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    重庆时时彩计划软件王: 一种利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法及其应用.pdf

    关 键 词:
    一种 利用 夹心 法定 测定 蛋白 方法 及其 应用
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    摘要
    申请专利号:

    CN201611104709.1

    申请日:

    2016.12.05

    公开号:

    CN106771234A

    公开日:

    2017.05.31

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/68申请日:20161205|||公开
    IPC分类号: G01N33/68 主分类号: G01N33/68
    申请人: 广州华弘生物科技有限公司
    发明人: 邹伟权
    地址: 510530 广东省广州市高新技术产业开发区科学城伴河路84号自编二栋101
    优先权:
    专利代理机构: 北京精金石专利代理事务所(普通合伙) 11470 代理人: 刘晔
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201611104709.1

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.06.23|||2017.05.31

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法及其应用,属于蛋白分析技术领域。所述检测方法以包被后Ngb单克隆抗体于ELISA检测板上作为固相抗体,以生物素标记的Ngb多克隆抗体作为酶标抗体,使HRP通过与其偶联的Avidin与多克隆抗体上的生物素结合,经TMB显色,在450nm单波长处测定吸收值,可以实现Ngb蛋白的定量检测。该方法采用双抗体夹心ABC法,同时具有高特异性和高灵敏度。使用该方法可以准确检测视网膜组织中Ngb蛋白含量,从而评估LED光源照明对视网膜光损伤程度。

    权利要求书

    1.一种利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法,所述检测方法包括:以包被于ELISA
    检测板上的Ngb单克隆抗体作为固相抗体,以生物素标记的Ngb多克隆抗体作为酶标抗体,
    通过显色剂-Avidin与多克隆抗体上的生物素结合使显色剂通过与其偶联的Avidin与多克
    隆抗体上的生物素结合,经显色,以定量检测实现Ngb蛋白。
    2.如权利要求1所述的利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法,所述的检测方法包
    括如下步骤:
    1)包被:将Ngb单克隆抗体用pH9.6的碳酸钠缓冲液稀释,37℃孵育4h后使用PBST洗涤4
    次;
    2)封闭:使用含5%BSA的PBS封闭液封闭,37℃孵育4h后使用PBST洗涤2次;
    3)捕获抗原:抗原稀释至合适浓度,同时使用PBS作为阴性对照,37℃孵育1h后使用
    PBST洗涤4次;
    4)加入二抗:将生物素化的Ngb多克隆抗体稀释后加入到反应孔中,37℃孵育1h后洗
    涤;
    5)酶标二抗:将购买的商业化HRP-Avidin稀释1.5万倍后加入到反应孔中,37℃孵育
    50min后洗涤;
    6)显色:向反应孔中加入TMB,室温或37℃反应5-30min,显色完毕后加入H2SO4终止反
    应,于20min内在450nm单波长处测定吸收值。
    3.如权利要求2所述的利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法,其具体包括如下步
    骤:
    1)包被:将Ngb单克隆抗体用pH9.6的碳酸钠缓冲液稀释至10μg/ml,每孔加入100μl,37
    ℃孵育4h后按照如下方法洗涤,弃去孔中液体,用PBST洗4次,每次2分钟,甩去孔内液体后
    在吸水纸上拍干;
    2)封闭:每孔加200μl含5%BSA的PBS封闭液封闭,37℃孵育4h按照如下方法进行洗涤,
    PBST洗2次,每次2分钟,甩去孔内液体后在吸水纸上拍干;
    3)捕获抗原:抗原稀释至合适浓度,每孔100μl加入到对应孔中,阴性对照加100μl
    PBS,37℃孵育1h,按照步骤1)所述方法洗涤;
    4)加入二抗:将生物素化的Ngb多克隆抗体稀释至2μg/ml,每孔各加100μl,37℃孵育
    1h,按照步骤2)所述方法洗涤;
    5)酶标二抗:将购买的商业化HRP-Avidin稀释1.5万倍,每孔各加100μl,37℃孵育
    50min,按照步骤1)所述方法洗涤;
    6)显色检测:每孔加100μl TMB,室温或37℃反应5-30min,显色完毕后,每孔立即加入
    100μl 2M H2SO4终止反应,于20min内检测在450nm单波长处测定吸收值。
    4.如权利要求1所述的一种定量测定样品中Ngb蛋白含量的方法,其特征在于,其具体
    由如下操作步骤组成:
    1)绘制Ngb蛋白-吸光度标准曲线:将Ngb标准蛋白进行梯度稀释后作为抗原,根据权利
    要求2或3所述的方法测定Ngb标准蛋白不同浓度下反应液在450nm下的吸光度,绘制Ngb蛋
    白-吸光度标准曲线;
    2)样品中Ngb蛋白含量的测定:将样品稀释至合适浓度后作为抗原,根据上述方法测定
    样品反应液在450nm下的吸光度,将吸光度代入Ngb蛋白-吸光度标准曲线推算Ngb蛋白浓
    度,并进而计算样品中Ngb蛋白含量的测定。
    5.如权利要求1-4任一所述的一种定量测定样品中Ngb蛋白含量的方法,其特征在于,
    所述的Ngb的多克隆抗体是利用纯化的Ngb蛋白免疫新西兰大白兔获得。
    6.权利要求1所述的定量测定样品中Ngb蛋白含量的方法在评估视网膜光损伤中的应
    用。
    7.如权利要求6所述的应用,其特征在于,所述的视网膜光损伤为LED光源导致。

    说明书

    一种利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法及其应用

    技术领域

    本发明涉及一种利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法及其应用,具体涉及一
    种基于ELISA检测手段定量检测视网膜脑红蛋白表达水平变化及其用于评估LED光源致视
    网膜光损伤程度的应用,属于蛋白分析技术领域。

    背景技术

    发光二极管(LED)是一种将电能直接转化为可见光的固态半导体。与钨灯不同,
    LED灯利用蓝光激发荧光粉来产生白光,因此它们含有有害成分极高的可见光谱。由于短波
    谱(400-500nm)尤其危险,LED照明灯比其他任何光源更有可能导致视网膜光化学损伤。然
    而,很少有关于视网膜LED光损伤的生物标记物的研究。目前研究比较成熟的光损伤生物标
    志物是视紫红质,这是由于氧化应激时视网膜光化学损伤的一个重要机制,蓝光照射显著
    增加在视网膜细胞内线粒体超氧化物自由基的产生,视紫红质的漂白通过氧化应激引起损
    伤。此外,科学家基于蓝光通过视紫红质诱导视网膜变性的研究,发现当敲除视紫红质基因
    时,视网膜上没有损害发生。因而视紫红质作为光损伤生物标志物具有一定的优势,然而由
    于视紫红质很不稳定,而且浓度可能过低使其难以成为理想的光损伤标记物,其检测限以
    及检测准确度病不能令人满意。目前而言,寻找一个可靠的光损伤标记物已经成为该治疗
    领域中一个重要的研究方向,也是行业亟需。

    脑红蛋白Neuroglobin(简称Ngb,译为脑红蛋白),为新近发现的脑组织、神经元特
    异表达的含血卟啉结构的血红蛋白家族成员。与已知的血红蛋白(hemoglobin)、肌红蛋白
    (myoglobin)的最大不同是脑红蛋白所含的血红素为六配位键,而非五配位键结构。脑红蛋
    白(Ngb)是一个在神经元内特异性表达的蛋白,它显示为一个对氧有高亲和力的典型球蛋
    白。Ngb的结构特点、配体结合属性和神经元特异性表达表明它在神经组织的氧气内稳态中
    发挥重要作用。

    有研究表明Ngb在视网膜上的浓度比大脑高出100倍,相当于肌肉中肌红蛋白的含
    量。在视网膜神经核层与神经节层的核周体中检测到Ngb的mRNA,而蛋白质主要在网状层
    (PLs)和光感受器出现。这独特的分布可能与线粒体的亚细胞定位和相对氧的要求相关,因
    为视网膜的视觉性能需要大量的氧气来维持由突触传递的光传导。即使具体的机制仍不清
    楚,但集聚的Ngb提示着其在视觉生理周期起着至关重要的作用。另有研究显示,Ngb在视网
    膜上有着抗凋亡的?;すδ?。一个研究在青光眼模型检测Ngb,结果表明,Ngb增加了视网膜
    细胞的抗氧化能力和Ngb的过度表达可以降低眼内压力相关的过氧化物产生。在急性缺血
    视网膜损伤模型中Ngb也迅速增加。Ngb似乎是疾病早期阶段的指标。另一个调查显示,Ngb
    的过度表达与减少线粒体DNA的损伤、保存的视网膜厚度、减少半胱天冬酶3蛋白的激活和
    Ngb-Tg老鼠的细胞凋亡有关。Lechauve等人表明,通过对老鼠的眼睛进行电穿孔来敲除体
    内Ngb表达会对视网膜结构和功能造成有害影响,包括神经纤维密度的减少和视觉功能的
    损害。

    因此,基于Ngb蛋白的LED光源致视网膜光损伤ELISA检测一方面为生活中LED的广
    泛应用的带来的潜在视网膜光损伤提供一个新的参考指标和检测工具;另一方面为全面揭
    示Ngb蛋白的病理意义以及与视网膜疾病的关系的研究提供了一个新手段。蛋白检测方法
    相对于核酸检测法,避免了蛋白表达的时空调控导致的误差,具有更直接准确的优势。

    发明内容

    本发明的目的在于提供一种利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法,并用于评
    价LED光源致视网膜光损伤的方法。

    本发明提供一种利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法,所述检测方法包括:
    以包被于ELISA检测板上的Ngb单克隆抗体作为固相抗体,以生物素标记的Ngb多克隆抗体
    作为酶标抗体,通过显色剂-Avidin与多克隆抗体上的生物素结合使显色剂通过与其偶联
    的Avidin与多克隆抗体上的生物素结合,经显色,以定量检测实现Ngb蛋白,所述的检测方
    法的检测原理如附图1所示。

    在一个具体的实施方案中,所述利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法具体包
    括如下步骤:

    1)包被:将Ngb单克隆抗体用pH9.6的碳酸钠缓冲液稀释,37℃孵育4h后使用PBST
    洗涤4次;

    2)封闭:使用含5%BSA的PBS封闭液封闭,37℃孵育4h后使用PBST洗涤2次;

    3)捕获抗原:抗原稀释至合适浓度,同时使用PBS作为阴性对照,37℃孵育1h后使
    用PBST洗涤4次;

    4)加入二抗:将生物素化的Ngb多克隆抗体稀释后加入到反应孔中,37℃孵育1h后
    洗涤。

    5)酶标二抗:将购买的商业化HRP-Avidin稀释1.5万倍后加入到反应孔中,37℃孵
    育50min后洗涤。

    6)显色:向反应孔中加入TMB,室温或37℃反应5-30min,显色完毕后加入H2SO4终止
    反应,于20min内在450nm单波长处测定吸收值。

    作为上述检测方法所优选的一种实施方式,所述的利用双抗夹心法定量测定脑红
    蛋白的方法具体包括如下步骤:

    1)包被:将Ngb单克隆抗体用pH9.6的碳酸钠缓冲液稀释至10μg/ml,每孔加入100μ
    l,37℃孵育4h后按照如下方法洗涤,弃去孔中液体,用PBST洗4次,每次2分钟,甩去孔内液
    体后在吸水纸上拍干;

    2)封闭:每孔加200μl含5%BSA的PBS封闭液封闭,37℃孵育4h按照如下方法进行
    洗涤,PBST洗2次,每次2分钟,甩去孔内液体后在吸水纸上拍干;

    3)捕获抗原:抗原稀释至合适浓度,每孔100μl加入到对应孔中,阴性对照加100μl
    PBS,37℃孵育1h,按照步骤1)所述方法洗涤;

    4)加入二抗:将生物素化的Ngb多克隆抗体稀释至2μg/ml,每孔各加100μl,37℃孵
    育1h,按照步骤2)所述方法洗涤;

    5)酶标二抗:将购买的商业化HRP-Avidin稀释1.5万倍,每孔各加100μl,37℃孵育
    50min,按照步骤1)所述方法洗涤;

    6)显色检测:每孔加100μl TMB,室温或37℃反应5-30min,显色完毕后,每孔立即
    加入100μl 2M H2SO4终止反应,于20min内检测在450nm单波长处测定吸收值。

    一种定量测定样品中Ngb蛋白含量的方法,其具体包括如下步骤:

    1)绘制Ngb蛋白-吸光度标准曲线:将Ngb标准蛋白进行梯度稀释后作为抗原,根据
    上述方法测定Ngb标准蛋白不同浓度下反应液在450nm下的吸光度,绘制Ngb蛋白-吸光度标
    准曲线;

    2)样品中Ngb蛋白含量的测定:将样品稀释至合适浓度后作为抗原,根据上述方法
    测定样品反应液在450nm下的吸光度,将吸光度代入Ngb蛋白-吸光度标准曲线推算Ngb蛋白
    浓度,并进而计算样品中Ngb蛋白含量的测定。

    在一个具体的实施方案中,所述的Ngb的多克隆抗体是利用纯化的Ngb蛋白免疫新
    西兰大白兔获得。

    本发明还提供一种上述方法的应用,即所述的检测方法在评估视网膜光损伤中的
    应用,其中所述的视网膜光损伤为LED光源导致。在我们通过深入的研究发现LED光刺激上
    调了大鼠视网膜脑红蛋白的表达。我们发现在这个以前被认为是安全的蓝色的光照水平,
    没有造成视网膜细胞凋亡,脑红蛋白的表达量比对照组近2倍。第二,在2小时蓝光照射后,
    脑红蛋白表达上调更为明显且同时观察到了视网膜损伤。此外,蓝光照射1小时后表达增加
    两倍,但照射2小时时表达到约七倍。这样的差别暗示着蓝光本身强度的大小会导致脑红蛋
    白表达水平的巨大差别。最近的报告显示,脑红蛋白具有?;ど窬δ?,可能在本身的凋
    亡通路的早期事件起调节作用。在应激或病理状态下,增加的脑红蛋白水平的可能防止不
    适当的凋亡信号。它也同样可以在蓝光照射导致的视网膜损伤中起作用。有相当的Ngb表达
    改变过程在当视网膜被最初被蓝光损害发生之前。本发明的方法为LED光源致视网膜光损
    伤评估方法奠定基础。

    本发明双抗体夹心法与传统的ELISA检测方法相比,固相抗体可以捕获并富集抗
    原,产生放大作用,同时通过两个单克隆抗体的特异性选择,提高了特异性,所以该方法具
    有更高的特异性和灵敏性。且脑红蛋白作为视网膜光损伤的标志物用于检测时,其对于损
    伤的检测限度更低,可以很好确定视网膜光损伤的程度。

    附图说明

    图1:本发明的Ngb蛋白的检测方法的工作原理图。plate,检测板;Ab1,Ngb单克隆
    抗体;Ab2,Ngb多克隆抗体;Ag,待检测样品;Biotin,生物素;Avidin,抗生物素蛋白;HRP,辣
    根过氧化物酶。

    具体实施方式

    下面将结合附图和实施例,对本发明的具体实施方式做进一步详细描述。以下实
    施例将有助于说明本发明,但不以任何形式限制本发明。

    实施例1 Ngb单克隆抗体的制备

    1.1杂交瘤细胞的制备

    取1ml0.25g/L的Ngb蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后皮下注射于5只
    Balb/c小鼠。每间隔3周加强免疫1次,加强免疫时改用弗氏不完全佐剂,抗原量及注射途径
    不变。第2次加强免疫后7d取尾血测效价。融合前3d,经尾静脉注射同等剂量的抗原PBS溶液
    再加强免疫1次。分别收集免疫小鼠脾细胞和NS-1细胞以约1∶5的比例在50%PEG作用下按
    常规方法融合。融合后的细胞沉淀用2.5ml完全培养液轻悬加入22.5ml半固体培养基
    MediumD混匀后倒入直径3.5cm的平皿中,每个平皿约2ml,37℃,5%CO2培养。一周后肉眼可
    见平皿的培养基表面有白色斑点,显微镜下即为细胞克隆团。无菌条件下将平皿中分散的、
    单个的细胞团吸起放入96孔板培养液中,继续培养。96孔板中细胞长满后间接ELISA法进行
    检测,阳性孔用有限稀释法进行亚克隆。

    1.2Ngb单克隆抗体的制备与纯化:将杂交瘤细胞按2×105/ml接种于80ml培养瓶
    内,加入完全培养液培养。至细胞活性状态最佳,将细胞质数量调至约5×106。注射0.5ml液
    体石蜡至Balb/c小鼠腹腔7d后再注射1ml该浓度的杂交瘤细胞。7d后,小鼠腹部增大,收集
    腹水。2000r/min室温离心5min吸取上清。参照HiTrapproteinA亲和层析说明书进行腹水的
    抗体纯化即可得到Ngb单克隆抗体。

    实施例2生物素化的Ngb多克隆抗体制备与纯化

    2.1兔抗Ngb蛋白多克隆抗体的制备与提纯:纯化Ngb蛋白与完全福氏佐剂充分混
    匀,皮下多点免疫日本大耳兔,2周后,再与不完全福氏佐剂混匀,皮下加强免疫,1周后,收
    集血清,ELISA法检测抗体效价。免疫血清经饱和硫酸铵、50%硫酸铵、33%硫酸铵溶液盐析
    沉淀。盐析纯化后的免疫血清再经SephadexG25除盐纯化、DEAE-SephadexG-100柱层析纯
    化。

    2.2Ngb蛋白多克隆抗体与生物素的交联及纯化参照参考文献及试剂说明书进行,
    详细过程如下:①配制pH8.6、0.05mol/L硼酸盐缓冲液及含0.1%BSA的pH7.5PBS。②将纯化
    的Ngb蛋白多克隆抗体置硼酸盐缓冲液中,4℃透析过夜,并用该缓冲液调节抗体浓度至
    1mg/mL。③进行下列操作前将所有试剂从4℃移至室温平衡2h。④按每毫升抗体加80μg生物
    素计算加入生物素制剂,反应液的总体积不要超过2.5mL,置室温持续摇动1h,使Ngb蛋白多
    克隆抗体与生物素充分交联。⑤于室温用35mL含0.1%BSApH7.5的PBS平衡SephadexG-25层
    析柱。加上述反应样品2.5mL于层析柱上,并用含0.1%BSApH7.5的PBS洗脱,每管1mL收集洗
    脱液,测每管A280吸收值。收集第一洗脱峰,加入0.2%NaN3,4℃保存备用。

    实施例3一种利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法

    一种利用双抗夹心法定量测定脑红蛋白的方法,所述检测方法是按以下步骤进行
    的:

    1)包被:将Ngb单克隆抗体用pH9.6的碳酸钠缓冲液稀释至10μg/ml,每孔加入100μ
    l,37℃孵育4h后按照如下方法洗涤,弃去孔中液体,用PBST洗4次,每次2分钟,甩去孔内液
    体后在吸水纸上拍干;

    2)封闭:每孔加200μl含5%BSA的PBS封闭液封闭,37℃孵育4h按照如下方法进行
    洗涤,PBST洗2次,每次2分钟,甩去孔内液体后在吸水纸上拍干;

    3)捕获抗原:抗原稀释至合适浓度,每孔100μl加入到对应孔中,阴性对照加100μl
    PBS,37℃孵育1h,按照步骤1)所述方法洗涤;

    4)加入二抗:将生物素化的Ngb多克隆抗体稀释至2μg/ml,每孔各加100μl,37℃孵
    育1h,按照步骤2)所述方法洗涤;

    5)酶标二抗:将购买的商业化HRP-Avidin稀释1.5万倍,每孔各加100μl,37℃孵育
    50min,按照步骤1)所述方法洗涤;

    6)显色检测:每孔加100μl TMB,室温或37℃反应5-30min,显色完毕后,每孔立即
    加入100μl 2M H2SO4终止反应,于20min内检测在450nm单波长处测定吸收值。

    实例验证:将Ngb蛋白进行梯度浓度稀释,并设置阴性对照。按照上述方法进行检
    测,在450nm单波长处测定吸收值,结果表明该方法灵敏度可以达到0.1μg/ml,检测结果的
    XY散点图表明在450nm单波长处测定吸收值与蛋白浓度有很好的线性关系,结果准确,可重
    复性好。用此方法可以检测Ngb蛋白,为Ngb蛋白的定量检测及相关检测产品的开发奠定基
    础。

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