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    布鲁氏菌 抗体 检测 试纸
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    摘要
    申请专利号:

    CN201610987487.6

    申请日:

    2016.11.10

    公开号:

    CN106771208A

    公开日:

    2017.05.31

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/577申请日:20161110|||公开
    IPC分类号: G01N33/577 主分类号: G01N33/577
    申请人: 中国兽医药品监察所
    发明人: 丁家波; 冯宇; 朱良全; 蒋卉; 彭小薇; 王芳; 王楠; 毛开荣; 徐磊
    地址: 100081 北京市海淀区中关村南大街8号
    优先权:
    专利代理机构: 北京君智知识产权代理事务所(普通合伙) 11305 代理人: 郑明
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201610987487.6

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.06.23|||2017.05.31

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及一种布鲁氏菌抗体检测试纸条。本发明具有以下意义:(1)丰富了我国布鲁氏菌病诊断方法;(2)为我国布鲁氏菌病诊断提供了一种简便快捷、能对多种不同动物实施现场快速检测的新方法;(3)本试纸条克服了常规布鲁氏菌病诊断方法不能排除小肠结肠炎耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157抗血清对布鲁氏菌抗体的干扰,提高了布鲁氏菌病检测的特异性。

    权利要求书

    1.一种布鲁氏菌抗体检测试纸条,其特征在于该试纸条由布鲁氏菌抗体检测试纸条和
    塑料吸头组成;检测试纸条由PVC底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成,其中
    金标垫为胶体金标记的光滑型布鲁氏菌S2株脂多糖和胶体金标记的鼠源抗Flag标签的单
    克隆抗体、检测线为布鲁氏菌单克隆抗体3E4、质控线为羊抗鼠IgG抗体。
    2.如权利要求1所述一种布鲁氏菌抗体检测试纸条,其特征在于试纸条检测线使用了
    布鲁氏菌特异性单克隆抗体3E4,制备的布鲁氏菌单克隆抗体3E4细胞株已于2013年05月送
    交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微生物菌种保藏管理
    委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为CGMCCNO.7706;该单克隆抗体能够特异性识别布
    鲁氏菌LPS,有效排除小肠结肠炎耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157对布鲁氏菌病检测的干扰。
    3.如权利要求1所述一种布鲁氏菌抗体检测试纸条,其特征在于试纸条金标垫中用于
    检测布鲁氏菌抗体的为胶体金颗粒标记的光滑型布鲁氏菌S2株脂多糖,该脂多糖对常见的
    布鲁氏菌病原抗体均具有良好的特异性和敏感性。
    4.权利要求1所述的布鲁氏菌抗体检测试纸条的应用,其特征在于使用该试纸条能对
    猪、牛、羊布鲁氏菌进行现场快速检测。

    说明书

    布鲁氏菌抗体检测试纸条

    技术领域

    本发明涉及一种布鲁氏菌抗体检测试纸条,属生物制品检测技术领域。

    技术背景

    布鲁氏菌病(Brucellosis,简称布病)是由布鲁氏菌或称布鲁氏菌(Brucella)引
    起的以流产和发热为特征的人兽共患病,严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不
    但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害,更重要的是,人感染布鲁氏菌后,往往难以治
    愈,从而造成严重的公共卫生问题。因此在布鲁氏菌流行的国家,消除布病一直是公共卫生
    计划中最重要的目标之一。

    布病在世界存在已有久远的历史,人类对该病的研究认识逐步加深,诊断水平不
    断提高,随着动物布病的研究进展,动物布病血清学的检测方法不断改进和提高。传统的凝
    集试验(如:虎红抗原平板凝集试验、试管抗原凝集试验、乳环凝集试验)逐渐被敏感性高、
    特异性强的ELISA方法、荧光偏振试验(FPA)等新的检测技术所取代。

    凝集试验是布鲁氏菌病诊断的一种常用的方法,包括血清凝集实验、乳环沉淀试
    验和抗人免疫球蛋白试验,其中经典的标准试管凝集试验(STAT)、平板凝集试验(PAT),以
    上方法在发达国家已经基本停止使用,取而代之的是缓冲布鲁氏菌抗原凝集试验如虎红平
    板凝集试验(RBPT)?;⒑炱桨迥乖怯每乖粤己玫牟悸呈暇昃嘌?,灭活,离心
    收集菌体后用虎红染料染色后悬浮于乳酸缓冲液中制成,该方法灵敏度高,价格便宜,操作
    方便,检测快速,适于动物群体布鲁氏菌病的普查。在国际贸易中是牛、羊、猪布鲁氏菌病检
    测的指定试验,在我国也用于人布鲁氏菌病监测的初筛。乳环沉淀试验依然是乳牛布鲁氏
    菌监测的主要方法,该方法直接对牛乳进行检测,可以对奶牛群体进行筛检,该方法简便快
    速。

    在布鲁氏菌病血清学检验中一致认为补体结合试验(CFT)在特异性上优于其他方
    法,常被用来对试管凝集试验和虎红平板凝集试验检测为阳性或可疑的病例进行定性检
    测。补体结合试验一直被认为是最有效的布病诊断方法,至今尚没有一种诊断方法能取代
    补体结合试验在血清学诊断中的地位。但补体结合试验所需要的溶血素的制备困难,试验
    操作繁琐,难以在临床上普遍使用,而且由于猪体内的补体会干扰豚鼠补体的作用,导致敏
    感性下降。

    ELISA是一种与CFT效果相当的诊断方法,该方法操作方便,灵敏度高,特异性较
    好,一次可以完成大量样品的检测,既可以作为筛选试验应用于动物群体检疫,还可以作为
    确诊试验。ELISA不仅可以应用于血清抗体的检测,还可应用于乳样中抗体的检测。牛的布
    鲁氏菌病ELISA检测方法已是国际贸易中指定的检测方法之一,其他种布鲁氏菌的ELISA检
    测方法也是研究的热点。目前,用于布鲁氏菌病检测的ELISA有间接ELISA(iELISA)和竞争
    ELISA(cELISA)两种。专利申请人也已成功开发了上述两种试剂盒,并获得国家新兽药证书
    (2015新兽药证字67号,2016新兽药证字6号),其中动物布鲁氏菌病竞争ELISA抗体检测试
    剂盒已获得国家发明专利(专利号:ZL201310213811.5),牛布鲁氏菌间接ELISA抗体检测试
    剂盒已经申报国家发明专利(201510477116.9)。

    上述各种布病检测方法各有其自身的特点,但存在的共同缺陷是以上各种检验都
    必须在实验室内完成。一般需要先分离血清,然后按照各种方法的操作程序进行实验室检
    验。而免疫胶体金技术克服了上述缺陷,可以直接采血后,滴加到胶体金试纸条加样孔内,
    现场就能判定是否为布鲁氏菌感染。虽然已有相关胶体金发明专利的报道,如中国人民解
    放军军事医学科学院军事兽医研究所王兴龙等、吉林大学闫广谋等(申请号:
    CN200710055740.5,CN200710055741.X,CN200810051726.2)采用以重组的金黄色葡萄球菌
    A蛋白(SPA)作为金标抗体,由于SPA具有非特异性吸附IgG分子的能力,因此可用于对多种
    不同动物进行诊断,但对不同动物体内IgG吸附能力各不相同,因此对采用同一个试纸条对
    不同动物进行布病检测,其敏感性并不稳定。新疆石河子大学陈创夫等(申请号:
    CN201210254837.X)同样采用金黄色葡萄球菌A蛋白(SPA)作为金标抗体,只是体外表达的
    布鲁氏菌特异性蛋白(OMP31和BP26)替代布鲁氏菌LPS作为检测抗原,并不能从根本上解决
    对不同动物诊断的敏感性问题。杭州迪恩科技有限公司张明洲等(申请号:
    CN201310033074.0),采用布鲁氏菌菌体抗原作为质控线包被抗原,再利用一种抗红细胞的
    单克隆抗体作为竞争用的单抗,吸附干燥的胶体金蛋白(流动带),建立了夹心法检测牛布
    鲁氏菌抗原的检测试纸卡,由于布鲁氏菌与一些革兰氏阴性细菌,特别是耶尔森氏菌O9和
    大肠杆菌O157具有较强的菌体抗原相似性,而该专利中使用布鲁氏菌菌体抗原作为胶体金
    颗粒的吸附抗原,理论上其检测结果会存在一定的非特异性。

    申请人也于2015年采用抗牛IgG Fc端的单克隆抗体标记胶体金成功开发了牛布
    鲁氏菌胶体金抗体检测试纸条,以及采用抗羊IgG Fc端的单克隆抗体标记胶体金成功开发
    了羊布鲁氏菌胶体金抗体检测试纸条,并申请了国家发明专利(申请号分别为
    20151047774.8、201510477800.7)。上述两种试纸条均基于间接法原理开发而成,主要检测
    血清中IgG类抗体。相对间接法而言,采用针对布鲁氏菌特异性单克隆抗体开发的竞争法试
    纸条,不仅能对多种动物进行布病检测,而且由于单抗本身的特异性,以及能同时检测血清
    中的IgG和IgM类抗体,因此试纸条在敏感性和特异性方面具有更明显的优势。发明人依托
    自主制备的单抗,研发出一种敏感性和特异性均较好,可以同时检测牛羊布鲁氏菌病抗体,
    且价格低廉的国产布鲁氏菌抗体检测试纸条。

    本发明专利具有操作简单,结果快捷,易于判断和保存等优点,同时无需任何仪器
    设备,非常适合临床快速诊断。由于该试纸条既可检测牛,也可检测羊,特别是基层农村和
    小规模养殖场的布病检测。

    发明内容

    本发明的目的在于开发一种简便快捷、能对多种不同动物实施现场快速检测、且
    能排除小肠结肠炎耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157干扰的胶体金试纸条。

    本发明的技术方案

    1.一种布鲁氏菌抗体检测试纸条,其特征在于该试纸条由布鲁氏菌抗体检测试纸
    条和塑料吸头组成。检测试纸条由PVC底板、样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水垫组成。
    金标垫为胶体金标记的光滑型布鲁氏菌S2株脂多糖(LPS)和胶体金标记的鼠源抗Flag标签
    的单克隆抗体;检测线为布鲁氏菌单克隆抗体3E4;质控线为羊抗鼠IgG抗体。

    2.如权利要求1所述一种布鲁氏菌抗体检测试纸条,其特征在于试纸条检测线使
    用了布鲁氏菌特异性单克隆抗体3E4,制备的布鲁氏菌单克隆抗体3E4细胞株已于2013年05
    月送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所内中国微生物菌种保藏
    管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为CGMCCNO.7706;该单克隆抗体能够特异性识
    别布鲁氏菌LPS,有效排除小肠结肠炎耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157对布鲁氏菌病检测的
    干扰。

    3.如权利要求1所述一种布鲁氏菌抗体检测试纸条,其特征在于试纸条金标垫中
    用于检测布鲁氏菌抗体的为胶体金颗粒标记的光滑型布鲁氏菌S2株脂多糖(LPS),该LPS对
    常见的布鲁氏菌病原抗体均具有良好的特异性和敏感性。

    4.权利要求1所述的布鲁氏菌抗体检测试纸条的应用,其特征在于使用该试纸条
    能对猪、牛、羊布鲁氏菌进行现场快速检测。

    本发明具体实施方式

    1.选择猪种布鲁氏菌S2株(CVCC70502)作为试纸条LPS制备的生产菌种。

    S2是我国最广泛使用的疫苗株,该疫苗株免疫原性良好,是我国目前生产的三种
    布病疫苗株(S2株、A19株和M5株)中,毒力最弱、安全性最好的疫苗株。另外,我国布病试管
    凝集试验国家参照品、虎红平板凝集试验国家参照品、布病全乳环状凝集试验抗原国家参
    照品,以及同类布病诊断抗原,均采用S2株作为生产用菌种?;诳乖约吧锇踩治?,
    本试纸条生产抗原用菌种为猪种布鲁氏菌S2株(CVCC70502),由中国兽医药品监察所鉴定、
    保存和供应。

    2.选择布鲁氏菌单克隆抗体3E4作为试纸条的竞争抗体。

    单克隆抗体对抗原反应的特异性在很大程度上决定了本试剂盒的特异性和敏感
    性。对本试剂盒使用的单克隆抗体3E4特异性鉴定结果显示,该单抗(细胞培养上清或制备
    的腹水)与猪种布鲁氏菌S1330抗原、牛种布鲁氏菌A99、羊种布鲁氏菌16M抗原均发生凝集
    反应,与都柏林沙门氏菌不发生凝集反应,且与布鲁氏菌存在较强血清学交叉反应的小肠
    结肠炎耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157抗原均不发生凝集,这也是本试纸条能最终能鉴别诊
    断布鲁氏菌与小肠结肠炎耶尔森氏菌O9和大肠杆菌O157的根本原因。

    3.采用胶体金标记的Flag单抗作为试纸条免疫扩散系统有效性的指示。

    本研究制备的试纸条是基于竞争法建立的检测方法,其原理为在检测线上包埋抗
    布鲁氏菌LPS单克隆抗体,金标垫则喷有LPS胶体金溶液。样品加入后,由于吸水纸的虹吸作
    用,金标垫上的LPS胶体金溶液向检测线方向扩散,若待检样品不含布鲁氏菌抗体,LPS与检
    测线处包埋的单克隆抗体2C7发生反应,从而检测区(T)上出现紫红色条带,判为阴性。若待
    检样品中含有布鲁氏菌抗体,抗体将与LPS胶体金溶液发生反应,封闭LPS抗原位点,致使
    LPS无法与检测线上包被的单克隆抗体2C7发生反应,从而检测区(T)上不出现紫红色条带,
    从而判为阳性。为了确认免疫扩散系统的有效性(排除由于免疫扩散系统失效而导致的检
    测线无条带),基于竞争法制备的试纸条需要选择另外一套独立的抗原抗体系统来验证。为
    此,本研究对免疫扩散验证系统的抗原抗体进行选择。

    通过综合比较多种商品化单克隆抗体,申请人发现Sigma公司生产的Flag单抗效
    价高,背景低,价格低。此外,由于其包装为5ml,一支即可满足本研究制备一批试纸条的需
    求,从而避免了由于使用不同批次及不同包装抗体具有差异性而导致各试纸条质量不一
    致?;谕脑?,我们选择了Sigma公司生产的羊抗鼠IgG抗体作为质控线包被抗体,与
    鼠源Flag单抗构成对应的免疫扩散验证系统。

    4.对试纸条生产工艺进行多因素优化。

    在布鲁氏菌抗体检测试纸条制备过程中,发明人对各个反应条件进行了摸索和优
    化。对胶体金颗粒大小、胶体金标记最佳pH值、胶体金溶液最佳标记量、检测线抗体和质控
    线抗体包被浓度均作了比较试验,通过评价试验结果,最终确定当往100ml蒸馏水中加入
    1ml 1%氯金酸溶液和1.5ml 1%柠檬酸钠水溶液后,胶体金颗粒大小为40nm左右(40±
    4nm),符合研究要求;金标记最适pH值为7.5;胶体金溶液最佳标记量为每毫升胶体金溶液
    中加入LPS溶液(1mg/mL)14μL,每毫升胶体金加入Flag单克隆抗体10μg;检测线包被抗体
    (布鲁氏菌单克隆抗体3E4,竞争ELISA效价为1:20000)作1:200稀释,质控线包被抗体(羊抗
    鼠IgG抗体),浓度为0.5mg/ml。

    5.采用一定规模、背景清楚的阴性和阳性样本对试纸条的特异性和敏感性进行评
    价。

    (1)将近年间课题组收集的400余份田间样本,经虎红凝集试验初筛后,再用试管
    凝集试验和补体结合试验检测,共确定了143份(其中牛血清73份、羊血清70份)三种方法均
    检测为布病阳性的血清。将这143份血清采用3批试纸条进行检测,阳性率均为100%。由此
    确定本试纸条对田间样本的敏感性为100%。

    (2)将近年间课题组收集的400余份田间样本,经虎红凝集试验、试管凝集试验和
    补体结合试验检测,共确定了134份(其中牛血清71份、羊血清63份)用三种方法均检测为布
    病阴性的血清。将这134份血清用采用3批试纸条进行检测,阴性率均为99.25%。由此确定
    本试纸条对田间样本的特异性为99.25%。

    附图说明

    图1 LPS抗原特异性检查结果图图中显示:2条特异性PCR条带,大小分别为178bp
    和285bp。

    图2胶体金颗粒电镜照片(100 000×)

    图3免疫胶体金试纸条的组装示意图1为样品垫,2为金标垫,3为硝酸纤维素膜,4
    为吸水纸,5为检测线,6为质控线,7为PVC板。

    本发明微生物资源信息

    本发明所涉及的微生物为:猪种布鲁氏菌(BrucellaSuis)S2株(CVCC70502),来自
    中国兽医微生物菌种保藏管理中心,系猪种布鲁氏菌生物1型,是布鲁氏菌病弱毒活疫苗
    株。羊种布鲁氏菌(BrucellaMelitensis)M28株(CVCC70003),来自中国兽医微生物菌种保
    藏管理中心,系羊种布鲁氏菌生物1型,是布鲁氏菌病活疫苗效力评价检验用强毒参考株。
    两个菌株均由北京市海淀区中关村南大街8号中国兽医药品监察所中国兽医微生物菌种保
    藏管理中心鉴定、保管和供应(请见中国兽医药品监察所、中国兽医微生物菌种保藏管理中
    心编著,中国兽医菌种目录(第二版),中国农业科学技术出版社,2002年,p35、p32)。布鲁氏
    菌单克隆抗体3E4细胞株已于2013年05月送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院
    微生物研究所内中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为CGMCC
    No.7706(见中国专利ZL 201310213811.5)。

    本发明的积极意义

    本发明涉及一种布鲁氏菌抗体检测试纸条。本发明具有以下意义:(1)丰富了我国
    布鲁氏菌病诊断方法;(2)为我国布病诊断提供了一种简便快捷、能对多种不同动物实施现
    场快速检测的新方法;(3)本试纸条克服了常规布病诊断方法不能排除小肠结肠炎耶尔森
    氏菌O9和大肠杆菌O157抗血清对布鲁氏菌抗体的干扰,提高了布病检测的特异性。

    实施例

    以下实施例为进一步说明本发明,不对本发明构成限制。

    实施例1

    ——试纸条的制备

    1.试纸条LPS抗原的制备

    选取布鲁氏菌疫苗S2株作为抗原生产种子,将S2经TSA培养后,提取的LPS,经纯化
    和定量后,用于固定于胶体金试纸条的硝酸纤维素膜对应检测线的位置。

    (1)建立LPS抗原制备用布鲁氏菌S2猪的质量标准。

    1)菌落形态菌落边缘整齐、圆润,露滴状,斜光照射,逆光观察微带蓝色乳光。

    2)染色形态为球杆菌,单个散在,不形成芽孢和荚膜。大小在0.3~0.6μm之间。革
    兰氏染色为阴性,柯氏染色为红色。

    3)纯粹按现行《中国兽药典》附录进行,应纯粹。

    4)特异性

    ①血清学特异性以培养物制成抗原,与光滑型布鲁氏菌阳性血清应出现凝集,与
    粗糙型血清不出现凝集。

    ②PCR特异性合成如下4条引物,将其配成引物混合储存液,各引物浓度均为25μM。

    Feri:5’-GCGCCGCGAA GAACTTATC A A-3’21(序列1)

    Reri:5’-CGCCATGTTA GCGGCGGTGA -3’20(序列2)

    Fsuis:5’-GCGCGGTTTT CTGAAGGTTC AGG-3’23(序列3)

    RIS711:5’-TGCCGATCAC TTAAGGGCCT TCAT-3’24(序列4)

    模板:S2培养菌落或试剂盒提取的S2基因组DNA。

    PCR反应体系:50μL的反应体系中,含5μL 10×Buffer,8μL2.5mMdNTPs,混合引物
    储存液2μL,Taq酶2U,模板DNA 1μL(或挑取菌落少许)。

    PCR反应程序:95℃5min后,按94℃1min、60℃1.5min、72℃1.5min进行28个循环,
    最后72℃10min。

    结果:扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定,应出现2条特异性PCR条带,大
    小分别为178bp和285bp(见附图1)。

    2.确定标记LPS胶体金颗粒的大小

    (1)胶体金颗粒的制备取250ml圆底烧瓶,量取100ml蒸馏水并加1ml 1%氯金酸溶
    液,搅拌加热至煮沸。加入0.5ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml等不同体积1%柠檬酸钠水溶
    液至上述氯金酸水溶液中,搅拌混匀,并保持沸腾10min。10min后停止加热,待溶液冷却后,
    补加蒸馏水定容至100ml,此即胶体金溶液。将制备好的胶体金溶液置于2~8℃保存。用支
    持膜的镍网蘸取金标溶液,自然干燥后直接在透射电镜下观察,计算100个胶体金蛋白颗粒
    的平均直径,同时用1×PBS缓冲液(含1%BSA)将胶体金溶液作1:20稀释后测定OD520nm值。

    (2)胶体金颗粒大小的选择胶体金颗粒大小与柠檬酸钠的加入量成反比(表1)。加
    入1.5ml 1%柠檬酸钠于100ml 0.01%的氯金酸溶液中制备的胶体金颜色为酒红色,颗粒
    大小比较均一(电镜观察胶体金颗粒,如图2所示),符合要求。根据康熙雄主编的《免疫胶体
    金技术临床应用》的要求以及本实验室制备的实践经验表明,确认本研究中使用的胶体金
    颗粒平均直径约为40nm(40±4nm),胶体金溶液OD520nm在0.2~0.3之间。

    表1胶体金制备过程中柠檬酸三钠加入量与胶体金颗粒大小之间的关系



    3.确定胶体金试纸条的主要工艺确定

    (1)胶体金溶液最佳标记量的确定分别取待标记的光滑型布鲁氏菌S2株脂多糖和
    商品化Flag单抗(浓度均为1mg/ml)0μL、4μL、8μL、12μL、16μL、20μL加入1ml胶体金中,作用
    45分钟后加入100μL 10%NaCl,2~8℃静置2小时。酒红色LPS胶体金溶液未发生颜色改变
    的最少含量为12μL,因此,根据经验,在此基础上加20%,即每毫升胶体金溶液中含LPS 14μ
    L(1mg/mL)。酒红色商品化Flag单抗胶体金溶液未发生颜色变化的最少含量为8μL,即含商
    品化Flag单抗8μg,因此,在此基础上加20%,即每毫升胶体金溶液中含Flag单抗10μg。

    (2)检测线抗体和质控线抗体包被浓度的确定布鲁氏菌单克隆抗体3E4作为硝酸
    纤维素膜上的检测线包被抗体。将布鲁氏菌单抗腹水(竞争ELISA效价为1:20000)用划膜包
    被液(含有3%甲醇、1%蔗糖、0.05%叠氮钠的0.02M磷酸盐缓冲液,pH7.4)作1:100、1:200、
    1:400、1:800稀释,用点膜仪(Bio-Dot,USA)以0.1μl/mm喷到黏附在PVC板上硝酸纤维素膜
    的检测线(T线)的位置。随着抗体包被浓度的增加,检测线的颜色也逐渐加深,当布鲁氏菌
    单抗腹水用划膜包被液作1:200稀释,检测线颜色鲜艳、明显、易于判读,因此确定为检测线
    最佳抗体包被浓度。

    (3)硝酸纤维素膜上的质控线包被抗体浓度确定用划膜包被液将羊抗鼠IgG抗体
    稀释至0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL,用点膜仪以0.1μl/mm分别喷到黏附在
    PVC板上硝酸纤维素膜质控线(C线)位置。试验结果显示:随着抗体包被浓度的增加,质控线
    的颜色也逐渐加深,当羊抗鼠IgG抗体浓度为0.5mg/ml时,质控线颜色鲜艳、明显、易于判
    读,因此确定为质控线最佳抗体包被浓度。

    4.试纸条的组装

    (1)免疫胶体金系统的组装如图3所示,先将硝酸纤维素膜(3)粘贴到PVC板(7)的
    相应位置,然后将样品垫(1),金标垫(2),吸水纸(4)依次粘贴到PVC板(7)的相应位置。使金
    标垫(2)与硝酸纤维素膜(3)部分接触,约1~2mm;使吸水纸(4)与硝酸纤维素膜(3)部分接
    触,约2~3mm。用切条机将其切成3mm宽的小条,放置上下盖板内。

    (2)试纸条的组装用铝箔袋将1个试纸条,1支滴管及一包干燥剂密封包装成布鲁
    氏菌抗体检测试纸条;每10个试纸条和1份说明书,包装成1盒。

    实施例2

    ——布鲁氏菌抗体检测试纸条部分主要原辅料的来源及检验方法

    1.Flag单克隆抗体购自Sigma公司,对于不同批次的Flag单克隆抗体,在使用前需
    对其进行如下检验:

    (1)性状无色澄明液体。

    (2)供应商提供的产品分析报告对供应商提供的产品分析报告进行检查,核实其
    蛋白含量、克分子比、特异性等参数是否在规定范围内。

    (3)无菌检验按现行《中国兽药典》(中国兽药典委员会,中华人民共和国兽药典,
    二〇一〇年版三部,中国农业出版社,2011,以下称《中国兽药典》)附录进行检验,应无细菌
    生长。

    (4)检验报告见表2。

    表2鼠源Flag单克隆抗体检验报告


    2.羊抗鼠IgG抗体购自Sigma公司,对于不同批次的羊抗鼠IgG抗体,在使用前需对
    其进行如下检验:

    (1)性状淡黄色粉末。

    (2)供应商提供的产品分析报告对供应商提供的产品分析报告进行检查,核实其
    蛋白含量、克分子比、特异性等参数是否在规定范围内。

    (3)无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行检验,应无细菌生长。

    (4)检验报告见附表3。

    表3羊抗鼠IgG抗体检验报告


    实施例3

    ——竞争ELISA方法测定单抗(3E4)腹水效价测定

    1.腹水稀释将制备的腹水用1×PBS溶液作1:10000、1:15000、1:20000、1:25000、
    1:30000、1:35000和1:40000稀释。

    2.cELISA测定取抗原包被板(根据样品多少,可拆开分次使用),以1×洗涤液300μ
    l/孔洗板1次,弃去洗涤液。将稀释好的阳性对照血清和阴性对照血清分别加入到ELISA板
    中,50μl/孔,其中阳性及阴性对照血清各做2个重复。加样结束后,加入已稀释好的单克隆
    抗体,每孔50μl,振荡混匀5min。37℃孵育30min后,取出反应板,弃去反应液,每孔加入300μ
    l 1×洗涤液,洗涤3次后,甩干。将HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体用相应的稀释液作1:100稀
    释后,每孔加入100μl,37℃孵育30min后,同上方法洗涤3次,甩干。将底物溶液A和B按1:1
    (V/V)混合后,立即加入到ELISA反应板中,100μl/孔,室温避光显色15min后,每孔加50μl终
    止液终止反应。反应终止后,15分钟内用酶标仪测定OD450nm值。

    3.计算公式PI(抑制率)=(阴性对照OD450nm-阳性对照OD450nm)/阴性对照OD450nm×
    100%

    4.效价判定腹水各稀释度中使阳性对照血清的PI平均值≥90%的最高稀释度作
    为腹水的效价。

    实施例4

    ——试纸条的敏感性试验

    1.对梯度稀释的布鲁氏菌抗体质控阳性血清的灵敏度试验

    将布鲁氏菌抗体阳性血清进行2倍梯度稀释后,用3批实验室自制试纸条进行检
    测,确定该试纸条对梯度稀释的阳性对照血清的灵敏度,结果见表4。

    表4对梯度稀释的阳性对照血清的灵敏度检测


    注:布鲁氏菌抗体检测试纸条的判定标准为:仅质控区(C)出现一条紫红色条带,
    在检测区(T)内无紫红色条带出现,判为阳性(标为“P”);当质控区(C)和检测区(T)均出现
    紫红色条带时,判为阴性(标为“N”)。

    由表4可见,3批试纸条检测梯度稀释质控阳性血清的结果一致,均可检测至作1:
    64倍稀释的质控阳性血清。

    2.对已知阳性样本的敏感性试验

    采用3批布鲁氏菌抗体检测试纸条对143份布鲁氏菌抗体阳性血清进行检测,结果
    见表2。计算每批试纸条的敏感性,结果见表5。

    表5对已知阳性样本的敏感性检测







    注:1.布鲁氏菌抗体检测试纸条的判定标准为:仅质控区(C)出现一条紫红色条
    带,在检测区(T)内无紫红色条带出现,判为阳性(标为“P”);当质控区(C)和检测区(T)均出
    现紫红色条带时,判为阴性(标为“N”)。2.编号1~73为牛血清样本;74~143为羊血清样本。

    由表5可见,对于143份牛、羊布鲁氏菌抗体阳性血清,实验室制备的3批试纸条检
    验结果均为阳性。3批试纸条检测结果分析见表6。

    表6对已知阳性血清的敏感性分析



    表6表明,实验室制备的3批布鲁氏菌抗体检测试纸条对143份布病阳性样本的敏
    感性均为100%,表明试纸条敏感性较高,作为临床检测时不易出现漏检现象。

    序列表


    <110> 中国兽医药品监察所

    <120> 布鲁氏菌抗体检测试纸条

    <130>

    <160> 4

    <170> Patentin version 3.5


    <210> 1

    <211> 21

    <212> DNA

    <213> 人工序列

    <223> 对人工序列的描述:引物Feri

    <400> 1

    GCGCCGCGAA GAACTTATCA A 21(序列1)


    <210> 2

    <211> 20

    <212> DNA

    <213> 人工序列

    <223> 对人工序列的描述:引物Reri

    <400> 2

    CGCCATGTTA GCGGCGGTGA 20(序列2)


    <210> 3

    <211> 23

    <212> DNA

    <213> 人工序列

    <223> 对人工序列的描述:引物Fsuis

    <400> 3

    GCGCGGTTTT CTGAAGGTTC AGG 23(序列3)


    <210> 4

    <211> 24

    <212> DNA

    <213> 人工序列

    <223> 对人工序列的描述:引物RIS711

    <400> 4

    TGCCGATCAC TTAAGGGCCT TCAT 24(序列4)


    1

    关于本文
    本文标题:布鲁氏菌抗体检测试纸条.pdf
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