隆抗体A包被区之间的间隔距离为2-
    8mm,优选2-4mm。

    本发明的试纸条中,CRP单克隆抗体A包被区与CRP抗原包被区之间的间隔距离为
    2-8mm,优选2-4mm。

    本发明试纸条中C线、T1线、T2线之间的间隔距离可由本领域技术人员根据需要来
    确定。优选地采取如上文所述范围时,首先避免了三条线之间形成交叉从而避免了无法获
    取真实检测数据的情况,而且反应混合物经过各个区域的时间也不会差异太大,从而避免
    了孤立三条线之间整体关系、最终影响检测结果的情况。

    本文上下文中所称“试纸条”,是指免疫层析技术中常用的层析系统方式,也可以
    是试纸卡、试剂卡等常用形式,只要其利用了免疫层析技术原理即可。

    本发明的试纸条中,底板可以是免疫层析技术中常用的各种惰性底板,优选聚氯
    乙烯PVC底板。

    本发明的试纸条中,固定可以采用本领域中常用的各种方式实现,只要各个部分
    在外力下不易脱开互相附着的状态即可。固定方式包括但不限于热层压技术固定、粘合固
    定等,优选粘合固定。

    本文上下文中所称“端部互相连接”,是指样品垫、包被膜、吸水垫几个部分的端部
    物理上互相连接,其连接方式包括但不限于搭接、粘接、层压连接等,只要能够允许层析样
    品连续地顺次通过各个部分即可。

    本文上下文中所称“吸水垫”,是指免疫层析技术中常用的吸水材料组成的片状结
    构,因其微结构的毛细作用而导致含有样品的反应液沿层析方向从上样垫移动至吸水垫。
    吸水垫可选自吸水滤纸等。

    本发明的试纸条中,膜本体可以是免疫层析技术中常用的固相膜,例如玻璃纤维
    素膜(fiberglass)、尼龙膜(nylon)、聚偏氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜、
    硝酸纤维素膜(nitrocellulose,NC)等等,优选硝酸纤维素膜。所述膜可具有0.2-0.6μm或
    5-10μm的孔径。

    本发明还提供了一种用于检测CRP浓度的试剂盒,包含本发明的试纸条和独立包
    装的样品反应液,所述样品反应液包含带有标记物的CRP单克隆抗体B,和带有标记物的与
    所述质控包被物特异性结合的物质。

    本发明的用于检测CRP浓度的试剂盒中,与所述质控包被物特异性结合的物质是
    兔IgG、抗兔IgG、亲和素、生物素、或结合有生物素或亲和素的蛋白等,优选为兔IgG。

    本发明的用于检测CRP浓度的试剂盒中,样品反应液中的标记物为荧光、化学发光
    和/或发色标记物,优选荧光微球、荧光素、胶体金、罗丹明,更优选荧光微球,最优选其中包
    埋稀土铕Eu的荧光微球。

    本发明的用于检测CRP浓度的试剂盒中,所述反应液包含0.002-0.02OD600荧光标
    记的兔IgG和0.01-0.05OD600荧光标记的CRP单克隆抗体B,优选0.003-0.01OD600荧光标记的
    兔IgG和0.015-0.03OD600荧光标记的CRP单克隆抗体B。本领域技术人员应当理解,本文所述
    “CRP单克隆抗体A”与“CRP单克隆抗体B”并非旨在对所述CRP单克隆抗体进行任何类型的具
    体限制,仅仅是为了在两种CRP单克隆抗体之间进行区分。也就是说,所述样品反应液中的
    CRP单克隆抗体B与试纸条中用于包被膜的CRP单克隆抗体A二者均可以是任何CRP单克隆抗
    体,只要它们分别结合于CRP的不同位点即可。

    在本发明的用于检测CRP浓度的一个实施方式中,首先用样品反应液稀释含有CRP
    的样品,此时CRP与反应液中的荧光标记的CRP单克隆抗体B结合,形成荧光标记-单抗B-CRP
    复合物。加样于样品垫上后,反应混合物沿层析方向进入包被膜。反应混合物层析经过C线
    时,荧光标记的兔IgG与C线包被的抗兔IgG形成荧光标记-兔IgG-抗兔IgG复合物留在C线
    处;反应混合物层析经过T1线时,反应混合物中的荧光标记-单抗B-CRP复合物与T1线的CRP
    单克隆抗体A结合,形成带有荧光标记的双抗体夹心复合物留在T1线处;反应混合物层析经
    过T2线时,反应混合物中游离的CRP抗原与包被在T2线的CRP抗原竞争结合反应混合物中荧
    光标记的CRP单克隆抗体B以形成荧光标记-单抗B-CRP复合物,包被在T2线的CRP抗原与荧
    光标记的CRP单克隆抗体B形成的荧光标记-单抗B-CRP复合物被留在T2线处,其余的荧光标
    记-单抗B-CRP复合物则不被留在T2线处。通过荧光检测仪检测包被膜的荧光强度信号值,
    参考标准曲线,即可获得样品中的CRP检测浓度。

    通过前段中所述的C线、T1线、T2线的特别排布方式及其与样品反应液和样品中
    CRP的相互作用方式,本发明的试纸条与试剂盒克服了现有免疫层析试纸条在不同反应温
    度下或进行不同反应时间后读数不够稳定的缺陷,实现在各种不利检测条件下仍能保证检
    测稳定性和精准度的技术效果。本发明的试纸条与试剂盒因而具有更佳广泛的适用环境,
    为基层医院、战乱、不稳定地区、极端环境下的CRP检测提供了更好的选择。

    附图说明

    图1:本发明一个具体实施方式的用于检测CRP浓度的免疫层析试纸条的示意图。
    1-底板,2-样品垫,3-包被膜,4-吸水垫,5-质控包被物包被区(C线),6-CRP单克隆抗体A包
    被区(T1线),7-CRP抗原包被区(T2线)。

    图2:本发明一个具体实施方式的用于计算CRP浓度的信号值—CRP浓度标准曲线。

    实施方式

    本文包括以下的实施例,用于以例证的方式更清楚、明确地阐述本发明的技术方
    案。本领域技术人员根据本文的公开应当理解,可以在所公开的特定的实施方式中进行许
    多改变但是仍然获得相似或类似的结果,而不偏离本发明的思想和范围。本发明的具体实
    施方式仅用于解释本发明,而非意图通过任何方式限制本发明。

    材料和方法

    具体实施方式中采用的技术手段,请参照标准实验室手册,例如《蛋白质技术手
    册》,2002年4月1日,科学出版社。

    如无特别说明,具体实施方式中使用的试剂购自四川迈克生物新材料技术有限公
    司。

    实施例1

    制备本发明的试纸条

    一、抗体的制备

    实施例中所用CRP抗原、兔IgG、抗兔IgG、CRP单克隆抗体A(货号:XCL1146)和CRP单
    克隆抗体B(货号:XCL1145)购自四川迈克生物新材料技术有限公司。

    二、包被膜的制备

    1.制备包被缓冲液

    包被缓冲液C是含有2%海藻糖和0.5mg/mL抗兔IgG的10mM PBS溶液,包被缓冲液
    T1是含有3%甲醇和2.0mg/mL CRP单克隆抗体A的10mM PB溶液,包被缓冲液T2是含有2%海
    藻糖和1.0mg/mLCRP抗原的10mM PBS溶液。

    2.喷膜

    采用喷膜机(公司:BioDot,型号:BioDot xyz3060),顺次将包被缓冲液C(包被浓
    度0.5mg/mL)、包被缓冲液T1(包被浓度2.0mg/mL)和包被缓冲液T2(包被浓度1.0mg/mL)在
    硝酸纤维素膜上划线,分别形成C线、T1线和T2线。相邻包被区(即C线与T1线、T1线与T2线)
    之间的间隔为3mm,外侧两个包被区(C线与T2线)与包被膜的最外侧边缘留出足够的空隙,
    以供搭接样品垫与吸水垫(见图1)。将喷膜后的硝酸纤维素膜放入40℃的真空干燥箱内干
    燥30分钟后取出,密封备用。

    三、样品垫的制备

    用含0.1%TW-20的水溶液浸泡玻璃纤维素膜(购自PALL)。彻底浸透后,将膜放入
    55℃的真空干燥箱内,干燥40分钟后取出,密封备用。

    四、试纸条的制备

    将制好的包被膜粘贴在PVC底板的中心位置(见图1)。在C线外侧粘贴样品垫,使样
    品垫与C线外侧包被膜边缘搭接重叠1-2mm;在T2线外侧粘贴吸水垫,使吸水垫与T2线外侧
    包被膜边缘搭接重叠1-2mm。

    实施例2

    制备样品反应液

    一、用荧光微球标记兔IgG与CRP单克隆抗体B

    使用0.5μm稀土荧光微球,通过共价键与兔IgG和CRP单克隆抗体B偶联,制得荧光
    微球标记的兔IgG和CRP单克隆抗体B。

    二、制备样品反应液

    用含5%NaCl、0.5%牛血清白蛋白、0.5%酪蛋白、5%海藻糖、0.5%PEG20000、
    0.2%Tween20、0.5%PC300的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 7.6)稀释用荧光微球标记的兔IgG与
    用荧光微球标记的CRP单克隆抗体B,使得最终产物中荧光标记的兔IgG终浓度为
    0.005OD600,荧光标记的CRP单克隆抗体B的终浓度为0.02OD600。以0.745ml/管的体积分装在
    EP管中并密封。4℃下冷藏保存。

    比较例1

    TC式试纸条

    购买广州万孚生物技术股份有限公司全程C-反应蛋白检测试剂(批号:C15907
    B),作为TC式试纸条进行检测。该试纸条的T线包被有C-反应蛋白单克隆抗体,C线包被有抗
    鼠IgG多克隆抗体。

    比较例2

    制备TTT式试纸条

    如实施例1中所述制备比较例2的试纸条,区别在于包被膜上沿着层析方向顺次排
    列着互相间隔5mm的T1线、T2线和T3线,其中T1线包被有CRP单克隆抗体A(3mg/mL)、T2线包
    被有CRP单克隆抗体B(5mg/mL)、T3线包被有CRP抗原(5mg/mL)。该试纸条的标准检测温度为
    18℃~30℃,标准检测时间为3分钟。

    实施例3

    在不同环境温度下检测CRP浓度

    一、绘制本发明试纸的标准曲线

    使用20M PB缓冲液稀释已知浓度的市售CRP产品(四川迈克生物新材料技术有限
    公司),得到如表1所示从0.00mg/L至320mg/L的浓度梯度标准品。将上样后的本发明试纸条
    置于荧光定量光谱检测系统(R01干式荧光免疫分析仪,四川迈克生物科技股份有限公司)
    中,获取荧光信号强度信号值读数。以信号值为X轴、浓度为Y轴绘制标准曲线,得到图2。

    表1、本发明试纸条标准曲线

    浓度mg/L
    信号值
    0.00
    36
    0.47
    139
    0.94
    251
    1.88
    440
    3.75
    823
    7.50
    1637
    15
    3234
    30
    6662
    60
    12138
    120
    18889
    240
    29442
    320
    35149

    二、参比样品溶液的制备

    使用已知浓度的市售CRP产品(四川迈克生物新材料技术有限公司),制备下表2、3
    中左栏所列CRP浓度(mg/L)的参比样品溶液,用于后续的测定。

    三、样品稀释

    使用实施例2中制得的样品反应液,以1:150的比例稀释参比样品溶液。

    四、检测

    将经过反应液稀释的参比样品溶液分别加样在实施例1(上样体积90μL)、比较例1
    (上样体积75μL)和比较例2(上样体积90μL)的试纸条的上样垫上,使层析反应分别在三个
    不同的温度下进行3分钟;将试纸条置于荧光定量光谱检测系统(R01干式荧光免疫分析仪,
    四川迈克生物科技股份有限公司)中,读取荧光信号值读数;将荧光信号值与图2的标准曲
    线进行比对得到CRP测定浓度。结果列于表2中。

    表2


    通过表2的数据可以看出,本发明的试纸条即使在6.2℃和37℃的不利温度条件下
    进行反应时,仍然能够保持稳定可靠的检测结果。但是,比较例1和比较例2在偏离环境温度
    的不利温度(6.2℃和37℃)下,检测得到的CRP浓度均已远远偏离标准品浓度,不再具有检
    测意义上的参考价值。

    实施例4

    在不同反应时间后检测CRP浓度

    如实施例3中所述制备参比样品溶液并对其进行稀释,不同之处仅在于检测部分
    如下进行。

    将经过反应液稀释的参比样品溶液分别加样在实施例1(上样体积90μL)、比较例1
    (上样体积75μL)和比较例2(上样体积90μL)的上样垫上,使层析反应在25℃下分别进行2、
    3、4、5或6分钟;将试纸条置于荧光定量光谱检测系统(R01干式荧光免疫分析仪,四川迈克
    生物科技股份有限公司)中,读取荧光信号值;将荧光信号值与图2的标准曲线进行比对得
    到CRP测定浓度。结果列于表3中。

    表3.





    通过表3的数据可以看出,本发明的试纸条即使在比标准检测时间3min更早
    (2min)或更晚(4、5、6min)的时间点进行读数时,对检测结果的不利影响也远远小于现有的
    CRP检测试纸条。而对于比较例1和比较例2而言,在比标准检测时间3min更早或更晚的时间
    点进行读数时,得到的CRP浓度已远远偏离标准品的浓度,不再具有检测意义上的参考价
    值。

    由此可见,本发明试纸条可在0℃到40℃的温度范围下、在2-6分钟甚至更宽的反
    应时间范围内,实现精准的全程CRP浓度检测。本发明的试纸条在超出标准操作范围的温度
    和时间条件下,具有更加可靠、稳定的检测性能。

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    本文标题:用于检测CRP浓度的免疫层析试纸条及检测试剂盒.pdf
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