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    重庆时时彩5星奖走势: 一种实蝇幼虫表皮碳氢化合物组分的分析方法.pdf

    关 键 词:
    一种 幼虫 表皮 碳氢化合物 组分 分析 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201611226295.X

    申请日:

    2016.12.27

    公开号:

    CN106770770A

    公开日:

    2017.05.31

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 30/02申请日:20161227|||公开
    IPC分类号: G01N30/02; G01N30/72; G01N30/06; G01N30/34; G01N30/30 主分类号: G01N30/02
    申请人: 广东省农业科学院植物?;ぱ芯克?
    发明人: 雷妍圆; 林涛; 吕利华; 齐国君; 陈婷; 何余容
    地址: 510640 广东省广州市天河区金颍路7号
    优先权:
    专利代理机构: 广州嘉权专利商标事务所有限公司 44205 代理人: 胡辉
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201611226295.X

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.06.23|||2017.05.31

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种实蝇幼虫表皮碳氢化合物组分的分析方法,属于检验检疫领域。本发明方法是将实蝇幼虫沿着背侧线从头部或腹末肛门处将整个虫体剪开,去除虫体内含物,漂洗干净,添加适量有机溶剂,快速充分的研磨提取1??4??min,然后再加入等量的有机溶剂,浸提1??5??min,收集所有浸提液;过柱分离后进行GC??MS??分析。本发明方法改良了现有技术中关于实蝇幼虫表皮碳氢化合物组分的分析方法,使得整个检测时间从原来的12??24??h缩短到2??3??h,大大增强了时效性。此外,本发明方法可以浸提获得种类更多的表皮碳氢化合物组分,为进一步鉴定实蝇的种类尤其是近缘种提供更为详实而可靠的数据支持。

    权利要求书

    1.一种实蝇幼虫表皮碳氢化合物组分的分析方法,其特征在于:包括下列步骤:
    1)将实蝇幼虫沿着背侧线从头部或腹末肛门处将整个虫体剪开,去除虫体内含物,漂
    洗干净,得到实蝇幼虫表皮;
    2)取实蝇幼虫表皮添加适量有机溶剂,快速充分的研磨提取1-4 min,然后再加入等量
    的有机溶剂,浸提1-5 min,收集所有浸提液;
    3)将浸提液加入分离柱中,利用有机溶剂洗脱,收集所有洗脱液,浓缩,保存备用;
    4)对浓缩洗脱液进行GC-MS 分析。
    2.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于:步骤1)中,实蝇幼虫为2-3龄的实蝇幼
    虫。
    3.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于:步骤1)中,将实蝇幼虫沿着背侧线从
    头部将整个虫体剪开,采用镊子直接将内含物拖出的方法去除虫体内含物。
    4.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于:步骤1)中,将实蝇幼虫沿着背侧线从
    腹末肛门处将整个虫体剪开,采用扁头镊子刮去内含物的方法去除虫体内含物。
    5.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于:步骤1)中,去除虫体内含物后,还需挤
    压幼虫表皮,尽可能除尽游离的脂肪体。
    6.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于:步骤2)中取1-3头实蝇幼虫表皮添加
    适量有机溶剂。
    7.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于:步骤2)中,有机溶剂的添加量为每头
    实蝇幼虫添加0.5-3ml的有机溶剂。
    8.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于:步骤2)和步骤3)中,有机溶剂包括正
    己烷、正戊烷。
    9.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于:步骤3)中,分离柱中的固定相为硅镁
    型吸附剂和无水硫酸钠按照质量比为(2-5):(1-3)混合得到。
    10.根据权利要求1所述的分析方法,其特征在于:步骤3)中,浓缩采用高纯氮气将洗脱
    液吹干后再添加适量有机溶剂溶解,得到浓缩后的洗脱液。

    说明书

    一种实蝇幼虫表皮碳氢化合物组分的分析方法

    技术领域

    本发明属于检验检疫领域,具体涉及一种实蝇幼虫表皮碳氢化合物组分的分析方
    法。

    背景技术

    实蝇类昆虫繁殖力强、危害隐蔽且严重,是一类重要的检疫性昆虫,备受国内外检
    疫部门关注。准确快速地识别实蝇,对口岸果蔬快速通关及阻止其入侵,避免农业生产受到
    重大经济损失具有重大意义。

    在口岸检疫过程中,对昆虫的鉴定主要以传统形态学鉴定技术为主,一般通过昆
    虫分类最基本和可靠的特征,例如,形态和大小、色泽、斑纹和刻纹等,直接用眼睛或借助光
    学显微镜观察。传统形态学鉴定的缺点在于:由于实蝇的生活环境不同,实蝇的生态特征,
    如斑纹、颜色等也随之发生变化,给形态学鉴定带来了困难甚至错误,对一些隐种不能很好
    地鉴定区分,而且形态学上的鉴定需要专门的人员才能完成。同时,从受害的瓜果中截获到
    的实蝇多数是卵、幼虫和蛹,而多数的实蝇的卵,幼虫和蛹在形态学上无明显差别,难以鉴
    定到种。因此检疫部门只能将截获到的实蝇饲养到成虫后,才可能基于其形态鉴别特征确
    定其种类。显然,这一检疫程序费时耗力,难以满足进口瓜果快速鉴定通关的要求,同时也
    影响了下一步应急快速反应,预警测报和防治的效果。

    除了使用形态学鉴定技术外,还可以通过分子生物学手段,如同工酶电泳技术、限
    制性片段长度多态性标记技术、随机扩增多态性DNA技术、核酸序列及微卫星DNA分析等技
    术。分子生物学手段缺点在于:利用这些方法存在着许多的缺陷,例如使用同工酶电泳技术
    时,其结果的重现性差,而且样品酶易受昆虫发育阶段和保存条件的影响。对于一些实蝇的
    复合种或隐种的鉴定,分子生物学手段就存在着一些局限性,其能否对复合种进行鉴定还
    未见报道。此外,进行分子生物学实验时需要进行大量的准备工作,操作复杂,而且费用相
    对较高。

    最后,还有利用昆虫表皮碳氢化合物作为昆虫分类工具对昆虫进行鉴定。

    昆虫的表皮碳氢化合物的组成具有种的特异性,不同昆虫所产生的表皮碳氢化合
    物不同,是昆虫的独立和特异的表型特征。与形态分类特征相比,作为生化特征的表皮碳氢
    化合物是对生命本质不同侧面的反映,具有很高的多态性可供选择,是形态学鉴定的补充,
    尤其适用于形态相似的近缘种和隐种的鉴定。利用昆虫表皮碳氢化合物鉴定昆虫有其独特
    的优势,①不受实验样品的限制,新鲜、干燥或冷冻标本均用于分析;②整体浸泡不损坏昆
    虫的外部形态,可以继续保存标本;③提取液性质稳定,保存时间对实验结果无影响;④实
    验条件较简单,费用相对较低,实验周期短,实用性高。

    利用气相色谱质谱联用(GC-MS)技术,对昆虫表皮碳氢化合物(CHCs)进行分析,通
    过对CHCs的组分与含量的分析,找出特有峰来区分不同种的实蝇,并且建立相应的指纹图
    谱,可以在检验检疫过程中提供快速的鉴定方法。

    分析昆虫表皮碳氢化合物最常用的两种方法为有机溶剂浸提法和固体进样法。

    现有技术中,有机溶剂浸提法分析实蝇幼虫表皮碳氢化合物时多采用有机溶剂正
    己烷直接浸泡过夜提取,然后进行GC-MS分析,但是这种方法能萃取出的化合物的种类和含
    量偏少,特别是一些含量较少的物质尚无法检测出,其结果不能真正反映幼虫表皮的化合
    物特征属性。此外,现有技术中的取样浸提方法不仅操作复杂、耗时、不环保,难以提取出表
    皮碳氢化合物,而且提取的时间很难掌握,如果提取时间太短,由于表皮水分的封锁,不能
    充分地提取昆虫体表较深层的碳氢化合物;如果提取时间过长,由于昆虫体内物质经由口
    器或肛门逸出,可能把体内的物质也提取出来,两种情况都会影响检测结果。

    固体进样法通常被用于食品农残检测或挥发性气体测定等。我们此前已经报道了
    利用固体进样法对桔小实蝇成虫表皮碳氢化合物的图谱分析(“一种可用于桔小实蝇表皮
    碳氢化合物分析的固体进样技术”,昆虫学报,2016,59(3):278-291),探讨了利用桔小实蝇
    成虫附肢或虫体的头、胸、腹部等作为固体进样样品的可操作性。但口岸截获的实蝇类昆虫
    多为钻蛀果蔬并在其内为害的幼虫,而目前对于实蝇幼虫的鉴定,仍存在技术问题,即使实
    蝇分类学家也不能准确对幼虫做出鉴定,因此在多数情况下需将其饲养至成虫,再根据成
    虫形态特征进行种类鉴定,或者借助分子生物学技术。采用固体进样法,则幼虫体内的物质
    容易污染色谱柱,同时也影响物质的分析,此外只取幼虫部分表皮并不能反应整个虫体的
    化合物特征。

    因此,实蝇幼虫鉴定技术的缺乏,使得检验检疫过程中鉴定的时效性受到影响。

    发明内容

    本发明的目的在于提供一种实蝇幼虫表皮碳氢化合物组分的分析方法。

    本发明所采取的技术方案是:

    一种实蝇幼虫表皮碳氢化合物组分的分析方法,包括下列步骤:

    1)将实蝇幼虫沿着背侧线从头部或腹末肛门处将整个虫体剪开,去除虫体内含物,漂
    洗干净,得到实蝇幼虫表皮;

    2)取实蝇幼虫表皮添加适量有机溶剂,快速充分的研磨提取1-4min,然后再加入等量
    的有机溶剂,浸提1-5min,收集所有浸提液;

    3)将浸提液加入分离柱中,利用有机溶剂洗脱,收集所有洗脱液,浓缩,保存备用;

    4)对浓缩洗脱液进行GC-MS分析。

    本发明方法适用于实蝇所有种类的幼虫,其中,包括桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、
    木瓜实蝇、番石榴实蝇等幼虫。

    优选的,步骤1)中,实蝇幼虫为2-3龄的实蝇幼虫。

    优选的,步骤1)中,将实蝇幼虫沿着背侧线从头部将整个虫体剪开,采用镊子直接
    将内含物拖出的方法去除虫体内含物。

    优选的,步骤1)中,将实蝇幼虫沿着背侧线从腹末肛门处将整个虫体剪开,采用扁
    头镊子刮去内含物的方法去除虫体内含物。

    虫体内含物包括嗉囊、前胃、中肠、马氏管、后肠等。幼虫体内的物质容易污染色谱
    柱,同时也影响表皮物质的分析,采用本发明的方法可以较好地去除虫体内含物。

    优选的,步骤1)中,去除虫体内含物后,还需挤压幼虫表皮,尽可能除尽游离的脂
    肪体。

    优选的,步骤1)中漂洗时采用镊子夹着虫体,用洗瓶冲洗后,再置于培养皿中用蒸
    馏水漂洗干净,得到实蝇幼虫表皮。

    本发明采用去除内含物、挤压幼虫表皮,并进一步漂洗干净的方法,基本可以将幼
    虫体内的物质去除干净。如果还有微量的残留物,可以通过本发明后续的过柱处理来去除。

    优选的,步骤2)中取1-3头实蝇幼虫表皮添加适量有机溶剂。

    优选的,步骤2)中取1头实蝇幼虫表皮添加适量有机溶剂。

    优选的,步骤2)中,有机溶剂的添加量为每头实蝇幼虫添加0.5-3ml的有机溶剂。

    本发明的技术优势在于单头幼虫即可供鉴定,实验所需的材料成本大大降低,而
    且时间缩短。

    优选的,步骤2)和步骤3)中,有机溶剂包括正己烷、正戊烷。

    优选的,提取和洗脱的所用的有机溶剂一致。

    优选的,步骤2)中,研磨时所使用的研钵的材质包括陶瓷,玻璃和玛瑙,研磨时适
    当遮盖,以防有机溶剂挥发。

    优选的,步骤3)中,分离柱中的固定相为硅镁型吸附剂和无水硫酸钠按照质量比
    为(2-5):(1-3)混合得到。

    优选的,步骤3)中,分离柱中的固定相为硅镁型吸附剂和无水硫酸钠按照质量比
    为3:2混合得到。

    本发明中最少仅需取1头实蝇的表皮碳氢化合物进行分析即可,所添加的溶剂不
    超过10ml,这里所搭配的分离柱管长为100mm,分离柱中的固定相为硅镁型吸附剂和无水硫
    酸钠按质量比混合,其中硅镁型吸附剂0.3g,无水硫酸钠0.2g。

    过柱是为了去除有机溶剂提取出的一些非碳氢化合物的物质。我们优选出的固定
    相不会对碳氢化合物产生影响,如果利用其他类型的固定相,可能会吸附碳氢化合物,影响
    实验结果。

    优选的,步骤3)中,浓缩采用高纯氮气将洗脱液吹干后再添加适量有机溶剂溶解,
    得到浓缩后的洗脱液。

    优选的,步骤3)中,保存于-20度或-70度,时间不超过3d。

    本发明的有益效果是:

    本方法将活体实蝇幼虫去除内脏,再进行研磨提取及过柱处理,这样不仅可以增加有
    机溶剂与昆虫表皮碳氢化合物的接触面积,提高萃取碳氢化合物的质量,获得了直接浸提
    方法所无法分离出的成分,能够检测出更多种类的碳氢化合物,以便对其更精确的研究和
    分析。

    本发明方法改良了现有技术中关于实蝇幼虫表皮碳氢化合物组分的分析方法,使
    得整个检测时间从原来的12-24h缩短到2-3h,大大增强了时效性。此外,本发明方法可以浸
    提获得种类更多的表皮碳氢化合物组分,为进一步鉴定实蝇的种类尤其是近缘种提供更为
    详实而可靠的数据支持。

    现有技术利用溶剂浸泡的方法所使用的实蝇幼虫量通常较多。本发明中最少仅需
    取1头实蝇的表皮碳氢化合物进行分析即可,所添加的溶剂不超过10ml,大大降低实验所需
    的人力物力。

    本发明中,固定相为硅镁型吸附剂和无水硫酸钠按照质量比为(2-5):(1-3)混合
    得到,通过过柱的方法,可以充分去除有机溶剂提取出的一些非碳氢化合物的物质,而且不
    会对碳氢化合物产生任何影响。正是由于充分去除内脏等内含物的影响,在分析样品时,可
    以获得更为精确的实验结果,同时起到?;ど字淖饔?,间接的延长了色谱柱的使用寿
    命。

    本发明方法可用于海关等部门的实蝇快速检验检疫,实蝇近缘种的鉴定,以及实
    蝇幼虫系统发育关系研究。本方法具有实验操作简便,费用少,时效性高的优点,可为检验
    检疫过程中提供快速的鉴定技术,满足进口瓜果快速鉴定通关的要求,是近年来昆虫分类
    方法的完善和补充。

    附图说明

    图1为GC-MS分析结果;

    图2为GC-MS分析结果;

    图3为GC-MS分析结果;

    图4为GC-MS分析结果;

    图5为GC-MS分析结果;

    图6为GC-MS分析结果;

    图7为GC-MS分析结果;

    图8为GC-MS分析结果;

    上述图片均为经过m/z=57特征离子提取之后的图。

    具体实施方式

    下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明,但并不局限于此。

    其中,实施例1、实施例2和实施例4的实蝇同为镞果实蝇亚属,实施例3的实蝇为离
    腹寡毛属。

    实施例1

    材料:南瓜实蝇(镞果实蝇亚属)老熟幼虫(活虫);由卵孵化5-7d,3龄。

    1.样品制备:

    步骤1:幼虫去除内脏:取实蝇幼虫若干头置于培养皿内,用无菌水漂洗3次,将虫体表
    面漂洗干净。置于带水培养皿内,防止其逃逸,并于4℃条件下暂存备用(建议不超过1-2h)。
    取一头幼虫,在体视显微镜下(10×目镜,再调至图像清晰),利用尖头镊子固定虫体,然后
    用手术解剖剪刀沿幼虫的背侧线剪开,去除虫体内含物(包括嗉囊、前胃、中肠、马氏管、后
    肠等),用镊子轻轻挤压表皮,尽可能除尽游离的脂肪体,用镊子夹着虫体,用洗瓶冲洗后,
    再置于培养皿中用无菌水反复漂洗5次,得到实蝇幼虫表皮。

    步骤2:研磨:将1头幼虫表皮置于直径为5cm的陶瓷研钵(研钵用色谱纯正己烷浸
    泡1h后取出,烘干)中,在通风橱内,加入色谱纯正己烷(西格玛)1ml,快速充分的研磨提取
    1min,以增加有机溶剂与表皮的接触面积。之后再加入1ml正己烷,浸提1min,收集所有浸提
    液。

    步骤3:过柱处理:将浸提液倒入自制的分离柱(固定相:硅镁型吸附剂0.3g,无水
    硫酸钠0.2g)中,以2ml正己烷洗脱,去除残留于正己烷中的油脂类杂质,收集所有洗脱液,
    在高纯氮气中浓缩至20μl,将浸提液移至150μL玻璃内插管(安捷伦公司,美国),再将内插
    管放入1.5mL进样瓶中,拧紧瓶盖置于-20℃保存备用。

    2.分析:采用Combi PAL自动进样器(CTC公司,瑞士)进样,每个供试样品进样2μl。
    在自动进样过程中,以正己烷为清洗溶剂,分别在进样前后清洗进样针3次和2次。供试样品
    利用气相色谱GC7890A-质谱MS-5975C联用仪(安捷伦公司,美国)分析,色谱柱为石英毛细
    管柱HP-5MS(30m×0.25mm×0.25μm);起始温度为50℃,以22℃/min升至270℃,再以2℃/
    min升至300℃,保留5min。载气为高纯氦气,载气流速1mL/min,柱头压为7.652psi。电子轰
    击离子源(EI),电子能量70eV,离子源温度230℃,四极杆温度150℃,扫描范围50~550amu。
    进样口温度290℃,不分流模式。溶剂延迟3min。

    对照用现有技术中使用正己烷直接浸泡过夜提取南瓜实蝇幼虫表皮碳氢化合物,
    进行GC-MS分析结果。结果见图1和图2。

    图1为对照,即采用现有技术使用正己烷直接浸泡过夜提取南瓜实蝇表皮碳氢化
    合物的GC-MS分析结果。经过m/z=57的特征离子提取发现在保留时间13-19min内均未萃取
    出相应的化合物(注释:m/z=57是碳氢化合物的特征离子碎片,图1-6均为经过m/z=57特
    征离子提取之后的图),而保留时间在3-12min为非目标峰,因为前3-12min内出来的化合物
    分子量小,不稳定,不适合作为表皮碳氢化合物的种类的分析。

    图2为本发明的使用正己烷提取经去除内脏经研磨和过柱后的碳氢化合物的GC-
    MS分析(m/z=57特征离子提取)结果。与图1相比,图2显示,本发明的分析方法可以获得南
    瓜实蝇老熟幼虫的表皮化合物,其中保留时间在3-12min为非目标峰。在保留时间13-19min
    时的碳氢化合物峰值增高、种类多。此外,图2在保留时间13-19min萃取出的化合物为碳氢
    化合物,每一个峰代表一种或一类化合物。与图1相比,图2在保留时间13-19min萃取出的化
    合物种类增加,而且丰度较高,说明萃取出的量较大。

    实施例2

    材料:瓜实蝇(镞果实蝇亚属)老熟幼虫(活虫);由卵孵化5-7d,3龄。

    1.样品制备:

    步骤1:幼虫去除内脏:取实蝇幼虫若干头置于培养皿内,用无菌水漂洗3次,将虫体表
    面漂洗干净。置于带水培养皿内,防止其逃逸,并于4℃条件下暂存备用(建议不超过1-2h)。
    取1头幼虫,在体视显微镜下(10×目镜,再调至图像清晰),利用尖头镊子固定虫体,然后用
    手术解剖剪刀沿幼虫的背侧线剪开,用扁头镊子刮去虫体内含物(包括嗉囊、前胃、中肠、马
    氏管、后肠等),用镊子轻轻挤压表皮,尽可能除尽游离的脂肪体,用镊子夹着虫体,用洗瓶
    冲洗后,再置于培养皿中用无菌水反复漂洗5次,得到实蝇幼虫表皮。

    步骤2:研磨:将2头幼虫表皮置于直径为5cm的陶瓷研钵(研钵用色谱纯正己烷浸
    泡1h后取出,烘干)中,在通风橱内,加入色谱纯正己烷(西格玛)1.6ml,快速充分的研磨提
    取2min,以增加有机溶剂与表皮的接触面积。之后再加入1ml正己烷,浸提1min,收集所有浸
    提液。

    步骤3:过柱处理:将浸提液倒入自制的分离柱(固定相:硅镁型吸附剂0.5g,无水
    硫酸钠0.2g)中,以3ml正己烷洗脱,去除残留于正己烷中的油脂类杂质,收集所有洗脱液,
    利用高纯氮气沿着瓶口吹,形成气旋加快吹干,待吹干后重新加入20μl的有机溶剂,溶解,
    得到浓缩洗脱液,将浸提液移至150μL玻璃内插管(安捷伦公司,美国),再将内插管放入
    1.5mL进样瓶中,拧紧瓶盖置于-20℃保存备用。

    2、分析方法同“实施例1”。

    对照用现有技术中使用正己烷直接浸泡瓜实蝇老熟幼虫过夜,提取得到表皮碳氢
    化合物,进行GC-MS分析结果。结果见图3和图4。

    图3为对照,即采用现有技术使用正己烷直接浸泡过夜提取瓜实蝇幼虫表皮碳氢
    化合物的GC-MS分析结果。经过m/z=57特征离子提取发现在保留时间13-19min内均未萃取
    出相应的化合物,而保留时间在3-12min为非目标峰。

    图4为本发明使用正己烷提取经去除内脏经研磨和过柱后的碳氢化合物的GC-MS
    分析(m/z=57特征离子提取)结果。

    与图3相比,图4中本发明的分析方法可以获得南瓜实蝇老熟幼虫的表皮化合物,
    其中保留时间在3-12min为非目标峰,在保留时间13-19min时的碳氢化合物峰值增高、种类
    多。图4在保留时间13-19min萃取出的化合物均为碳氢化合物,每一个峰代表一种或一类化
    合物。与图3相比,图4在保留时间13-19min萃取出的化合物种类增加,而且丰度较高,说明
    萃取出的量较大。

    实施例3

    材料:桔小实蝇(离腹寡毛属)老熟幼虫(活虫);由卵孵化5-7d,3龄。

    1、样品制备:

    步骤1:幼虫去除内脏:取实蝇幼虫若干头置于培养皿内,用无菌水漂洗3次,将虫体表
    面漂洗干净。置于带水培养皿内,防止其逃逸,并于4℃条件下暂存备用(建议不超过1-2h)。
    取1头幼虫,在体视显微镜下(10×目镜,再调至图像清晰),利用尖头镊子固定虫体,然后用
    手术解剖剪刀沿幼虫的背侧线从头部将整个虫体剪开,利用镊子直接将内含物拖出来去除
    虫体内含物(包括嗉囊、前胃、中肠、马氏管、后肠等),用镊子轻轻挤压表皮,尽可能除尽游
    离的脂肪体,用镊子夹着虫体,用洗瓶冲洗后,再置于培养皿中用无菌水反复漂洗5次,得到
    实蝇幼虫表皮。

    步骤2:研磨:将1头幼虫表皮置于直径为5cm的陶瓷研钵(研钵用色谱纯正己烷浸
    泡1h后取出,烘干)中,在通风橱内,加入色谱纯正己烷(西格玛)1.5ml,快速充分的研磨提
    取1min,以增加有机溶剂与表皮的接触面积。之后再加入1.5ml正己烷,浸提1min,收集所有
    浸提液。

    步骤3:过柱处理:将浸提液倒入自制的分离柱(固定相:硅镁型吸附剂0.4g,无水
    硫酸钠0.3g)中,以2ml正己烷洗脱,去除残留于正己烷中的油脂类杂质,收集所有洗脱液,
    在高纯氮气中浓缩至20μl,将浸提液移至150μL玻璃内插管(安捷伦公司,美国),再将内插
    管放入1.5mL进样瓶中,拧紧瓶盖置于-20℃保存备用。

    2、分析方法同“实施例1”。

    对照用现有技术中使用正己烷直接浸泡桔小实蝇老熟幼虫过夜,提取得到表皮碳
    氢化合物,进行GC-MS分析(m/z=57特征离子提取)结果。结果见图5和图6。

    图5为对照,即采用现有技术使用正己烷直接浸泡过夜提取桔小实蝇幼虫表皮碳
    氢化合物的GC-MS分析结果。经过m/z=57特征离子提取发现在保留时间13-19min内均未萃
    取出相应的化合物,而保留时间在3-12min为非目标峰。

    图6为本发明使用正己烷提取经去除内脏经研磨和过柱后的碳氢化合物的GC-MS
    分析结果。

    与图5相比,图6中本发明的分析方法可以获得桔小实蝇老熟幼虫的表皮化合物,
    其中保留时间在3-12min为非目标峰,在保留时间13-19min时的碳氢化合物峰值增高、种类
    多。图6在保留时间13-19min萃取出的化合物均为碳氢化合物,每一个峰代表一种或一类化
    合物。与图5相比,图6在保留时间13-19min萃取出的化合物种类增加,而且丰度较高,说明
    萃取出的量较大。

    对实施例1-3的实蝇幼虫的表皮碳氢化合物进行综合分析。根据本专利方法获得
    的色谱图(图2、4和6)可知,三种实蝇的幼虫表皮碳氢化合物主要集中在13-19min,具体结
    果见表1。并且可以根据这段时间出现的色谱峰的保留时间及色谱峰的峰面积大小来区分
    三种实蝇幼虫(表1)。

    表1三种实蝇幼虫表皮碳氢化合物组成


    注:各色谱峰的百分含量以means±SE表示,“—”表示未检测到该物质。"Me"表示单甲
    基,"diMe"表示二甲基。

    表1结果显示,保留时间为15.993min的正三十烷烃只出现在桔小实蝇的幼虫中,
    并且保留时间为17.318min的正三十一烷烃在桔小实蝇中占50%左右,而在南瓜实蝇和瓜
    实蝇中占6.54-8.34%。而保留时间为15.696的3-甲基二十九烷烃在南瓜实蝇的含量比瓜
    实蝇中高约2倍。说明实蝇亚属之间,其幼虫的表皮碳氢化合物存在差异,优势碳氢化合物
    的种类和含量都有区别,所以可以根据保留时间在13-19min的色谱峰的保留时间及色谱峰
    的峰面积大小来区分三种实蝇幼虫。

    实施例4重复性实验

    用本专利的方法(实施例1和实施例2),分析了采自海南的南瓜实蝇(图7)和瓜实蝇(图
    8)幼虫表皮碳氢化合物,结果见图7和图8。

    将图7的结果与图2(实施例1)的结果进行比较,将图8的结果与图4(实施例2)进行
    比较,经过分析可知,不同产地所获得的同种亚属的实蝇,其表皮碳氢化合物相当稳定,通
    过特征离子提取之后,获得的各碳氢化合物的种类和含量几乎一致。

    由以上实施例可知,本发明方法通过对样品制备方法的改进,使实验周期缩短,通
    过去除内脏去除了大部分的幼虫体内的物质对分析的影响,经过充分的研磨,可以加大了
    有机溶剂与表皮的接触面积;提取完后,再对溶解物进行过柱处理,可以进一步的去除昆虫
    体内的内含物影响,能够提取出常规方法无法提取出的表皮碳氢化合物种类,且样品过柱
    纯化,进一步减少了样品中含有的杂质,起到?;て嗌滓侵猩字淖饔?。

    上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的
    限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,
    均应为等效的置换方式,都包含在本发明的?;し段е?。

    关于本文
    本文标题:一种实蝇幼虫表皮碳氢化合物组分的分析方法.pdf
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