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    重庆时时彩怎么打好: 一种同时测定中草药或者保健品中五种黄酮的方法.pdf

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    一种 同时 测定 中草药 或者 保健品 中五种 黄酮 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201611262282.8

    申请日:

    2016.12.30

    公开号:

    CN106770781A

    公开日:

    2017.05.31

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 30/02申请日:20161230|||公开
    IPC分类号: G01N30/02; G01N30/06 主分类号: G01N30/02
    申请人: 浙江省中药研究所有限公司
    发明人: 沈晓霞; 孙健; 刘聪; 赵那; 吴加梁; 王志安; 沈宇峰
    地址: 310023 浙江省杭州市西溪路553号新凉亭
    优先权:
    专利代理机构: 杭州求是专利事务所有限公司 33200 代理人: 邱启旺
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201611262282.8

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.06.23|||2017.05.31

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种同时测定中草药或者保健品中五种黄酮的方法,本发明用甲醇提取干燥的固体药材或者保健品样品,利用高效液相色谱,以乙腈和0.5%(v/v)的磷酸为流动相,上样后梯度洗脱得到分离度良好的葛根素、二氢杨梅素、芦丁、槲皮素和山奈酚的色谱图,根据各黄酮的特征峰积分面积计算出原材料中五种黄酮的含量。本发明的方法尤其适用于快速检测保健品或中草药中极性差异较大黄酮的鉴定和定量,评价其药效物质含量。

    权利要求书

    1.一种同时测定中草药或者保健品中五种黄酮的方法,其特征在于,所述五类黄酮类
    物质是葛根素、二氢杨梅素、芦丁、槲皮素和山奈酚,所述方法包括以下步骤:
    (1)样品制备:保健品或中草药冷冻干燥后,经粉碎磨成粉末状,过80目筛;将粉末按质
    量体积比(g/mL)1:200加入甲醇中,摇动约20min后,超声处理约60min,3000g离心10min,上
    清液经0.45μm微孔滤膜过滤,得到样品,存于样品瓶中准备进样。
    (2)将步骤1制备好的样品用反相高效液相色谱分析,即可测定样品中葛根素、二氢杨
    梅素、芦丁、槲皮素、山奈酚的峰面积y1、y2、y3、y4、y5;采用的色谱柱为C18柱;进样体积10μL,
    流速1.0mL/min,柱温约30℃;检测波长:254nm和290nm;流动相:有机A相为乙腈;无机B相为
    含有体积分数为0.5%(v/v)的磷酸的水溶液;采用梯度洗脱,以有机A相在流动相中的体积
    含量计,洗脱程序为:0-10min,16%A-13%A;10-15min,13%A-15%A;15-20min,15%A-
    35%A;20-35min,35%A-45%A;35-43min,45%A-15%A。
    (3)获得样品中葛根素、二氢杨梅素、芦丁、槲皮素、山奈酚的质量体积浓度(mg/L):由
    式y1=39.977x1-1.251可得到样品中葛根素的质量体积浓度x1;由式y2=21.918x2+19.74可
    得到样品中二氢杨梅素的质量体积浓度x2;由式y3=19.398x3+12.15可得到样品中芦丁的
    质量体积浓度x3;由式y4=30.844x4-7.8948可得到样品中槲皮素的质量体积浓度x4;由式y5
    =35.457x5-12.72可得到样品中山奈酚的质量体积浓度x5。
    (4)获得中草药或者保健品中葛根素、二氢杨梅素、芦丁、槲皮素、山奈酚的质量含量
    (mg/g):葛根素的质量含量为0.2x1;二氢杨梅素的质量含量为0.2x2;芦丁的质量含量为
    0.2x3;槲皮素的质量含量为0.2x4;山奈酚的质量含量为0.2x5。

    说明书

    一种同时测定中草药或者保健品中五种黄酮的方法

    技术领域

    本发明涉及化学分析检测领域,尤其涉及一种利用HPLC同时检测五类极性差异较
    大黄酮类物质的方法。

    背景技术

    黄酮类物质是诸多保健品和药材的药效成分,葛根素、二氢杨梅素、芦丁、槲皮素
    和山奈酚等黄酮类物质为常见的黄酮类成分,广泛分布于中草药中。葛根素有增加脑血流、
    提高免疫、改善学习记忆、抗肿瘤、降血糖、解酒等作用;二氢杨梅素具有抗氧化、抗菌消炎、
    护肝、调节血糖血脂及对平滑肌等作用;芦丁具有降低毛细血管通透性和脆性,促进细胞增
    生和防止血细胞凝聚,抗炎、利尿、解痉、镇咳、降血脂等方面的作用;槲皮素具有抗氧化、抗
    炎、抗过敏、抗菌、抗病毒,清除体内自由基、抑制恶性肿瘤生长和转移等作用;山奈酚具抗
    氧化、抗炎、抑制肿瘤生长及?;じ蜗赴茸饔?。随着黄酮生理功效研究的深入,诸多保健
    品加入了含有保健功能的黄酮的中草药,而这些黄酮的含量也成为评价保健品有效成分的
    检测指标。

    然而不同黄酮化合物极性差异较大,这样就导致同时检测极性差异较大的多种黄
    酮用时过长影响检测效率。另外,天然药材中常存在类似结构的黄酮,在用一种洗脱体系分
    离某一类黄酮时会导致另外一类黄酮不易分离。因此,建立一种快速、准确的分析测定多种
    极性差异较大的黄酮类成分的方法,对含多种黄酮的保健品和中药材的品质控制及科学评
    价具有重要意义。

    发明内容

    本发明的目的在于针对现有技术的不足,提供一种利用高效液相色谱同时检测多
    种极性黄酮的方法,该方法简单,精确度高,重现性好,可为科学评价和有效控制含上述五
    类黄酮的保健品和中草药的内在质量提供可靠依据。

    本发明的目的是通过以下技术方案来实现的,一种同时测定中草药或者保健品中
    五种黄酮的方法,所述五类黄酮类物质是葛根素、二氢杨梅素、芦丁、槲皮素和山奈酚,所述
    方法包括以下步骤:

    (1)样品制备:保健品或中草药冷冻干燥后,经粉碎磨成粉末状,过80目筛;将粉末
    按质量体积比(g/mL)1:200加入甲醇中,摇动20min后,超声处理60min,3000g离心10min,上
    清液经0.45μm微孔滤膜过滤,得到样品,存于样品瓶中准备进样;

    (2)将步骤1制备好的样品用反相高效液相色谱分析,即可测定样品中葛根素、二
    氢杨梅素、芦丁、槲皮素、山奈酚的峰面积y1、y2、y3、y4、y5;采用的色谱柱为C18柱;进样体积
    10μL,流速1.0mL/min,柱温30℃;检测波长:254nm和290nm;流动相:有机A相为乙腈;无机B
    相为含有体积分数为0.5%(v/v)的磷酸的水溶液;采用梯度洗脱,以有机A相在流动相中的
    体积含量计,洗脱程序为:0-10min,16%A-13%A;10-15min,13%A-15%A;15-20min,15%
    A-35%A;20-35min,35%A-45%A;35-43min,45%A-15%A;

    (3)获得样品中葛根素、二氢杨梅素、芦丁、槲皮素、山奈酚的质量体积浓度(mg/
    L):由式y1=39.977x1-1.251可得到样品中葛根素的质量体积浓度x1;由式y2=21.918x2+
    19.74可得到样品中二氢杨梅素的质量体积浓度x2;由式y3=19.398x3+12.15可得到样品中
    芦丁的质量体积浓度x3;由式y4=30.844x4-7.8948可得到样品中槲皮素的质量体积浓度
    x4;由式y5=35.457x5-12.72可得到样品中山奈酚的质量体积浓度x5;

    (4)获得中草药或者保健品中葛根素、二氢杨梅素、芦丁、槲皮素、山奈酚的质量含
    量(mg/g):葛根素的质量含量为0.2x1;二氢杨梅素的质量含量为0.2x2;芦丁的质量含量为
    0.2x3;槲皮素的质量含量为0.2x4;山奈酚的质量含量为0.2x5。

    本发明的有益效果是,本发明用甲醇提取干燥的固体药材或者保健品样品,利用
    高效液相色谱,以乙腈和0.5%(v/v)的磷酸为流动相,上样后梯度洗脱得到分离度良好的
    葛根素、二氢杨梅素、芦丁、槲皮素和山奈酚的色谱图,根据各黄酮的特征峰积分面积计算
    出原材料中五种黄酮的含量。本发明的方法尤其适用于快速检测保健品或中草药中极性差
    异较大黄酮的鉴定和定量,评价其药效物质含量。本发明提供的检测方法可将保健品和中
    药材中的葛根素、二氢杨梅素、芦丁、槲皮素和山奈酚等黄酮类物质一次性分离开,操作简
    单、准确可靠,节省时间。

    附图说明

    图1是黄酮标准样品色谱图;其中,检测波长为245nm,峰1,葛根素;峰2,二氢杨梅
    素;峰3,芦??;峰4,槲皮素;峰5,山奈酚;

    图2是黄酮标准样品色谱图;其中,检测波长为290nm,峰1,葛根素;峰2,二氢杨梅
    素;峰3,芦??;峰4,槲皮素;峰5,山奈酚;

    图3是保健品提取物样品色谱图;其中,检测波长为245nm,峰1,葛根素;峰2,二氢
    杨梅素;峰3,芦??;峰4,槲皮素。

    图4是保健品提取物样品色谱图;其中,检测波长为290nm;峰1,葛根素;峰2,二氢
    杨梅素;峰3,芦??;峰4,槲皮素。

    具体实施方式

    下面根据实施例详细描述本发明,本发明的目的和效果将变得更加明显。

    实施例1、5种黄酮类物质的标样定性分离检测

    1、样品制备:配制二氢杨梅素75.8μg/mL、山奈酚66μg/mL、葛根素34μg/mL、槲皮素
    88.4μg/mL、芦丁38.6μg/mL的混合液;

    2、将步骤1制备好的样品用反相高效液相色谱分析,分析条件如下:

    色谱柱:ZorbaxEclipseXDB-C18;

    进样体积10μL,流速1.0mL/min,柱温30℃;

    检测波长:254nm和290nm;

    流动相:有机A相为乙腈;无机B相为含有体积分数为0.5%(v/v)的磷酸的水溶液;
    采用梯度洗脱,洗脱程序为:

    0-10min,16%A-13%A;10-15min,13%A-15%A;15-20min,15%A-35%A;20-
    35min,35%A-45%A;35-43min,45%A-15%A。

    所得标样色谱图如图1和图2所示:峰1,葛根素;峰2,二氢杨梅素;峰3,芦??;峰4,
    槲皮素;峰5,山奈酚。不同黄酮依出峰时间的不同而区分,其中二氢杨梅素在254nm波长无
    吸收峰,在290nm波长有吸收峰,葛根素极性最大出峰时间最早,其它三种黄酮对应特定的
    出峰时间。该体系流动相洗脱体系中极性组分先升再降使得非目标检测物质快速洗脱,相
    比已有洗脱体系,检测时间减少。通过控制流动相梯度洗脱分离极性差异较大的黄酮,可以
    很好的分离多种极性差异较大的黄酮。

    实施例2、检测方法的精密度、稳定性、重现性和加样回收率评估

    精密度试验

    分别取6.8μg/mL、13.6μg/mL、20.4μg/mL、27.2μg/mL、34μg/mL葛根素对照品按对
    照品按10μL进样量各重复进样2次,记录葛根素标准液的峰面积,计算相对标准偏差(RSD),
    不同进样量的相对标准偏差分别为0.05%、0.13%、0.26%、0.00%、0.42%。

    分别取6.96μg/mL、13.92μg/mL、20.88μg/mL、27.84μg/mL、34.8μg/mL二氢杨梅素
    对照品按10μL进样量各重复进样3次,记录二氢杨梅素标准液的峰面积,计算相对标准偏差
    (RSD),不同进样量的相对标准偏差分别为0.35%、0.38%、0.06%、0.04%、0.38%。

    分别取10.56μg/mL、21.12μg/mL、31.68μg/mL、42.24μg/mL芦丁对照品按对照品按
    10μL进样量各重复进样3次,记录芦丁标准液的峰面积,计算相对标准偏差(RSD),不同进样
    量的相对标准偏差分别为1.73%、0.17%、0.18%、0.18%。

    分别取8.96μg/mL、17.92μg/mL、26.88μg/mL、35.84μg/mL、44.8μg/mL、89.6μg/mL
    槲皮素对照品按对照品按10μL进样量各重复进样3次,记录槲皮素标准液的峰面积,计算相
    对标准偏差(RSD),不同进样量的相对标准偏差分别为1.67%、0.07%、0.12%、0.08%、
    0.11%、0.13%。

    分别取7.92μg/mL、15.84μg/mL、23.76μg/mL、31.68μg/mL、39.6μg/mL、79.2μg/mL
    山奈酚对照品按对照品按10μL进样量各重复进样3次,记录山奈酚标准液的峰面积,计算相
    对标准偏差(RSD),不同进样量的相对标准偏差分别为1.75%、0.23%、0.15%、0.01%、
    0.09%、0.09%。

    各标准物质的检测的峰面积标准偏差均小于0.5%,说明该方法精密度好,可采用
    最少的重复测定次数得到准确的结果。

    重复性试验

    在同一供试品溶液中精密量取1mL溶液6份,分别以10μL进样,并记录样品中二氢
    杨梅素的峰面积,计算RSD为0.39%。

    在同一供试品溶液中精密量取1mL溶液6份,分别以10μL进样,并记录样品中葛根
    素的峰面积,计算RSD为0.13%。

    在同一供试品溶液中精密量取1mL溶液6份,分别以10μL进样,并记录样品中芦丁
    的峰面积,计算RSD为0.32%。

    在同一供试品溶液中精密量取1mL溶液6份,分别以10μL进样,并记录样品中槲皮
    素的峰面积,计算RSD为0.22%。

    在同一供试品溶液中精密量取1mL溶液6份,分别以10μL进样,并记录样品中山奈
    酚的峰面积,计算RSD为0.28%。

    各标准物质的等体积、等浓度样品六次进样检测的峰面积标准偏差均小于0.5%,
    说明该方法重复性好,可采用最少的重复测定次数得到准确的结果。

    稳定性

    在供试品中精密量取1mL溶液,分别在0、2.5、5、7.5、10、12.5、15h下测定,并记录
    样品中二氢杨梅素的峰面积,计算RSD为0.49%。

    在供试品中精密量取1mL溶液,分别在0、2.5、5、7.5、10、12.5、15h下测定,并记录
    样品中葛根素的峰面积,计算RSD为0.22%。

    在供试品中精密量取1mL溶液,分别在0、2.5、5、7.5、10、12.5、15h下测定,并记录
    样品中芦丁的峰面积,计算RSD为0.46%。

    在供试品中精密量取1mL溶液,分别在0、2.5、5、7.5、10、12.5、15h下测定,并记录
    样品中槲皮素的峰面积,计算RSD为0.38%。

    在供试品中精密量取1mL溶液,分别在0、2.5、5、7.5、10、12.5、15h下测定,并记录
    样品中山奈酚的峰面积,计算RSD为0.25%。

    各标准物质的等体积、浓度样品七次进样检测的不同进样时间峰面积标准偏差均
    小于0.5%,说明该方法稳定性好,不同时间测得数据稳定准确。

    加样回收率

    取测得含85.112μg/mL供试品溶液1.25mL,精密量取各5份,置于10mL容量瓶中,再
    精密量取1.74mg/mL二氢杨梅素标准品0.07mL,各五份,分别置于上述容量瓶中,以甲醇定
    容至10mL,超声混匀,以0.45μm针筒滤膜过滤,再进行色谱测定,并记录样品中二氢杨梅素
    的峰面积,计算平均回收率95.78±0.01%。

    取测得含130.4μg/mL供试品溶液0.5mL,精密量取各5份,置于10mL容量瓶中,再精
    密量取34μg/mL葛根素标准品2mL,各五份,分别置于上述容量瓶中,以甲醇定容至10mL,超
    声混匀,以0.45μm针筒滤膜过滤,再进行色谱测定,并记录样品中二氢杨梅素的峰面积,计
    算平均回收率100.05±0.35%。

    取测得含116.33μg/mL供试品溶液0.5mL,精密量取各5份,置于10mL容量瓶中,再
    精密量取52.8μg/mL芦丁标准品1mL,各五份,分别置于上述容量瓶中,以甲醇定容至10mL,
    超声混匀,以0.45μm针筒滤膜过滤,再进行色谱测定,并记录样品中芦丁的峰面积,计算平
    均回收率99.99±0.62%。

    取测得含82.64μg/mL供试品溶液0.5mL,精密量取各5份,置于10mL容量瓶中,再精
    密量取39.6μg/mL山奈酚标准品1mL,各五份,分别置于上述容量瓶中,以甲醇定容至10mL,
    超声混匀,以0.45μm针筒滤膜过滤,再进行色谱测定,并记录样品中芦丁的峰面积,计算平
    均回收率99.98±0.43%。

    取测得含99.27μg/mL供试品溶液0.50mL,精密量取各5份,置于10mL容量瓶中,再
    精密量取44.80μg/mL槲皮素标准品1.10mL,各五份,分别置于上述容量瓶中,以甲醇定容至
    10mL,超声混匀,以0.45μm针筒滤膜过滤,再进行色谱测定,并记录样品中槲皮素的峰面积,
    计算平均回收率100.41±0.40%。

    回收率实验表明各个目标检物质回收率标准误在0.5%以内,检测物在线性范围
    内不存在超载,该实验方法系统误差小。

    实施例3、标准曲线的建立

    按实施例1的色谱条件将所得各浓度标准品溶液经0.45μm有机微孔滤膜过滤后,
    进样精密吸取混合标准品溶液0、2、4、6、8、10μL进行测定,每个样品重复3次,得到梯度含量
    标准物质对应的峰面积,具体数据见表2。以峰面积为纵坐标(y),质量浓度(x)为横坐标,绘
    制标准曲线,计算标准曲线的回归方程及相关系数,结果见表1。

    表1:葛根素、二氢杨梅素、芦丁、山奈酚和槲皮素的线性回归方程

    化合物名称
    回归方程
    相关系数(R2)
    线性范围(μg/mL)
    葛根素
    y=39.977x-1.251
    0.9995
    6.80-37.00
    二氢杨梅素
    y=21.918x+19.74
    0.9947
    6.96-27.84
    芦丁
    y=19.398x+12.15
    0.9986
    10.56-42.24
    山奈酚
    y=35.457x-12.72
    1
    7.92-79.20
    槲皮素
    y=30.844x-7.89
    1
    8.96-89.60

    表2:葛根素、二氢杨梅素、芦丁、山奈酚和槲皮素不同进样量的峰面积



    基于本方法建立的检测体系,构建了5种黄酮的定量标准曲线,标准曲线在线性范
    围内的线性关系良好,相关系数均大于99.9%,可以精确定量样品中的相应黄酮含量。本发
    明采用高极性洗脱液比例洗脱,加快洗脱时间;极性洗脱液浓度先升后降的梯度洗脱法,可
    同时分离保健品中极性差异较大但结构相似的葛根素、二氢杨梅素、芦丁、槲皮素和山奈酚
    及其近似物五类黄酮类物质。

    实施例4、某保健品中黄酮类物质的检测

    1、样品制备:样品制备:保健品颗?;蛑胁菀├涠掣稍锖?,经粉碎磨成粉末状,过
    80目筛。称量0.5g粉末加入100mL甲醇溶液摇动20min后,超声处理60min,3000×g离心
    10min,上清液,取1mL稀释10倍,经0.45μm微孔滤膜过滤,存于样品瓶中准备进样;

    2、将步骤1制备好的样品用反相高效液相色谱分析,分析条件如下:

    色谱柱:ZorbaxEclipseXDB-C18;

    进样体积10μL,流速1.0mL/min,柱温30℃;

    检测波长:254nm和290nm;

    流动相:有机A相为乙腈;无机B相为含有体积分数为0.5%(v/v)的磷酸的水溶液;
    采用梯度洗脱,洗脱程序为:

    0-10min,16%A-13%A;10-15min,13%A-15%A;15-20min,15%A-35%A;20-
    35min,35%A-45%A;35-43min,45%A-15%A。

    所得标样色谱图如图3和图4所示:峰1,葛根素;峰2,二氢杨梅素;峰3,芦??;峰4,
    槲皮素。

    葛根素峰面积为1461.94397,计算可得葛根素浓度为36.60μg/mL,按样品制备比
    例换算后得出,每克保健品中含73.20mg葛根素。

    二氢杨梅素峰面积为668.07550,计算进样浓度为29.58μg/mL,按样品制备比例换
    算后得出,每克保健品中含59.16mg二氢杨梅素。

    芦丁峰面积为268.20365,带入实施例3中的标准曲线,计算芦丁浓度为13.20μg/
    mL,按样品制备比例换算后得出每克保健品中含26.40mg芦丁。

    槲皮素峰面积为337.14377,带入实施例3中的标准曲线,计算为11.19μg/mL,按样
    品制备比例换算后得出每克保健品中含22.37mg槲皮素。

    山奈酚峰面积为282.10318,带入实施例3中的标准曲线,计算为8.56μg/mL,按样
    品制备比例换算后得出每克保健品中含17.11mg山奈酚。

    通过该方法一次性快速的分离了5种极性差异较大的黄酮并进行了精确定量,快
    速准确的定量了保健品有成分的含量。

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    本文标题:一种同时测定中草药或者保健品中五种黄酮的方法.pdf
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