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    看重庆时时彩走势图: 一种检测力竭运动后小鼠骨骼肌肌肉生长抑制素含量的方法.pdf

    关 键 词:
    一种 检测 运动 小鼠 骨骼肌 肌肉 生长 抑制 含量 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201611166543.6

    申请日:

    2016.12.16

    公开号:

    CN106770517A

    公开日:

    2017.05.31

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 27/26申请日:20161216|||公开
    IPC分类号: G01N27/26; G01N27/327 主分类号: G01N27/26
    申请人: 青岛科技大学
    发明人: 王朝霞; 柏娟
    地址: 266000 山东省青岛市市北区郑州路53号青岛科技大学
    优先权:
    专利代理机构: 青岛中天汇智知识产权代理有限公司 37241 代理人: 郝团代
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201611166543.6

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.06.23|||2017.05.31

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明属于电化学传感器领域,其原理是利用金纳米粒子修饰电极,再利用抗体与金纳米粒子的作用,制备抗体修饰的金电极,即得抗体/金纳米粒子/金电极。然后将抗体/金纳米粒子/金电极浸入含有肌肉生长抑制素的样品中,再加入抗体修饰铂纳米粒子。利用肌肉生长抑制素与抗体的作用形成三明治夹心结构,在对硝基苯酚PNP、NaBH4、二茂铁甲酸Fc的体系中发生氧化还原循环,电化学响应信号得到放大。根据电化学信号的强弱可以实现对肌肉生长抑制素的测定;并对力竭运动后小鼠骨骼肌肌肉生长抑制素含量进行了测定,方法具有操作简单,成本低廉,灵敏度高的特点。

    权利要求书

    1.一种检测力竭运动后小鼠骨骼肌肌肉生长抑制素含量的方法,其特征在于利用金纳
    米粒子修饰电极,再利用抗体与金纳米粒子的作用,制备抗体修饰的金电极,即得抗体/金
    纳米粒子/金电极;然后将抗体/金纳米粒子/金电极浸入含有肌肉生长抑制素的样品中,再
    加入抗体修饰铂纳米粒子;利用肌肉生长抑制素与抗体的作用形成三明治夹心结构,在对
    硝基苯酚PNP、NaBH4、二茂铁甲酸Fc的体系中,铂纳米粒子在NaBH4作用下催化PNP转化为对
    氨基苯酚PAP,产生的PAP被溶液中的Fc氧化,氧化产物对苯醌亚胺p-quinone imine又被
    NaBH4还原成PAP,这样PAP与氧化产物之间产生持续的氧化还原,从而产生电化学信号,在
    铂纳米粒子的作用下发生氧化还原循环,电化学响应信号得到放大;根据电化学信号的强
    弱可以实现对肌肉生长抑制素的测定;测定步骤如下:
    (1)铂纳米粒子的制备
    首先,将制备铂纳米粒子所用的玻璃仪器用王水泡洗,烘干备用;然后将7mL浓度为1%
    的氯铂酸溶液中加入1.0mL浓度为1%的抗坏血酸,80℃条件下,搅拌20分钟,当溶液变成黑
    棕色停止加热,得铂纳米粒子,冷却至室温,4℃条件下保存备用;
    (2)抗体修饰铂纳米粒子的制备
    首先,将制备的2mL铂纳米粒子溶液与8mL pH 7.4的磷酸缓冲溶液混合,得到稀释的铂
    纳米粒子,然后移取稀释的铂纳米粒子2mL与0.5mL肌肉生长抑制素抗体混合,37℃条件下,
    震荡反应24h,得抗体/铂纳米粒子复合物,利用高速离心机离心清洗后,再次分散在PBS缓
    冲溶液中,4℃下保存;
    (3)抗体修饰金电极的制备
    首先,将10μL的金纳米粒子溶液滴加在处理好的金电极表面,4℃条件下孵育10h,得金
    纳米粒子修饰金电极;然后将10μL的肌肉生长抑制素抗体滴涂在金纳米粒子修饰金电极表
    面,37℃条件下,反应24h,得抗体/金纳米粒子/金电极,用磷酸缓冲溶液清洗电极后,在4℃
    下保存;
    (4)肌肉生长抑制素的检测
    将抗体/金纳米粒子/金电极浸入含有肌肉生长抑制素的样品溶液中,37℃条件下反应
    2h,然后将电极取出,用磷酸缓冲溶液冲洗三次,再插入pH 7.4的含5mmol/L PNP、5mmol/L
    NaBH4和5mmol/L Fc的磷酸缓冲溶液中,在电化学工作站上,以循环伏安法检测电化学信
    号,电位为-200~600mV,用50mV s-1速度扫描;
    (5)力竭运动后小鼠骨骼肌肌肉生长抑制素含量检测
    对小鼠进行力竭运动并取材,检测力竭运动后小鼠骨骼肌肌肉生长抑制素的含量,结
    果显示,力竭运动后小鼠骨骼肌肌肉生长抑制素的含量为4.56ng/mg,对照组小鼠骨骼肌肌
    肉生长抑制素的含量为5.72ng/mg;表明,力竭运动后小鼠骨骼肌肌肉生长抑制素的含量较
    对照组有所降低。
    2.根据权利要求1的一种检测力竭运动后小鼠骨骼肌肌肉生长抑制素含量的方法,其
    特征在于所述的肌肉生长抑制素、肌肉生长抑制素抗体购于R&D Systems公司;
    所述的氯铂酸、抗坏血酸、二茂铁甲酸购自国药集团化学试剂有限公司;
    所述的硼氢化钠NaBH4、对硝基苯酚PNP均购自天津化学试剂有限公司;
    所述的PBS缓冲溶液配置方法为:将21mL 0.2mol/L的KH2PO4、78mL 0.2mol/L的
    Na2HPO4·12H2O混合,并加入KCl固体,使得KCl的浓度为0.1mol/L,得到0.1mol/LpH为7.4的
    PBS缓冲溶液;
    所述的磷酸缓冲溶液配置方法为:将21mL 0.2mol/L的KH2PO4、78mL 0.2mol/L的
    Na2HPO4·12H2O混合,得到0.1mol/L pH为7.4的磷酸缓冲溶液;
    所述的电化学工作站为上海辰华仪器公司的CHI760E电化学工作站;
    所述的高速离心机为Z300K高速离心机。

    说明书

    一种检测力竭运动后小鼠骨骼肌肌肉生长抑制素含量的方法

    技术领域

    本发明属于电化学传感器领域,具体涉及一种检测力竭运动后小鼠骨骼肌肌肉生
    长抑制素含量的方法。

    背景技术

    肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN),又称生长分化因子8(GDF-8),是骨骼肌生长
    发育的主要调控因子,其主要在骨骼肌中表达,它对骨骼肌生长发育具有抑制作用,是近年
    来发现的一种肌组织特异性蛋白[Furihata T,Kinugawa S,Fukushima A,et al.Serum
    myostatin levels are independently associated with skeletal muscle wasting in
    patients with heart failure[J].International Journal of Cardiology,2016,22:
    483-487]。肌肉生长抑制素在组织中的含量对肌生长发育具有重要的影响,故对肌肉生长
    抑制素含量的测定具有重要的意义。文献报道测定肌肉生长抑制素的方法主要有荧光法
    [田振军,贺志雄,刘智炜,等.持续和间歇有氧运动对心梗大鼠心肌Myostatin及其受体表
    达的影响[J].体育科学,2013,33(11):66-74.]、化学发光法[Chang H M,Fang L,Cheng J
    C,et al.Growth differentiation factor 8down-regulates pentraxin 3in human
    granulosa cells[J].Molecular&Cellular Endocrinology,2015,404:82-90.Chang H M,
    Pan H H,Cheng J C,et al.Growth differentiation factor 8suppresses cell
    proliferation by up-regulating CTGF expression in human granulosa cells.[J]
    .Molecular&Cellular Endocrinology,2016,422:9-17.]。近年来,基于电化学氧化还原催
    化反应测定新方法成为了热点之一[Das J,Aziz M A,Yang H.A nanocatalyst-based
    assay for proteins:DNA-free ultrasensitive electrochemical detection using
    catalytic reduction of p-nitrophenol by gold-nanoparticle labels.[J].Journal
    of the American Chemical Society,2006,128(128):16022-16023.Hun X,Xie G,Luo
    X.Scaling up an electrochemical signal with a catalytic hairpin assembly
    coupling nanocatalyst label for DNA detection.[J].Chemical Communications,
    2015,51(33):7100-7103]。为了进一步提高对MSTN检测的灵敏度,用铂纳米粒子标记抗体,
    以铂纳米粒子的催化放大作用,构建了一种高灵敏检测肌肉生长抑制素的电化学新方法,
    并用于力竭运动后小鼠骨骼肌肌肉生长抑制素含量的测定。

    发明内容

    本发明旨在发明一种方法操作简单,成本低廉,灵敏度高的测定肌肉生长抑制素
    的方法。

    实现发明目的技术方案是:

    一种检测力竭运动后小鼠骨骼肌肌肉生长抑制素含量的方法。其原理是利用金纳
    米粒子修饰电极,再利用抗体与金纳米粒子的作用,制备抗体修饰的金电极,即得抗体/金
    纳米粒子/金电极。然后将抗体/金纳米粒子/金电极浸入含有肌肉生长抑制素的样品中,再
    加入抗体修饰铂纳米粒子。利用肌肉生长抑制素与抗体的作用形成三明治夹心结构,在对
    硝基苯酚PNP、NaBH4、二茂铁甲酸Fc的体系中,铂纳米粒子在NaBH4作用下催化PNP转化为对
    氨基苯酚PAP,产生的PAP被溶液中的Fc氧化,氧化产物对苯醌亚胺p-quinone imine又被
    NaBH4还原成PAP,这样PAP与氧化产物之间产生持续的氧化还原,从而产生电化学信号,在
    铂纳米粒子的作用下发生氧化还原循环,电化学响应信号得到放大。根据电化学信号的强
    弱可以实现对肌肉生长抑制素的测定;并对力竭运动后小鼠骨骼肌肌肉生长抑制素含量进
    行了测定。

    测定步骤为:

    (1)铂纳米粒子的制备

    首先,将制备铂纳米粒子所用的玻璃仪器用王水泡洗,烘干备用。然后将7mL的浓
    度为1%的氯铂酸溶液中加入1.0mL浓度为1%的抗坏血酸,80℃条件下,搅拌20分钟,当溶
    液变成黑棕色停止加热,得铂纳米粒子,冷却至室温,4℃条件下保存备用。

    (2)抗体修饰铂纳米粒子的制备

    首先,将制备的2mL铂纳米粒子溶液与8mL pH 7.4的磷酸缓冲溶液混合,得到稀释
    的铂纳米粒子,然后移取稀释的铂纳米粒子2mL与0.5mL肌肉生长抑制素抗体混合,37℃条
    件下,震荡反应24h,得抗体/铂纳米粒子复合物,利用高速离心机离心清洗后,再次分散在
    PBS缓冲溶液中,4℃下保存。

    (3)抗体修饰金电极的制备

    首先,将10μL的金纳米粒子溶液滴加在处理好的金电极表面,4℃条件下孵育10h,
    得金纳米粒子修饰金电极。然后将10μL的肌肉生长抑制素抗体滴涂在金纳米粒子修饰金电
    极表面,37℃条件下,反应24h,得抗体/金纳米粒子/金电极,用磷酸缓冲溶液清洗电极后,
    在4℃下保存。

    (4)肌肉生长抑制素的检测

    将抗体/金纳米粒子/金电极浸入含有肌肉生长抑制素的样品溶液中,37℃条件下
    反应2h,然后将电极取出,用磷酸缓冲溶液冲洗三次,再插入pH 7.4的含5mmol/L PNP、
    5mmol/L NaBH4和5mmol/L Fc的磷酸缓冲溶液中,在电化学工作站上,以循环伏安法检测电
    化学信号,电位为-200~600mV(vs.SCE),用50mV s-1速度扫描。

    (5)力竭运动后小鼠骨骼肌肌肉生长抑制素含量检测

    对小鼠进行力竭运动并取材,检测力竭运动后小鼠骨骼肌肌肉生长抑制素的含
    量,结果显示,力竭运动后小鼠骨骼肌肌肉生长抑制素的含量为4.56ng/mg,对照组小鼠骨
    骼肌肌肉生长抑制素的含量为5.72ng/mg;表明,力竭运动后小鼠骨骼肌肌肉生长抑制素的
    含量较对照组有所降低。

    所述的肌肉生长抑制素、肌肉生长抑制素抗体购于R&D Systems公司。

    所述的氯铂酸(H2PtCl6)、抗坏血酸、二茂铁甲酸(Fc)购自国药集团化学试剂有限
    公司。

    所述的硼氢化钠(NaBH4)、对硝基苯酚(PNP)均购自天津化学试剂有限公司。

    实验过程中使用的水为二次蒸馏水。

    将21mL 0.2mol/L的KH2PO4、78mL 0.2mol/L的Na2HPO4·12H2O混合,并加入KCl固
    体,使得KCl的浓度为0.1mol/L,得到0.1mol/L pH为7.4的PBS缓冲溶液。

    所述的磷酸缓冲溶液配置方法为:将21mL 0.2mol/L的KH2PO4、78mL 0.2mol/L的
    Na2HPO4·12H2O混合,得到0.1mol/L pH为7.4的磷酸缓冲溶液;

    电化学检测采用CHI760E电化学工作站(上海辰华仪器公司)。

    Z300K高速离心机(Hermle,Germany)用于离心分离。

    附图说明

    图1检测肌肉生长抑制素含量的原理示意图。

    图2抗体/铂纳米粒子溶液用量(A)和探针溶液和样品作用时间(B)对电化学信号
    强度的影响。

    图3肌肉生长抑制素浓度与电化学信号关系图。

    发明的优点与效果

    在最佳的检测条件下,得到了检测肌肉生长抑制素的标准曲线,线性范围及线性
    方程。肌肉生长抑制素浓度的浓度在0.7~25.0ng/mL之间时,体系的信号强度随着肌肉生
    长抑制素浓度的增大而增大。得到肌肉生长抑制素的线性回归方程为ip=0.6536C+15.584
    (ip为体系的信号强度;C为肌肉生长抑制素的浓度,10-8ng/mL;n=7,R=0.999)(如图3所
    示)。该方法检测限为0.3ng/mL(3σ)。对浓度3.0ng/mL的肌肉生长抑制素进行7次平行重复
    测定的RSD为4.3%,表明本法有较好的重现性。

    具体实施方式

    下面结合具体实施例进一步说明本发明,但不构成对发明的进一步限制。

    实施例1 抗体/铂纳米粒子溶液用量对电化学信号的影响

    固定探针溶液和样品作用时间,考察了抗体/铂纳米粒子溶液用量对电化学检测
    信号的影响。结果显示,当抗体/铂纳米粒子溶液用量溶液用量在从20μL到120μL增加时,电
    化学信号随着体积的增加而增强;用量大于90μL时,电化学信号增加变缓(如图2A所示)。因
    此,实验选取90μL为抗体/铂纳米粒子溶液的最佳用量。

    实施例2 探针溶液和样品作用时间对电化学响应信号的影响

    当固定抗体/铂纳米粒子溶液用量为90μL时,考察了探针溶液和样品作用时间电
    化学对信号强度的影响,随着作用时间的增加,电化学信号逐渐增强,当作用时间为30min
    时,电化学信号最大(如图2B所示)。因此,实验选取30min作为探针溶液和样品作用时间的
    最佳用量。

    实施例3 力竭运动后小鼠骨骼肌肌肉生长抑制素含量检测

    对小鼠进行力竭运动并取材,检测力竭运动后小鼠骨骼肌肌肉生长抑制素的含
    量,检测结果如表1所示。结果显示,力竭运动后小鼠骨骼肌肌肉生长抑制素的含量为
    4.56ng/mg,对照组小鼠骨骼肌肌肉生长抑制素的含量为5.72ng/mg。表明,力竭运动后小鼠
    骨骼肌肌肉生长抑制素的含量较对照组有所降低。

    表1.力竭运动后小鼠骨骼肌肌肉生长抑制素的含量测定结果


    an=7;C为对照组;S力竭运动组。

    关于本文
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