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    重庆时时彩开奖视频在哪看: 一种检测D二聚体斑点金渗滤试剂盒及定量检测方法.pdf

    关 键 词:
    一种 检测 二聚体 斑点 渗滤 试剂盒 定量 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201611094832.X

    申请日:

    2016.12.02

    公开号:

    CN106771145A

    公开日:

    2017.05.31

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/543申请日:20161202|||公开
    IPC分类号: G01N33/543; G01N33/558 主分类号: G01N33/543
    申请人: 广东优尼德生物科技有限公司
    发明人: 刘志文; 夏宣喜; 梁伟业; 赖华
    地址: 523080 广东省东莞市松山湖高新区桃园路1号莞台生物技术合作中心3栋4楼
    优先权: 2016.08.23 CN 2016107073623; 2016.10.18 CN 2016109110260
    专利代理机构: 广东卓建律师事务所 44305 代理人: 王今刚
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201611094832.X

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2018.10.16|||2017.05.31

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明提供一种检测D??二聚体斑点金渗滤试剂盒及其定量检测方法,试剂盒包括pH值为6.7的预封闭液、pH值为6.2的洗涤液、胶体金标记D??二聚体抗体、D??二聚体层析器和定标卡;所述预封闭液包括Triton??100和硼酸盐缓冲液溶液;所述洗涤液包括牛血清白蛋白和硼酸盐缓冲液溶液。本发明采用硝酸纤维素膜为固相载体,以吸附在硝酸纤维素上的抗体为固相,以人血中抗原以及抗体标记胶体金为液相,当被金颗粒标记的抗体与相应的抗原配体结合,金颗粒在抗体配体位点大量聚集时,便形成肉眼可见的红色斑点。本发明具有检测时间短,精密度好,对仪器和环境的要求较低,便于临床推广应用等优点。

    权利要求书

    1.一种检测D-二聚体斑点免疫金渗滤试剂盒,其特征在于,包括:
    pH值为6.7的预封闭液、pH值为6.2的洗涤液、胶体金标记D-二聚体抗体、D-二聚体层析
    器和定标卡;所述预封闭液包括Triton-100和硼酸盐缓冲液溶液;所述洗涤液包括牛血清
    白蛋白和硼酸盐缓冲液溶液。
    2.根据权利要求1所述的检测D-二聚体斑点免疫金渗滤试剂盒,其特征在于,所述预封
    闭液中Triton-100的浓度为0.6~10%,硼酸盐缓冲液溶液的浓度为0.5~10mol/L;所述洗
    涤液中牛血清白蛋白的浓度为0.6~10%,硼酸盐缓冲液溶液的浓度为0.5~10mol/L。
    3.根据权利要求1所述的检测D-二聚体斑点免疫金渗滤试剂盒,其特征在于,所述硼酸
    盐缓冲液溶液由以下原料配制:Na2B4O7·10H2O 1.0-3.0重量份、H3BO3 0.5-1.5重量份、
    NaCl 4重量份、KCl 0.1重量份、蒸馏水800ml重量份、牛血清白蛋白5重量份。
    4.根据权利要求1所述的检测D-二聚体斑点免疫金渗滤试剂盒,其特征在于,所述胶体
    金标记D-二聚体抗体按照如下方法制备:
    先将质量份数为3%的氯金酸与双蒸水按体积1∶86配成A液;将质量份数为3%柠檬酸
    三钠、质量份数为2.8%鞣酸、质量份数为50mM K2CO3与双蒸水按体积比6∶0.05~0.98∶0.05
    ~0.98∶16.04~18.99配成B液;再将所述A液加热到62~69℃,B液加热到55~58℃,搅拌A
    液,快速加入B液,继续搅拌3分钟,在5~9分钟内加热至沸腾,制成胶体金液;
    利用0.5M K2CO3调整所述胶体金液pH值为7.0~7.5;
    将D-二聚体抗体原液在2℃下以10000~13000r/min速度离心40分钟,吸取上清液;将
    该抗体装入透析袋,用双蒸水透析去除盐分后,装瓶冷冻,得到D-二聚体抗体;
    将所述D-二聚体抗体缓慢加入胶体金液中进行包被,所述D-二聚体抗体与胶体金液的
    质量体积比为0.31~0.39mg:110ml,搅拌25分钟后,依次加入20~30%迭氮钠和1~10%牛
    血清白蛋白,所述迭氮钠和牛血清白蛋白与所述胶体金液的体积比为500μl:100μl:100ml,
    搅匀后在4.1~5.0℃,以7000r/min速度下离心20分钟,去除上清液,沉淀物即为胶体金标
    记D-二聚体胶体。
    5.根据权利要求4所述的检测D-二聚体斑点免疫金渗滤试剂盒,其特征在于,所述柠檬
    酸三钠、鞣酸、K2C03、与双蒸水的体积比为6:1.2:1.2:19;所述胶体金液中形成直径为7.8<
    D<9.8nm的胶体金颗粒。
    6.根据权利要求1所述的检测D-二聚体斑点免疫金渗滤试剂盒,其特征在于,所述D-二
    聚体层析器内设置有直径为3.5cm的反应盒,所述反应盒包括盒底和盒盖两部分,所述盒盖
    顶面中央设置有一个上表面直径为0.8cm,下表面直径为0.4cm的小圆孔;所述反应盒内垫
    满吸水材料,在小圆孔下方和吸水材料上方之间放置一张1.5×1.5cm的包被D-二聚体抗体
    的硝酸纤维素膜。
    7.根据权利要求6所述的检测D-二聚体斑点免疫金渗滤试剂盒,其特征在于,所述包被
    D-二聚体抗体的硝酸纤维素膜按照以下步骤制备:
    将所述D-二聚体抗体原液在2℃下以10000~13000r/min速度离心40分钟,吸取上清
    液;将所述抗体装入透析袋,用双蒸水透析去除盐分后,超滤浓缩后装瓶冷冻,得到D-二聚
    体抗体;
    用硼酸盐缓冲液溶液稀释上述D-二聚体抗体,得到1.0mg/ml为包被液;
    将所述包被液滴加至裁切好的硝酸纤维素膜上,每张膜片0.025ml,将膜片置于烘箱中
    干燥后即制成包被有D-二聚体抗体的硝酸纤维素膜。
    8.根据权利要求1所述的检测D-二聚体斑点免疫金渗滤试剂盒,其特征在于,所述定标
    卡为D-二聚体梯度质量浓度溶液所检测颜色相对应的检测信号值。
    9.根据权利要求8所述的检测D-二聚体斑点免疫金渗滤试剂盒,其特征在于,所述梯度
    质量浓度分别为0.1、0.3、1、2.5、5、10mg/L。
    10.一种检测D-二聚体斑点免疫金渗滤试剂盒的定量检测方法,其特征在于,包括以下
    步骤:
    采集血样5.1~10ml,室温放置15min-2h,以4000r/min速度离心20min,吸取上清液将
    血样混匀,得到待测样本;
    利用移液器准确吸取预封闭液,点在反应盒圆孔内硝酸纤维素膜面上;
    待预封闭液渗入后,用移液器准确吸取检测样本,点在反应盒圆孔内硝酸纤维素膜面
    上;
    待检测样本渗入后,再向反应盒膜面滴加胶体金标记D-二聚体抗体;所述胶体金标记
    D-二聚体抗体与所述检测样本的体积比为1:1.5;
    待D-二聚体抗体标记胶体金渗入后,再向反应盒膜面上滴加洗涤液;所述洗涤液与所
    述检测样本的体积比为1:1.5;
    观察反应盒膜面,待洗涤液完全渗入膜面后,检测D-二聚体层析器信号值,通过仪器结
    合定标卡信息计算检测样本D-二聚体浓度,可定量判定其质量浓度。

    说明书

    一种检测D-二聚体斑点金渗滤试剂盒及定量检测方法

    技术领域

    本发明属于医学检验领域,尤其涉及一种检测D-二聚体(D-Dimer)斑点金渗滤试
    剂盒及其定量检测方法。

    背景技术

    D-二聚体是纤维蛋白单体经活化因子XIII交联后,再经纤溶酶水解所产生的一种
    特异性降解产物,是一个特异性的纤溶过程标记物。D-二聚体来源于纤溶酶溶解的交联纤
    维蛋白凝块。

    在生理状态下,机体保持着凝血与纤溶动态平衡,以保证纤维蛋白及时形成和清
    除,而人体正常D二聚体的水平一般在200μg/l以下,如果体内凝血和纤溶系统双重激活,D
    二聚体水平就会升高,因此D二聚体可以作为体内高凝状态和纤溶亢进的分子标志物之一。
    D二聚体的特异性反映的是有凝血和纤溶过程的这一类疾病的共同病理特点,因此在临床
    应用十分广泛。D二聚体作为测定纤溶系统的主要因子,对于诊断与治疗纤溶系统疾病及与
    纤溶系统有关的疾病以及溶栓治疗检测有着重要的意义,因此D二聚体是深静脉血栓
    (DVT),肺栓塞(PE),弥散性血管内凝血(DIC)的关键指标。由此可见,血液中D二聚体含量测
    定对血栓性疾病的早期诊断、病程监测以及对溶栓药物的治疗监测等都具有重要的临床意
    义。

    D-二聚体检测技术主要有乳胶凝集法、免疫比浊法、胶体金法、免疫荧光法、磁珠
    免疫法等。乳胶凝集法测量D-二聚体主要为定性,不能够准确定量样本中的D-二聚体浓度。
    免疫比浊法相对操作较为繁琐且在高浓度抗原存在的情况下易出现钩状效应,从而影响测
    量的结果。胶体金法测试时间较长,精密度较差,且容易受环境条件的影响。免疫荧光和磁
    珠免疫法则对仪器的要求较高,不便于临床推广和大范围的使用。

    发明内容

    现有的金标免疫检测在定性检测应用较为广泛,本发明提供一种检测D-二聚体
    (D-Dimer)斑点免疫金渗滤试剂盒定量检测方法,斑点免疫金渗滤法是让待测样本垂直渗
    滤过微孔膜(例如:硝酸纤维素膜),被膜上包被的捕获探针捕获,再以同样方式让胶体金标
    探针渗滤过微孔膜,与被捕获的配体结合后聚集形成肉眼可见的红色斑点。

    本发明提供了一种检测D-二聚体(D-Dimer)斑点免疫金渗滤试剂盒,包括pH值为
    6.7的预封闭液、pH值为6.2的洗涤液、胶体金标记D-二聚体抗体、D-二聚体层析器和定标
    卡;所述预封闭液包括Triton-100和硼酸盐缓冲液溶液;所述洗涤液包括牛血清白蛋白和
    硼酸盐缓冲液溶液。

    优选的,所述预封闭液中Triton-100的浓度为0.6~10%,硼酸盐缓冲液溶液的浓
    度为0.5~10mol/L;所述洗涤液中牛血清白蛋白的浓度为0.6~10%,硼酸盐缓冲液溶液的
    浓度为0.5~10mol/L。

    优选的,所述硼酸盐缓冲液溶液由以下原料配制:Na2B4O7·10H2O 1.0-3.0重量
    份、H3BO3 0.5-1.5重量份、NaCl 4重量份、KCl 0.1重量份、蒸馏水800ml重量份、牛血清白
    蛋白5重量份。

    优选的,所述胶体金标记D-二聚体抗体按照如下方法制备:

    先将质量份数为3%的氯金酸与双蒸水按体积1∶86配成A液;将质量份数为3%柠
    檬酸三钠、质量份数为2.8%鞣酸、质量份数为40mM K2CO3与双蒸水按体积比6∶0.05~0.98∶
    0.05~0.98∶16.04~18.99配成B液;再将所述A液加热到62~69℃,B液加热到55~58℃,搅
    拌A液,快速加入B液,继续搅拌3分钟,在5~9分钟内加热至沸腾,制成胶体金液;

    利用0.5M K2CO3调整所述胶体金液pH值为7.0~7.5;

    将D-二聚体抗体原液在2℃下以10000~13000r/min速度离心40分钟,吸取上清
    液;将该抗体装入透析袋,用双蒸水透析去除盐分后,装瓶冷冻,得到D-二聚体抗体;

    将所述D-二聚体抗体缓慢加入胶体金液中进行包被,所述D-二聚体抗体与胶体金
    液的质量体积比为0.31~0.39mg:110ml,搅拌25分钟后,依次加入20~30%迭氮钠和1~
    10%牛血清白蛋白,所述迭氮钠和牛血清白蛋白与所述胶体金液的体积比为500μl:100μl:
    100ml,搅匀后在4.1~5.0℃,以7000r/min速度下离心20分钟,去除上清液,沉淀物即为胶
    体金标记D-二聚体胶体。

    优选的,所述柠檬酸三钠、鞣酸、K2C03与双蒸水的体积比为6:1.2:1.2:19;所述胶
    体金液中形成直径为7.8<D<9.8nm的胶体金颗粒。所述胶体金颗粒直径为6~16nm的,该
    胶体金液颜色由黑→蓝→紫→红色时即成。

    优选的,所述D-二聚体层析器内设置有直径为3.5cm的反应盒,所述反应盒包括盒
    底和盒盖两部分,所述盒盖顶面中央设置有一个上表面直径为0.8cm,下表面直径为0.4cm
    的小圆孔;所述反应盒内垫满吸水材料,在小圆孔下方和吸水材料上方之间放置一张1.5×
    1.5cm的包被D-二聚体抗体的硝酸纤维素膜。

    优选的,所述包被D-二聚体抗体的硝酸纤维素膜按照以下步骤制备:

    将所述D-二聚体抗体原液在2℃下以10000~13000r/min速度离心40分钟,吸取上
    清液;将所述抗体装入透析袋,用双蒸水透析去除盐分后,超滤浓缩后装瓶冷冻,得到D-二
    聚体抗体;

    用硼酸盐缓冲液溶液稀释上述D-二聚体抗体,得到1.0mg/ml的包被液;

    将所述包被液滴加至裁切好的硝酸纤维素膜上,每张膜片0.025ml,将膜片置于烘
    箱中干燥后即制成包被有D-二聚体抗体的硝酸纤维素膜。

    优选的,所述定标卡为D-二聚体梯度质量浓度溶液所检测颜色相对应的检测信号
    值。根据检测试纸显示的信号值,与定标卡信号值比对,即可定量判定其质量浓度。

    优选的,所述梯度质量浓度分别为0.1、0.3、1、2.5、5、10mg/L,并且该梯度质量浓
    度检测的信号值与定标卡相对应。

    一种检测D-二聚体斑点免疫金渗滤试剂盒的定量检测方法,包括以下步骤:

    采集血样5.1~10ml,室温放置15min-2h,以4000r/min速度离心20min,吸取上清
    液将血样混匀,得到待测样本;

    利用移液器准确吸取预封闭液,点在反应盒圆孔内硝酸纤维素膜面上;

    待预封闭液渗入后,用移液器准确吸取检测样本,点在反应盒圆孔内硝酸纤维素
    膜面上;

    待检测样本渗入后,再向反应盒膜面滴加胶体金标记D-二聚体抗体;所述胶体金
    标记D-二聚体抗体与所述检测样本的体积比为1:1.5;

    待D-二聚体抗体标记胶体金渗入后,再向反应盒膜面上滴加洗涤液;所述洗涤液
    与所述检测样本的体积比为1:1.5;

    观察反应盒膜面,待洗涤液完全渗入膜面后,检测D-二聚体层析器信号值,通过仪
    器结合定标卡信息计算检测样本D-二聚体浓度,可定量判定其质量浓度。

    D-二聚体(D-Dimer)斑点金渗滤试剂盒具有检测时间短,精密度好,对仪器和环境
    的要求较低,便于临床推广应用等优点。

    本发明提供了一种检测D-二聚体斑点免疫金渗滤试剂盒及其定量检测方法,包括
    pH值为6.7的预封闭液、pH值为6.2的洗涤液、胶体金标记D-二聚体抗体、D-二聚体层析器和
    定标卡;所述预封闭液包括Triton-100和硼酸盐缓冲液溶液;所述洗涤液包括牛血清白蛋
    白和硼酸盐缓冲液溶液。本发明斑点免疫金渗滤法以亲和层析原理为基础,采用硝酸纤维
    素膜为固相载体,以吸附在硝酸纤维素上的抗体为固相,以人血中抗原以及抗体标记胶体
    金为液相,并同时以抗体标记胶体金作为探针和指示剂,而建立起来的一种新型的免疫检
    测方法。

    与现有技术相比,胶体金颗粒的表面带负电荷与D-二聚体抗体蛋白分子的正电荷
    基团因静电作用形成牢固的结合,同时金颗粒又有高电子密度的特性,当被金颗粒标记的
    抗体与相应的抗原配体结合,金颗粒在抗体配体位点大量聚集时,便形成肉眼可见的红色
    斑点。本发明的D-二聚体抗体斑点金渗滤试剂盒具有检测时间短,精密度好,对仪器和环境
    的要求较低,便于临床推广应用等优点。

    具体实施方式

    为了进一步理解本发明,下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述,但是
    应当理解,这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点,而不是对本发明权利要求的
    限制。

    本发明实施例公开了一种检测D-二聚体(D-Dimer)斑点免疫金渗滤试剂盒,包括
    pH值为6.7的预封闭液、pH值为6.2的洗涤液、胶体金标记D-二聚体抗体、D-二聚体层析器和
    定标卡;其中,所述预封闭液中Triton-100的浓度为0.6~10%、硼酸盐缓冲液溶液的浓度
    为0.5~10mol/L;所述洗涤液中牛血清白蛋白(BSA)的浓度为0.6~10%%、硼酸盐缓冲液
    溶液的浓度为0.5~10mol/L。

    作为优选方案,所述硼酸盐缓冲液溶液由Na2B4O7·10H2O 1.0-3.0重量份、H3BO3
    0.5-1.5重量份、NaCl 4重量份、KCl 0.1重量份、蒸馏水800ml重量份、牛血清白蛋白5重量
    份。

    作为优选方案,所述胶体金标记D-二聚体抗体按以下步骤制备而成:

    (1)胶体金的制备以质量分数分别为3%氯金酸、3%柠檬酸三钠、2.8%鞣酸、40mM
    K2CO3及双蒸水为原料,先将3%氯金酸与双蒸水按体积1∶86配成A液;将3%柠檬酸三钠、
    2.8%鞣酸、40mMK2CO3与双蒸水按体积比6∶0.05~0.98∶0.05~0.98∶16.04~18.99配成B
    液;再将所述A液加热到62~69℃,B液加热到55~58℃,搅拌A液,快速加入B液,继续搅拌3
    分钟,在5~9分钟内加热至沸腾,制成胶体金液,该胶体金液颜色由黑→蓝→紫→红色时,
    制成直径为8~12nm的胶体金颗粒;

    (2)利用0.5M K2CO3调整所述胶体金液pH值为7.0~7.5后备用;

    (3)D-二聚体抗体的制备与透析,将抗体在2℃下以10000~13000r/min速度离心
    40分钟,吸取上清液;将该抗原装入透析袋,用双蒸水透析去除盐分后,装瓶冷冻,备用;

    (4)D-二聚体抗体标记胶体金,将步骤(3)中D-二聚体抗原0.31~0.39mg,缓慢加
    入步骤(2)制备的110ml胶体金液中进行包被,搅拌15分钟后,依次加入20~30%的迭氮钠
    500μl、1~10%的牛血清白蛋白100μl,搅匀后在4.1~5.0℃,以7000r/min速度下离心20分
    钟,去除上清液,即成D-二聚体抗体标记胶体金。

    作为优选方案,配制胶体金A液配方同上,所述配制胶体金B液的组分为3%柠檬酸
    三钠6.0ml、2.8%鞣酸1.2ml、40mM K2C031.2ml与双蒸水19ml;制成的胶体金颗粒直径为7.8
    <D<9.8nm;胶体金液pH值调为6.8;胶体金液与D-二聚体抗原的体积重量比为100ml∶
    0.30mg。

    作为优选方案,所述D-二聚体层析器设置有反应盒,直径为3.5cm的塑料小盒,分
    盒底和盒盖两部分,盒盖顶面中央有一个上部直径为0.8cm、下部直径为0.4cm的小圆孔,盒
    内垫满吸水材料,在小圆孔下方和吸水材料上方之间放置一张1.5×1.5cm的包被有D-二聚
    体抗体的硝酸纤维素膜,合紧盒盖即组成反应盒??杀苊獯蟛糠执庋竞捅昙翘秸氪影?br />点以外的非相关区域流失,影响检测灵敏度,可以使得该技术在临床检验中广泛使用。

    作为优选方案,所述包被D-二聚体抗体的硝酸纤维素膜按以下步骤制备而成:

    (1)抗体的纯化,D-二聚体包被抗体的纯化与透析,将抗体原液在2℃下以10000~
    13000r/min速度离心40分钟,吸取上清液即为D-二聚体抗体;将该抗体装入透析袋,用双蒸
    水透析去除盐分后,超滤浓缩后装瓶冷冻,备用;

    (2)用硼酸盐缓冲液溶液稀释上述抗体,得到1.0mg/ml的包被液;

    (3)将包被液滴加至裁切好的硝酸纤维素膜上,每张膜片0.025ml,将膜片置于烘
    箱中干燥后即制成包被有D-二聚体抗体的硝酸纤维素膜。

    作为优选方案,所述定标卡为D-二聚体梯度质量浓度溶液所检测信号值相对应。
    根据检测试纸显示的信号值,与定标卡信号值比对,即可定量判定其质量浓度。

    作为优选方案,所述梯度质量浓度分别为0.1、0.3、1、2.5、5、10mg/L,并且该梯度
    质量浓度检测的信号与定标卡相对应。

    更进一步的,本发明还提供一种检测D-二聚体(D-Dimer)斑点金渗滤试剂盒的定
    量检测方法,按以下步骤操作:

    (1)待检人血浆的采集:用柠檬酸钠抗凝的真空采血管采集血样5.1~10ml,混匀,
    置室温放置15min-2h,以4000r/min速度离心20min,吸取上清液为待测样本,冷冻备用;

    (2)预封闭液加样:用移液器准确吸取预封闭液,点在反应盒圆孔内硝酸纤维素膜
    面上;

    (3)检测样本加样:待预封闭液完全渗入后,用移液器准确吸取检测样本,点在反
    应盒圆孔内硝酸纤维素膜面上;

    (4)滴加D-二聚体抗体标记胶体金:待检测样本渗入后,再往反应盒膜面滴加D-二
    聚体抗体,所述胶体金标记D-二聚体抗体与所述检测样本的体积比为1:1.5;

    (5)待D-二聚体抗体标记胶体金渗入后,再往反应盒膜面上滴加洗涤液;所述洗涤
    液与所述检测样本的体积比为1:1.5;

    (6)检测并记录结果:观察反应盒膜面,待洗涤液完全渗入膜面后,检测D-二聚体
    层析器信号值,通过仪器结合定标卡信息计算检测样本D-二聚体浓度,即可定量判定其质
    量浓度。

    从以上方案可以看出,本发明简单便捷,根据D-二聚体层析器显示的颜色,与对应
    批次定标信息,即可定量待检测物质的质量浓度。

    为了进一步理解本发明,下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细说
    明,本发明的?;し段Р皇芤韵率凳├南拗?。

    本发明实施例采用的原料和化学试剂均为市购。

    实施例1

    一种检测D-二聚体(D-Dimer)斑点免疫金渗滤试剂盒,包括pH值为6.7的预封闭
    液、pH值为6.2的洗涤液、胶体金标记D-二聚体抗体、D-二聚体层析器和定标卡;其中,所述
    预封闭液中Triton-100的浓度为1.5%、硼酸盐缓冲液溶液的浓度为1.5mol/L;所述洗涤液
    中牛血清白蛋白(BSA)的浓度为1.5%、硼酸盐缓冲液溶液的浓度为1.5mol/L。所述硼酸盐
    缓冲液溶液由Na2B4O7·10H2O 2.0重量份、H3BO3 1.0重量份、NaCl 4.0重量份、KCl 0.1重
    量份、蒸馏水800ml重量份、牛血清白蛋白5重量份。

    所述D-二聚体层析器设置有反应盒,直径为3.5cm的塑料小盒,分盒底和盒盖两部
    分,盒盖顶面中央有一个上部直径为0.8cm、下部直径为0.4cm的小圆孔,盒内垫满吸水材
    料,在小圆孔下方和吸水材料上方之间放置一张1.5×1.5cm的包被有D-二聚体抗体的硝酸
    纤维素膜。所述包被D-二聚体抗体的硝酸纤维素膜按以下步骤制备而成:

    (1)抗体的纯化,D-二聚体包被抗体的纯化与透析,将抗体原液在2℃下以11000r/
    min速度离心40分钟,吸取上清液即为D-二聚体抗体;将该抗体装入透析袋,用双蒸水透析
    去除盐分后,超滤浓缩后装瓶冷冻,备用;

    (2)用硼酸盐缓冲液溶液稀释上述抗体,得到1.0mg/ml的包被液;

    (3)将包被液滴加至裁切好的硝酸纤维素膜上,每张膜片0.025ml,将膜片置于烘
    箱中干燥后即制成包被有D-二聚体抗体的硝酸纤维素膜。

    所述胶体金标记D-二聚体抗体按以下步骤制备而成:

    (1)胶体金的制备以质量分数分别为3%氯金酸、3%柠檬酸三钠、2.8%鞣酸、40mM
    K2CO3及双蒸水为原料,先将3%氯金酸与双蒸水按体积1∶86配成A液;将3%柠檬酸三钠、
    2.8%鞣酸、40mMK2CO3与双蒸水按体积比6∶0.05~0.98∶0.05~0.98∶16.04~18.99配成B
    液;再将所述A液加热到64℃,B液加热到56.5℃,搅拌A液,快速加入B液,继续搅拌3分钟,在
    7分钟内加热至沸腾,制成胶体金液,该胶体金液颜色由黑→蓝→紫→红色时,制成直径为
    10nm的胶体金颗粒;

    (2)利用0.4M K2CO3调整所述胶体金液pH值为7.2后备用;

    (3)D-二聚体抗体的制备与透析,将抗体在2℃下以11000r/min速度离心40分钟,
    吸取上清液;将该抗原装入透析袋,用双蒸水透析去除盐分后,装瓶冷冻,备用;

    (4)D-二聚体抗体标记胶体金,将步骤(3)D-二聚体抗原0.35mg,缓慢加入步骤(2)
    制备的110ml胶体金液中进行包被,搅拌15分钟后,依次加入25%的迭氮钠500μl、5%的牛
    血清白蛋白100μl,搅匀后在4.5℃,以7000r/min速度下离心20分钟,去除上清液,即成D-二
    聚体抗体标记胶体金。

    所述定标卡为D-二聚体梯度质量浓度分别为0.1、0.3、1、2.5、5、10mg/L,并且该梯
    度质量浓度检测的信号与定标卡相对应。

    更进一步的,本发明还提供一种检测D-二聚体(D-Dimer)斑点金渗滤试剂盒的定
    量检测方法,按以下步骤操作:

    (1)待检人血浆的采集:用柠檬酸钠抗凝的真空采血管采集血样7ml,混匀,置室温
    放置1h,以4000r/min速度离心20min,吸取上清液为待测样本,冷冻备用;

    (2)预封闭液加样:用移液器准确吸取预封闭液,点在反应盒圆孔内硝酸纤维素膜
    面上;

    (3)检测样本加样:待预封闭液完全渗入后,用移液器准确吸取检测样本,点在反
    应盒圆孔内硝酸纤维素膜面上;

    (4)滴加D-二聚体抗体标记胶体金:待检测样本渗入后,再往反应盒膜面滴加D-二
    聚体抗体,所述胶体金标记D-二聚体抗体与所述检测样本的体积比为1:1.5;

    (5)待D-二聚体抗体标记胶体金渗入后,再往反应盒膜面上滴加洗涤液;所述洗涤
    液与所述检测样本的体积比为1:1.5;

    (6)检测并记录结果:观察反应盒膜面,待洗涤液完全渗入膜面后,检测D-二聚体
    层析器信号值,通过仪器结合定标卡信息计算检测样本D-二聚体浓度,即可定量判定其质
    量浓度。

    实施例2

    一种检测D-二聚体(D-Dimer)斑点免疫金渗滤试剂盒,包括pH值为6.7的预封闭
    液、pH值为6.2的洗涤液、胶体金标记D-二聚体抗体、D-二聚体层析器和定标卡;其中,所述
    预封闭液中Triton-100的浓度为0.6%、硼酸盐缓冲液溶液的浓度为0.5mol/L;所述洗涤液
    中牛血清白蛋白(BSA)的浓度为0.6%、硼酸盐缓冲液溶液的浓度为0.5mol/L。所述硼酸盐
    缓冲液溶液由Na2B4O7·10H2O 1.0重量份、H3BO3 0.5重量份、NaCl 4.0重量份、KCl 0.1重
    量份、蒸馏水800ml重量份、牛血清白蛋白5重量份。

    所述D-二聚体层析器设置有反应盒,直径为3.5cm的塑料小盒,分盒底和盒盖两部
    分,盒盖顶面中央有一个上部直径为0.8cm、下部直径为0.4cm的小圆孔,盒内垫满吸水材
    料,在小圆孔下方和吸水材料上方之间放置一张1.5×1.5cm的包被有D-二聚体抗体的硝酸
    纤维素膜。所述包被D-二聚体抗体的硝酸纤维素膜按以下步骤制备而成:

    (1)抗体的纯化,D-二聚体包被抗体的纯化与透析,将抗体原液在2℃下以10000r/
    min速度离心40分钟,吸取上清液即为D-二聚体抗体;将该抗体装入透析袋,用双蒸水透析
    去除盐分后,超滤浓缩后装瓶冷冻,备用;

    (2)用硼酸盐缓冲液溶液稀释上述抗体,得到1.0mg/ml的包被液;

    (3)将包被液滴加至裁切好的硝酸纤维素膜上,每张膜片0.025ml,将膜片置于烘
    箱中干燥后即制成包被有D-二聚体抗体的硝酸纤维素膜。

    所述胶体金标记D-二聚体抗体按以下步骤制备而成:

    (1)胶体金的制备以质量分数分别为3%氯金酸、3%柠檬酸三钠、2.8%鞣酸、40mM
    K2CO3及双蒸水为原料,先将3%氯金酸与双蒸水按体积1∶86配成A液;将3%柠檬酸三钠、
    2.8%鞣酸、40mMK2CO3与双蒸水按体积比6∶0.05~0.98∶0.05~0.98∶16.04~18.99配成B
    液;再将所述A液加热到62℃,B液加热到55℃,搅拌A液,快速加入B液,继续搅拌3分钟,在5
    分钟内加热至沸腾,制成胶体金液,该胶体金液颜色由黑→蓝→紫→红色时,制成直径为
    8nm的胶体金颗粒;

    (2)利用0.4M K2CO3调整所述胶体金液pH值为7.0后备用;

    (3)D-二聚体抗体的制备与透析,将抗体在2℃下以10000r/min速度离心40分钟,
    吸取上清液;将该抗原装入透析袋,用双蒸水透析去除盐分后,装瓶冷冻,备用;

    (4)D-二聚体抗体标记胶体金,将步骤(3)D-二聚体抗原0.31mg,缓慢加入步骤(2)
    制备的110ml胶体金液中进行包被,搅拌15分钟后,依次加入20%的迭氮钠500μl、1%的牛
    血清白蛋白100μl,搅匀后在4.1℃,以7000r/min速度下离心20分钟,去除上清液,即成D-二
    聚体抗体标记胶体金。

    所述定标卡为D-二聚体梯度质量浓度分别为0.1、0.3、1、2.5、5、10mg/L,并且该梯
    度质量浓度检测的信号与定标卡相对应。

    更进一步的,本发明还提供一种检测D-二聚体(D-Dimer)斑点金渗滤试剂盒的定
    量检测方法,按以下步骤操作:

    (1)待检人血浆的采集:用柠檬酸钠抗凝的真空采血管采集血样5.1ml,混匀,置室
    温放置15min,以4000r/min速度离心20min,吸取上清液为待测样本,冷冻备用;

    (2)预封闭液加样:用移液器准确吸取预封闭液,点在反应盒圆孔内硝酸纤维素膜
    面上;

    (3)检测样本加样:待预封闭液完全渗入后,用移液器准确吸取检测样本,点在反
    应盒圆孔内硝酸纤维素膜面上;

    (4)滴加D-二聚体抗体标记胶体金:待检测样本渗入后,再往反应盒膜面滴加D-二
    聚体抗体,所述胶体金标记D-二聚体抗体与所述检测样本的体积比为1:1.5;

    (5)待D-二聚体抗体标记胶体金渗入后,再往反应盒膜面上滴加洗涤液;所述洗涤
    液与所述检测样本的体积比为1:1.5;

    (6)检测并记录结果:观察反应盒膜面,待洗涤液完全渗入膜面后,检测D-二聚体
    层析器信号值,通过仪器结合定标卡信息计算检测样本D-二聚体浓度,即可定量判定其质
    量浓度。

    实施例3

    一种检测D-二聚体(D-Dimer)斑点免疫金渗滤试剂盒,包括pH值为6.7的预封闭
    液、pH值为6.2的洗涤液、胶体金标记D-二聚体抗体、D-二聚体层析器和定标卡;其中,所述
    预封闭液中Triton-100的浓度为10%、硼酸盐缓冲液溶液的浓度为10mol/L;所述洗涤液中
    牛血清白蛋白(BSA)的浓度为10%、硼酸盐缓冲液溶液的浓度为10mol/L。所述硼酸盐缓冲
    液溶液由Na2B4O7·10H2O 3.0重量份、H3BO3 1.5重量份、NaCl 4.0重量份、KCl 0.1重量
    份、蒸馏水800ml重量份、牛血清白蛋白5重量份。

    所述D-二聚体层析器设置有反应盒,直径为3.5cm的塑料小盒,分盒底和盒盖两部
    分,盒盖顶面中央有一个上部直径为0.8cm、下部直径为0.4cm的小圆孔,盒内垫满吸水材
    料,在小圆孔下方和吸水材料上方之间放置一张1.5×1.5cm的包被有D-二聚体抗体的硝酸
    纤维素膜。所述包被D-二聚体抗体的硝酸纤维素膜按以下步骤制备而成:

    (1)抗体的纯化,D-二聚体包被抗体的纯化与透析,将抗体原液在2℃下以13000r/
    min速度离心40分钟,吸取上清液即为D-二聚体抗体;将该抗体装入透析袋,用双蒸水透析
    去除盐分后,超滤浓缩后装瓶冷冻,备用;

    (2)用硼酸盐缓冲液溶液稀释上述抗体,得到1.0mg/ml的包被液;

    (3)将包被液滴加至裁切好的硝酸纤维素膜上,每张膜片0.025ml,将膜片置于烘
    箱中干燥后即制成包被有D-二聚体抗体的硝酸纤维素膜。

    所述胶体金标记D-二聚体抗体按以下步骤制备而成:

    (1)胶体金的制备以质量分数分别为3%氯金酸、3%柠檬酸三钠、2.8%鞣酸、40mM
    K2CO3及双蒸水为原料,先将3%氯金酸与双蒸水按体积1∶86配成A液;将3%柠檬酸三钠、
    2.8%鞣酸、40mMK2CO3与双蒸水按体积比6∶0.05~0.98∶0.05~0.98∶16.04~18.99配成B
    液;再将所述A液加热到69℃,B液加热到58℃,搅拌A液,快速加入B液,继续搅拌3分钟,在9
    分钟内加热至沸腾,制成胶体金液,该胶体金液颜色由黑→蓝→紫→红色时,制成直径为
    12nm的胶体金颗粒;

    (2)利用0.4M K2CO3调整所述胶体金液pH值为7.5后备用;

    (3)D-二聚体抗体的制备与透析,将抗体在2℃下以133000r/min速度离心40分钟,
    吸取上清液;将该抗原装入透析袋,用双蒸水透析去除盐分后,装瓶冷冻,备用;

    (4)D-二聚体抗体标记胶体金,将步骤(3)D-二聚体抗原0.39mg,缓慢加入步骤(2)
    制备的110ml胶体金液中进行包被,搅拌15分钟后,依次加入30%的迭氮钠500μl、10%的牛
    血清白蛋白100μl,搅匀后在5.0℃,以7000r/min速度下离心20分钟,去除上清液,即成D-二
    聚体抗体标记胶体金。

    所述定标卡为D-二聚体梯度质量浓度分别为0.1、0.3、1、2.5、5、10mg/L,并且该梯
    度质量浓度检测的信号与定标卡相对应。

    更进一步的,本发明还提供一种检测D-二聚体(D-Dimer)斑点金渗滤试剂盒的定
    量检测方法,按以下步骤操作:

    (1)待检人血浆的采集:用柠檬酸钠抗凝的真空采血管采集血样10ml,混匀,置室
    温放置2h,以4000r/min速度离心20min,吸取上清液为待测样本,冷冻备用;

    (2)预封闭液加样:用移液器准确吸取预封闭液,点在反应盒圆孔内硝酸纤维素膜
    面上;

    (3)检测样本加样:待预封闭液完全渗入后,用移液器准确吸取检测样本,点在反
    应盒圆孔内硝酸纤维素膜面上;

    (4)滴加D-二聚体抗体标记胶体金:待检测样本渗入后,再往反应盒膜面滴加D-二
    聚体抗体,所述胶体金标记D-二聚体抗体与所述检测样本的体积比为1:1.5;

    (5)待D-二聚体抗体标记胶体金渗入后,再往反应盒膜面上滴加洗涤液;所述洗涤
    液与所述检测样本的体积比为1:1.5;

    (6)检测并记录结果:观察反应盒膜面,待洗涤液完全渗入膜面后,检测D-二聚体
    层析器信号值,通过仪器结合定标卡信息计算检测样本D-二聚体浓度,即可定量判定其质
    量浓度。

    实施例4

    实施例4与实施例3、实施例1和实施例2的区别在于,在胶体金标记D-二聚体抗体
    的制备步骤中,配制胶体金A液配方同上,所述配制胶体金B液的组分与含量为3%柠檬酸三
    钠6.0ml、2.8%鞣酸0.05ml、40mM K2C030.05ml与双蒸水16.04ml;制成的胶体金颗粒直径为
    8.1<D<9.3nm;胶体金液pH值调为6.7;胶体金液与D-二聚体抗体的体积重量比为100ml∶
    0.30mg。

    以上实施方式和实施例均需根据具体情况适度调节温度和蒸馏水的使用量,本说
    明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本技术领域的普通技术
    人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进
    和修饰也落入本发明权利要求的?;し段?。

    对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。
    对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的
    一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明
    将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一
    致的最宽的范围。

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    本文标题:一种检测D二聚体斑点金渗滤试剂盒及定量检测方法.pdf
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