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    重庆时时彩龙虎手机版: 一种小麦胚芽中还原性谷胱甘肽含量的检测方法.pdf

    关 键 词:
    一种 小麦 胚芽 原性 谷胱甘肽 含量 检测 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201611107105.2

    申请日:

    2016.12.06

    公开号:

    CN106770870A

    公开日:

    2017.05.31

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 30/88申请日:20161206|||公开
    IPC分类号: G01N30/88; G01N30/74 主分类号: G01N30/88
    申请人: 北京水木源生物科技有限公司
    发明人: 吕强; 戴雨薇; 刘清飞; 彭林; 王钊
    地址: 100012 北京市朝阳区慧忠北里406号楼2010-B
    优先权:
    专利代理机构: 北京市广友专利事务所有限责任公司 11237 代理人: 张仲波
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201611107105.2

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.06.23|||2017.05.31

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明提供一种小麦胚芽中还原性谷胱甘肽含量的检测方法。本发明使用带紫外检测器的高效液相色谱采用标准曲线法获得小麦胚芽中还原性谷胱甘肽含量的含量,从而获得较高的测试精度,可适于食品及保健食品中还原性谷胱甘肽含量的检测。

    权利要求书

    1.一种小麦胚芽中还原性谷胱甘肽含量的检测方法,其特征在于,使用带紫外检测器
    的高效液相色谱采用标准曲线法获得小麦胚芽中还原性谷胱甘肽含量的含量。
    2.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述高效液相色谱的流动相包含体积
    比为2~6:94~98的有机溶剂和由质量比为2.5~3.5:1的磷酸二氢钠、辛烷磺酸钠所组成
    的缓冲溶液。
    3.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述有机溶剂为甲醇和/或乙腈,优选
    为乙腈。
    4.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述流动相的pH为3.0~3.5,优选为
    3.0。
    5.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述高效液相色谱的色谱柱的流速为
    0.8~1.2mL/min,优选为1.0mL/min。
    6.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述高效液相色谱的色谱柱的温度为
    20~40℃。
    7.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,所述紫外检测器的紫外光波长为190
    ~250nm,优选为210nm。
    8.根据权利要求1所述的检测方法,其特征在于,使用用所述高效液相色谱的标准物的
    浓度为150~250μg/ml,优选为200μg/ml。

    说明书

    一种小麦胚芽中还原性谷胱甘肽含量的检测方法

    技术领域

    本发明涉及谷胱甘肽含量检测的技术领域,特别是指一种小麦胚芽中还原性谷胱
    甘肽含量的检测方法。

    背景技术

    目前,对于还原型谷胱甘肽的检测方法分光光度法、有酶法、荧光法、电化学测定
    方法、红外检测分析法等。较为常用的方法就是分光光度法,但分光光度法检测出来的是谷
    胱甘肽的总量,检测的并非是还原性谷胱甘肽含量,虽然很多人在改进这一技术并诞生了
    不少相关专利,但这一问题不能根本性解决。其他较常用的方法是基于Ellman试剂(5,5’-
    二硫代双(2-硝基苯甲酸),DTNB)与巯基反应的DTNB检测方法,但是该方法由于测定误差使
    精确度受到很大限制,基于该方法建立的谷胱甘肽还原酶循环法需要使用价格昂贵的辅
    酶,应用也有所限制。荧光法的反应速度快、灵敏度高,但容易受干扰亦有其局限;电化学测
    定方法也有电极制作成本较高等限制。

    现有技术中,虽然已建立了多种测定还原型谷胱甘肽的方法,但是检测出来的基
    本为谷胱甘肽含量的总量,检测不准确或者精度较低。

    发明内容

    有鉴于此,本发明提供一种小麦胚芽中还原性谷胱甘肽含量的检测方法,该检测
    方法精度较高。

    一种小麦胚芽中还原性谷胱甘肽含量的检测方法,使用带紫外检测器的高效液相
    色谱采用标准曲线法获得小麦胚芽中还原性谷胱甘肽含量的含量。

    上述高效液相色谱(HPLC)通常包括储液器、输液泵、混合器、进样装置、分离色谱
    柱、检测装置五构件。上述带有紫外检测器的高效液相色谱是指检测装置的种类为紫外检
    测器(UV检测器或简称为UVD,以及应用紫外检测原理的二极管阵列检测器或简称为DAD)的
    HPLC。紫外检测器基于溶质分子吸收紫外光的原理设计的检测器,其工作原理是Lambert-
    Beer定律,即当一束单色光透过流动池时,若流动相不吸收光,则吸收度A与吸光组分的浓
    度C和流动池的光径长度L成正比相比于其它类型的检测装置,UV检测器具有灵敏度较高,
    线性范围宽,噪声低,波长可选,对流动相的流速和温度变化不敏感,适用于梯度洗脱,对强
    吸收物质检测极限可达10-9g/ml以下,检测后不破坏样品。

    上述标准曲线法为本领域技术人员所熟知的技术。标准曲线法标准曲线法也称为
    外标法或直接比较法,首先用欲测组分的标准样品绘制标准工作曲线。具体作法是:用标准
    样品配制成不同浓度的标准系列,在与欲测组分相同的色谱条件下,等体积准确量进样,测
    量各峰的峰面积或峰高,用峰面积或峰高对样品浓度绘制标准工作曲线,此标准工作曲线
    应是通过原点的直线。若标准工作曲线不通过原点,说明测定方法存在系统误差。标准工作
    曲线的斜率即为绝对校正因子。在测定样品中的组分含量时,要用与绘制标准工作曲线完
    全相同的色谱条件作出色谱图,测量色谱峰的峰面积或峰高,然后根据峰面积和峰高在标
    准工作曲线上直接查出进入色谱柱中样品组分的浓度,也可通过式(2-3-19)计算这一浓
    度。

    pi/%=fiAi(hi) (2-3-19)

    式中Ai(hi)——i组分峰的峰面积(峰高);

    fi——i组分标准工作曲线的斜率。

    知道进入色谱柱中样品组分的浓度后,就可根据样品处理条件及进样量来计算原
    样品中该组分的含量了。当欲测组分含量变化不大,并已知这一组分的大概含量时,也可以
    不必绘制标准工作曲线,而用单点校正法,即直接比较法定量。先配制一个和待测组分含量
    相近的已知浓度的标准溶液,在相同的色谱条件下,分别将待测样品溶液和标准样品溶液
    等体积进样,作出色谱图,测量待测组分和标准样品的峰面积或峰高,然后由式(2-3-20)直
    接计算样品溶液中待测组分的含量:


    式中ws——标准样品溶液质量分数,%:

    wi——样品溶液中待测组分质量分数,%:

    As(hs)——标准样品的峰面积(峰高):

    Ai(hi)——样品中i组分的峰面积(峰高)。

    单点校正法实际上是利用原点作为标准工作曲线上的另一个点。因此,当方法存
    在系统误差时(即标准工作曲线不通过原点),单点校正法的误差较大。标准曲线法的优点
    是:绘制好标准工作曲线后测定工作就很简单了,计算时可直接从标准工作曲线上读出含
    量,这对大量样品分析十分合适。特别是标准工作曲线绘制后可以使用一段时间,在此段时
    间内可经常用一个标准样品对标准工作曲线进行单点校正,以确定该标准工作曲线是否还
    可使用。

    作为本发明的HPLC所采用的色谱柱的型号及规格没有特别的限定,例如其型号及
    规格为symmetryC 185μm 3.9×150mm。

    作为发明的高效液相色谱的流动相,其可以包含体积比为2~6:94~98的有机溶
    剂和由质量比为2.5~3.5:1的磷酸二氢钠、辛烷磺酸钠所组成的缓冲溶液。例如有机溶剂
    和缓冲溶液的体积比可为2:98、2.5:97.5、3:97、4:96、5:95、5.5:94.5、6:94等,优选为4:
    96。

    此处,有机溶剂可以列举出甲醇、乙腈中一种或二种,更优选为乙腈,以获得较高
    的检测灵敏度。

    缓冲溶液的作用是维持流动相的pH值,以使得被测组分保持分子状态的稳定性。
    缓冲溶液中磷酸二氢钠、辛烷磺酸钠的质量比可以为2.5:1、2.8:1、3:1、3.2:1、3.3:1、3.4:
    1、3.5:1等,优选为3:1。

    上述流动相的pH以3.0~3.5,如3.0、3.2、3.5。优选为3.0,以保持还原性谷胱甘肽
    的高吸收率。

    上述高效液相色谱的色谱柱的流速为0.8~1.2mL/min,如0.8mL/min、0.85mL/
    min、0.90mL/min、1.0mL/min、1.1mL/min、1.15mL/min或1.2mL/min、;优选为1.0mL/min。

    作为本发明的高效液相色谱,其色谱柱的温度以20~40℃为宜,优选为30℃。

    上述紫外检测器的紫外光波长以190~250nm为佳,优选为210nm。

    高效液相色谱的标准物的浓度可参考性地为150~250μg/ml,优选为200μg/ml。

    作为本发明的流动相,在使用前超声波脱气,以避免流动相中的气泡会增加基线
    的噪音,造成灵敏度下降,甚至无法分析。同时,还可避免溶解的氧气还所导致的某些组份
    被氧化,柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。

    本发明未述及之处适用于现有技术。

    除非另有限定,本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技
    术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时,以本说明书中的定义为准。

    如本文所用之术语:

    “由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”
    或其任何其它变形,意在覆盖非排它性的包括。例如,包含所列要素的组合物、步骤、方法、
    制品或装置不必仅限于那些要素,而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步
    骤、方法、制品或装置所固有的要素。

    连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中,
    此短语将使权利要求为封闭式,使其不包含除那些描述的材料以外的材料,但与其相关的
    常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后
    时,其仅限定在该子句中描述的要素;其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之
    外。

    当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优
    选值限定的范围表示时,这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围
    下限或优选值的任一配对所形成的所有范围,而不论该范围是否单独公开了。例如,当公开
    了范围“1~5”时,所描述的范围应被解释为包括范围“1~4”、“1~3”、“1~2”、“1~2和4~
    5”、“1~3和5”等。当数值范围在本文中被描述时,除非另外说明,否则该范围意图包括其端
    值和在该范围内的所有整数和分数。

    “质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位,1份可表示任意的单
    位质量,如可以表示为1g,也可表示2.689g等。假如我们说A组分的质量份为a份,B组分的质
    量份为b份,则表示A组分的质量和B组分的质量之比a:b?;蛘?,表示A组分的质量为aK,B组
    分的质量为bK(K为任意数,表示倍数因子)。不可误解的是,与质量分数不同的是,所有组分
    的质量份之和并不受限于100份之限制。

    “和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生,例如,A和/或B包括(A
    和B)和(A或B);

    此外,本发明要素或组分前的不定冠词“一种”和“一个”对要素或组分的数量要求
    (即出现次数)无限制性。因此“一个”或“一种”应被解读为包括一个或至少一个,并且单数
    形式的要素或组分也包括复数形式,除非所述数量明显旨指单数形式。

    本发明的上述技术方案的有益效果如下:

    上述方案中,使用带紫外检测器的高效液相色谱采用标准曲线法获得小麦胚芽中
    还原性谷胱甘肽含量的含量,从而获得较高的测试精度,可适于食品及保健食品中还原性
    谷胱甘肽含量的检测。

    具体实施方式

    为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚,下面将结合具体实施
    例进行详细描述。

    实施例1

    步骤一、按照以下条件设定色谱参数:

    色谱柱型号:symmetryC185μm 3.9×150mm;

    流动相:包含体积比为2:98的乙腈和由质量比为2.5:1的磷酸二氢钠、辛烷磺酸钠
    所组成的缓冲溶液;流动相的pH为3.0;

    色谱柱:流速为0.8mL/min;温度为20℃;进样量为10μl;

    紫外光检测:波长为190nm。

    步骤二、标准溶液制备:准确称取10.0mg谷胱甘肽对照品,用高纯水溶解,并定容
    至50ml刻度,浓度为200μg/ml,混匀备用。

    分别取谷胱甘肽对照品储备液0.0、0.5、2.5、5.0、7.5、12.5ml(200μg/ml)于50ml
    容量瓶中,加水定容至刻度混匀,相当于0.0、2.0、10.0、20.0、30.0、50.0μg/ml,作为标准系
    列应用液。

    步骤三、样品制备。液体样品根据含量高低进行稀释或浓缩后,过0.45μm滤膜作为
    样品分析液。对于固体样品,准确称取适量样品(小麦胚芽),加蒸馏水至25ml刻度,混匀,超
    声波提取5min,离心,上清液过0.45μm滤膜作为样品分析液。

    步骤四、曲线绘制。分别取已制备好的样品分析液和标准对照溶液10μl,按上述选
    定的色谱条件,将配制好的标准溶液系列应用液进行分析,每个浓度重复3次,以浓度为横
    坐标,峰面积均值为纵坐标,绘制标准工作曲线,通过回归计算求得回归方程Y=5871C+
    3949,相关系数r=0.9999。

    实施例2

    步骤一、按照以下条件设定色谱参数:

    色谱柱型号:symmetryC185μm 3.9×150mm;

    流动相:包含体积比为6:94的甲醇和由质量比为3.5:1的磷酸二氢钠、辛烷磺酸钠
    所组成的缓冲溶液;流动相的pH为3.2;

    色谱柱:流速为1.2mL/min;温度为40℃;进样量为10μl;

    紫外光检测:波长为200nm。

    步骤二、标准溶液制备:准确称取10.0mg谷胱甘肽对照品,用高纯水溶解,并定容
    至50ml刻度,浓度为200μg/ml,混匀备用。

    分别取谷胱甘肽对照品储备液0.0、0.5、2.5、5.0、7.5、12.5ml(200μg/ml)于50ml
    容量瓶中,加水定容至刻度混匀,相当于0.0、2.0、10.0、20.0、30.0、50.0μg/ml,作为标准系
    列应用液。

    步骤三、样品制备。液体样品根据含量高低进行稀释或浓缩后,过0.45μm滤膜作为
    样品分析液。对于固体样品,准确称取适量样品(小麦胚芽),加蒸馏水至25ml刻度,混匀,超
    声波提取5min,离心,上清液过0.45μm滤膜作为样品分析液。

    步骤四、曲线绘制。分别取已制备好的样品分析液和标准对照溶液10μl,按上述选
    定的色谱条件,将配制好的标准溶液系列应用液进行分析,每个浓度重复3次,以浓度为横
    坐标,峰面积均值为纵坐标,绘制标准工作曲线,通过回归计算求得回归方程Y=5871C+
    3949,相关系数r=0.9999。

    实施例3

    步骤一、按照以下条件设定色谱参数:

    色谱柱型号:symmetryC185μm 3.9×150mm;

    流动相:包含体积比为5:95的甲醇和由质量比为3:1的磷酸二氢钠、辛烷磺酸钠所
    组成的缓冲溶液;流动相的pH为3.5;

    色谱柱:流速为1mL/min;温度为30℃;进样量为10μl;

    紫外光检测:波长为250nm。

    步骤二、标准溶液制备:准确称取10.0mg谷胱甘肽对照品,用高纯水溶解,并定容
    至50ml刻度,浓度为200μg/ml,混匀备用。

    分别取谷胱甘肽对照品储备液0.0、0.5、2.5、5.0、7.5、12.5ml(200μg/ml)于50ml
    容量瓶中,加水定容至刻度混匀,相当于0.0、2.0、10.0、20.0、30.0、50.0μg/ml,作为标准系
    列应用液。

    步骤三、样品制备。液体样品根据含量高低进行稀释或浓缩后,过0.45μm滤膜作为
    样品分析液。对于固体样品,准确称取适量样品(小麦胚芽),加蒸馏水至25ml刻度,混匀,超
    声波提取5min,离心,上清液过0.45μm滤膜作为样品分析液。

    步骤四、曲线绘制。分别取已制备好的样品分析液和标准对照溶液10μl,按上述选
    定的色谱条件,将配制好的标准溶液系列应用液进行分析,每个浓度重复3次,以浓度为横
    坐标,峰面积均值为纵坐标,绘制标准工作曲线,通过回归计算求得回归方程Y=5871C+
    3949,相关系数r=0.9999。

    实施例4

    步骤一、按照以下条件设定色谱参数:

    色谱柱型号:symmetryC185μm 3.9×150mm;

    流动相:包含体积比为4:96的乙腈和由质量比为3:1的磷酸二氢钠、辛烷磺酸钠所
    组成的缓冲溶液;流动相的pH为3.0;

    色谱柱:流速为1mL/min;温度为30℃;进样量为10μl;

    紫外光检测:波长为210nm。

    步骤二、标准溶液制备:准确称取10.0mg谷胱甘肽对照品,用高纯水溶解,并定容
    至50ml刻度,浓度为200μg/ml,混匀备用。

    分别取谷胱甘肽对照品储备液0.0、0.5、2.5、5.0、7.5、12.5ml(200μg/ml)于50ml
    容量瓶中,加水定容至刻度混匀,相当于0.0、2.0、10.0、20.0、30.0、50.0μg/ml,作为标准系
    列应用液。

    步骤三、样品制备。液体样品根据含量高低进行稀释或浓缩后,过0.45μm滤膜作为
    样品分析液。对于固体样品,准确称取适量样品(小麦胚芽),加蒸馏水至25ml刻度,混匀,超
    声波提取5min,离心,上清液过0.45μm滤膜作为样品分析液。

    步骤四、曲线绘制。分别取已制备好的样品分析液和标准对照溶液10μl,按上述选
    定的色谱条件,将配制好的标准溶液系列应用液进行分析,每个浓度重复3次,以浓度为横
    坐标,峰面积均值为纵坐标,绘制标准工作曲线,通过回归计算求得回归方程Y=5871C+
    3949,相关系数r=0.9999。

    由于本发明中所涉及的各工艺参数的数值范围在上述实施例中不可能全部体现,
    但本领域的技术人员完全可以想象到只要落入上述该数值范围内的任何数值均可实施本
    发明,当然也包括若干项数值范围内具体值的任意组合。此处,出于篇幅的考虑,省略了给
    出某一项或多项数值范围内具体值的实施例,此不应当视为本发明的技术方案的公开不充
    分。

    申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺设备和工艺流程,
    但本发明并不局限于上述详细工艺设备和工艺流程,即不意味着本发明必须依赖上述详细
    工艺设备和工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,
    对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的
    ?;し段Ш凸段е?。

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