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    一种 快速 检测 蛋白 试剂盒
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    摘要
    申请专利号:

    CN201710042911.4

    申请日:

    2017.01.20

    公开号:

    CN106771152A

    公开日:

    2017.05.31

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/543申请日:20170120|||公开
    IPC分类号: G01N33/543; G01N33/577 主分类号: G01N33/543
    申请人: 深圳市汇松科技发展有限公司
    发明人: 李印军; 杨永崧; 吕典
    地址: 518000 广东省深圳市罗湖区国威路莲塘第一工业区114栋3楼
    优先权:
    专利代理机构: 深圳市康弘知识产权代理有限公司 44247 代理人: 胡朝阳;尹彦
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201710042911.4

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.06.23|||2017.05.31

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明提供了一种试剂盒,包括如下组分:含多聚物的缓冲液;以及结合抗人钙卫蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳溶液。采用该试剂盒检测钙卫蛋白时,具有以下优势:在使用时只需在两个时间点分别加入即可,操作非常方便快捷;灵敏度很高,保证能够检测到极低水平的钙卫蛋白;特异性强、重复性好且成本低;抗干扰能力强,即使检测样本中存在一定浓度的干扰物包括血红蛋白、胆红素、Vc、甘油三酯等,对本发明试剂盒的检测结果影响很小。本发明的试剂盒因具有以上优势,且能适应单人份、快速和即时出结果的定量检测,具有很高的临床应用价值。

    权利要求书

    1.组合物,其特征在于:包括如下组分:
    含多聚物的缓冲液;
    以及结合抗人钙卫蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳溶液;
    所述多聚物为Triton系列表面活性剂、Tween系列表面活性剂、月桂醚、聚氧乙烯烷基
    苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚和聚氧乙烯辛基苯醚中的至少一种;
    所述聚苯乙烯胶乳的颗粒直径为100-300nm。
    2.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于:
    所述含多聚物的缓冲液中,多聚体的质量占其总体积百分比为0.1%-5.0%;
    任选的,结合抗人钙卫蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳溶液的固含量w/v为0.5-5.0%。
    3.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于:
    所述结合抗人钙卫蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳溶液中的聚苯乙烯胶乳与抗人钙卫蛋白
    抗体的包被是采用化学交联法制备;
    任选的,所述化学交联法采用的化学交联缓冲液选自2-(N-吗啡啉)乙磺酸MES缓冲液、
    3-吗啉-2-羟基丙磺酸MOPSO缓冲液、3-(N-吗啉)丙磺酸MOPS缓冲液、4-羟乙基哌嗪乙磺酸
    HEPES缓冲液和磷酸缓冲液中的至少一种;
    任选的,所述化学交联法采用的化学交联剂选自碳化亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基
    硫代琥珀酰亚胺、酰肼和异氰酸酯中的至少一种。
    4.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于:
    所述含多聚物的缓冲液包括如下组分:三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、Triton X-100、牛
    血清蛋白、乙二醇聚氧乙烯醚和叠氮钠;
    或所述含多聚物的缓冲液包括如下组分:三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、Tween-20、牛血
    清蛋白、乙二醇聚氧乙烯醚和叠氮钠;
    或所述含多聚物的缓冲液包括如下组分:磷酸盐、氯化钠、Triton X-100、牛血清蛋白、
    乙二醇聚氧乙烯醚和叠氮钠;
    所述结合抗人钙卫蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳溶液包括如下组分:磷酸盐、抗人钙卫蛋
    白抗体包被胶乳颗粒、氯化钠、牛血清蛋白和叠氮钠。
    5.根据权利要求4所述的组合物,其特征在于:
    所述含多聚物的缓冲液包括如下浓度的各组分:
    三羟甲基氨基甲烷或磷酸盐 20-100mmol/L
    氯化钠 7-10g/L
    Triton X-100或Tween-20 4-12g/L
    牛血清蛋白 4-7g/L
    乙二醇聚氧乙烯醚 40-60g/L
    叠氮钠 3-6g/L
    任选的,所述含多聚物的缓冲液的pH值为6.5-7.5;
    任选的,所述结合抗人钙卫蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳溶液包括如下浓度的各组分:
    磷酸盐 80-120mmol/L
    抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒 10-35%
    氯化钠 7-10g/L
    牛血清蛋白 4-7g/L
    叠氮钠 4-6g/L
    任选的,所述结合抗人钙卫蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳溶液的pH值为7-8。
    6.根据权利要求5所述的组合物,其特征在于:
    所述含多聚物的缓冲液包括如下浓度的各组分:
    三羟甲基氨基甲烷 25mmol/L
    氯化钠 8.5g/L
    Triton X-100 5g/L
    牛血清蛋白 5g/L
    乙二醇聚氧乙烯醚 50g/L
    叠氮钠 4g/L
    任选的,所述含多聚物的缓冲液的pH值为7.0;
    任选的,所述结合抗人钙卫蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳溶液包括如下浓度的各组分:
    磷酸盐 100mmol/L
    抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒 15%
    氯化钠 8.5g/L
    牛血清蛋白 5g/L
    叠氮钠 5g/L;
    任选的,所述结合抗人钙卫蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳溶液的pH值为7.5。
    7.根据权利要求1所述的组合物,其特征在于:还包括校准品;
    任选的,所述校准品为钙卫蛋白校准品,所述钙卫蛋白校准品的浓度分别为10,30,
    100,300,600ug/g。
    8.根据权利要求7所述的组合物,其特征在于:所述结合抗人钙卫蛋白抗体的聚苯乙烯
    胶乳溶液采用以下方法制备而成:
    取聚苯乙烯胶乳加入MES缓冲液中,同时加入EDC和NHS,待溶解混合均匀后,活化胶乳,
    当胶乳活化完成后,将胶乳均分为两份,其中一份胶乳加入抗人钙卫蛋白单克隆抗体A,另
    一份胶乳加入抗人钙卫蛋白单克隆抗体B,并将两者均进行交联,交联完成后均进行离心,
    弃去上清液,分别将两者的沉淀溶于MES缓冲液中,得到两者的钙卫蛋白单克隆抗体标记
    液,然后将两者的钙卫蛋白单克隆抗体标记液进行混合,即制得结合抗人钙卫蛋白抗体的
    聚苯乙烯胶乳溶液。
    9.根据权利要求8所述的组合物,其特征在于:所述两者的钙卫蛋白单克隆抗体标记液
    是按1:1的体积比进行混合。
    10.权利要求1至9任一项所述的组合物在制备检测钙卫蛋白的产品中的应用;
    任选的,所述产品为试剂盒。

    说明书

    一种快速检测钙卫蛋白的试剂盒

    技术领域

    本发明涉及医学免疫体外诊断领域,特别涉及一种钙卫蛋白检测试剂盒。

    背景技术

    钙卫蛋白是一个分子量为36kD的钙、锌结合蛋白。由两条分子量为14kD的重链和
    一条分子量为8kD的轻链以共价键连接的钙结合蛋白质异三聚体组成。每条链可结合两个
    Ca2+,从而具有耐热性和增强水解性的特性。

    钙卫蛋白主要来源于中性粒细胞和单核细胞,具有多种生物学功能,体外研究表
    明它具有抑菌性能,抑菌效果可与抗生素相提并论。钙卫蛋白是中性粒细胞和活化的巨噬
    细胞质中重要的蛋白质,在许多炎症情况下含量增加,可作为急性炎症性标志物。

    目前虽然钙卫蛋白在人类生物体中多处被发现,包括:血清、唾液、脑脊液和尿液。
    但在粪便中容易测得,且其成分稳定,室温下可在大便中稳定存在7d左右,且不易被细菌和
    各种酶类破坏,不受饮食的影响。粪便的钙卫蛋白的检测是一种简单、迅速的、灵敏度高、特
    异性强、廉价的、非侵袭的炎性肠病检测方法。这种检测方法可以在正常人的黏膜和患病患
    者的炎性黏膜中都可以获得准确的检测结果。

    钙卫蛋白被认为是多种疾病中可靠的炎症指标,它可以清楚的区分器质性疾病如
    炎症性疾病IBD和功能性疾病如IBS。这种体外诊断工具可以避免昂贵的费用和结肠镜侵入
    性的检查。2005年3月14-17日在伯明翰召开的英国肠胃病学学会(BSG)年会,专题讨论了炎
    症性肠病(IBD)-钙卫蛋白-肠激惹综合征(IBS),将钙卫蛋白作为一个新的有用的诊断参考
    标志,用于:区别炎性肠病和肠激惹综合征;评估炎性肠病炎活动性;评价炎性肠病黏膜治
    愈情况。

    对于钙卫蛋白的检测,目前临床的方法包括:酶联免疫法(ELISA)、胶体金法等方
    法,但这些方法都有各自的特点及不足。ELISA法由于定量准确,广泛应用于医院检验科,但
    检测时间长,不便捷;胶体金法虽然方便、快捷,但其是一种定性方法,灵敏度较低;因此,临
    床上迫切需求建立一种快速、便捷、经济的钙卫蛋白定量检测方法。

    发明内容

    本发明要解决的技术问题是提供一种检测钙卫蛋白的试剂盒,采用该试剂盒检测
    钙卫蛋白时,操作方便快捷、特异性强、灵敏度高、重复性好、成本低、检测结果准确且抗干
    扰能力强,适于临床快速检测。

    为了解决上述技术问题,本发明通过如下技术方案实现:

    本发明第一方面提供了组合物,包括如下组分:含多聚物的缓冲液;以及结合抗人
    钙卫蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳溶液。所述多聚物为Triton系列表面活性剂、Tween系列表面
    活性剂、月桂醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯壬基苯基醚和聚氧乙烯辛基苯醚中的至少
    一种。所述聚苯乙烯胶乳的颗粒直径为100-300nm。

    在一优选例中,所述含多聚物的缓冲液中,多聚体的质量占其总体积百分比为
    0.1%-5.0%。

    在一优选例中,结合抗人钙卫蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳溶液的固含量w/v为0.5-
    5.0%。

    在一优选例中,所述结合抗人钙卫蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳溶液中的聚苯乙烯胶
    乳与抗人钙卫蛋白抗体的包被是采用化学交联法制备;

    在一优选例中,所述化学交联法采用的化学交联缓冲液选自2-(N-吗啡啉)乙磺酸
    MES缓冲液、3-吗啉-2-羟基丙磺酸MOPSO缓冲液、3-(N-吗啉)丙磺酸MOPS缓冲液、4-羟乙基
    哌嗪乙磺酸HEPES缓冲液和磷酸缓冲液中的至少一种。

    在一优选例中,所述化学交联法采用的化学交联剂选自碳化亚胺、N-羟基琥珀酰
    亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺、酰肼和异氰酸酯中的至少一种。

    在一优选例中,所述含多聚物的缓冲液包括如下组分:三羟甲基氨基甲烷、氯化
    钠、Triton X-100、牛血清蛋白、乙二醇聚氧乙烯醚和叠氮钠;或所述含多聚物的缓冲液包
    括如下组分:三羟甲基氨基甲烷、氯化钠、Tw een-20、牛血清蛋白、乙二醇聚氧乙烯醚和叠
    氮钠;或所述含多聚物的缓冲液包括如下组分:磷酸盐、氯化钠、Triton X-100、牛血清蛋
    白、乙二醇聚氧乙烯醚和叠氮钠;所述结合抗人钙卫蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳溶液包括如
    下组分:磷酸盐、抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒、氯化钠、牛血清蛋白和叠氮钠。

    在一优选例中,所述含多聚物的缓冲液包括如下浓度的各组分:

    三羟甲基氨基甲烷或磷酸盐 20-100mmol/L

    氯化钠 7-10g/L

    Triton X-100或Tween-20 4-12g/L

    牛血清蛋白 4-7g/L

    乙二醇聚氧乙烯醚 40-60g/L

    叠氮钠 3-6g/L。

    在一优选例中,所述含多聚物的缓冲液的pH值为6.5-7.5;

    在一优选例中,所述结合抗人钙卫蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳溶液包括如下浓度的
    各组分:

    磷酸盐 80-120mmol/L

    抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒 10-35%

    氯化钠 7-10g/L

    牛血清蛋白 4-7g/L

    叠氮钠 4-6g/L。

    在一优选例中,所述结合抗人钙卫蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳溶液的pH值为7-8。

    在一优选例中,所述含多聚物的缓冲液包括如下浓度的各组分:

    三羟甲基氨基甲烷 25mmol/L

    氯化钠 8.5g/L

    Triton X-100 5g/L

    牛血清蛋白 5g/L

    乙二醇聚氧乙烯醚 50g/L

    叠氮钠 4g/L。

    在一优选例中,所述含多聚物的缓冲液的pH值为7.0。

    在一优选例中,所述结合抗人钙卫蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳溶液包括如下浓度的
    各组分:

    磷酸盐 100mmol/L

    抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒 15%

    氯化钠 8.5g/L

    牛血清蛋白 5g/L

    叠氮钠 5g/L;

    在一优选例中,所述结合抗人钙卫蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳溶液的pH值为7.5。

    在一优选例中,还包括校准品。

    在一优选例中,所述校准品为钙卫蛋白校准品,所述钙卫蛋白校准品的浓度分别
    为10,30,100,300,600ug/g。

    在一优选例中,所述结合抗人钙卫蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳溶液采用以下方法制
    备而成:

    取聚苯乙烯胶乳加入MES缓冲液中,同时加入EDC和NHS,待溶解混合均匀后,活化
    胶乳,当胶乳活化完成后,将胶乳均分为两份,其中一份胶乳加入抗人钙卫蛋白单克隆抗体
    A,另一份胶乳加入抗人钙卫蛋白单克隆抗体B,并将两者均进行交联,交联完成后均进行离
    心,弃去上清液,分别将两者的沉淀溶于MES缓冲液中,得到两者的钙卫蛋白单克隆抗体标
    记液,然后将两者的钙卫蛋白单克隆抗体标记液进行混合,即制得结合抗人钙卫蛋白抗体
    的聚苯乙烯胶乳溶液。

    在一优选例中,所述两者的钙卫蛋白单克隆抗体标记液是按1:1的体积比进行混
    合。

    本发明第二方面提供了所述的组合物在制备检测钙卫蛋白的产品中的应用。

    在一优选例中,所述产品为试剂盒。

    本发明是采用聚苯乙烯胶乳包被的抗钙卫蛋白的抗体,与待测样本例如粪便等中
    的钙卫蛋白发生结合反应,在均相体系中形成免疫复合物,当透射光透过反应体系时发生
    光强度变化,根据测量钙卫蛋白校准品的光强度绘制校准曲线,测量待测样本中的光强度
    变化,依据校准曲线分析计算出检测样本中钙卫蛋白的浓度。本发明的关键有如下两个方
    面:首先是选择合适的聚苯乙烯胶乳,其大小(直径)要稍小于波长,聚苯乙烯胶乳的颗粒直
    径为100-300nm,更优选的,聚苯乙烯胶乳的颗粒直径为150-250nm;其次是采用合适的方法
    将聚苯乙烯胶乳包被目的抗体,常用的包被方法有物理吸附法和化学交联法,本发明两种
    方法均可采用,但更优选的选择化学交联法。

    本发明涉及的“Triton X-100”为聚乙二醇辛基苯基醚。

    本发明涉及的“叠氮钠”为叠氮化钠。

    本发明涉及的“磷酸氢二钠十二水合物”又称“十二水合磷酸氢二钠”,CAS号为
    10039-32-4。

    本发明涉及的“二合水磷酸二氢钠”又称“磷酸二氢钠二水合物”,CAS号为13472-
    35-0。

    本发明涉及的“乙二醇聚氧乙烯醚”又称“聚乙二醇”,CAS号为25322-68-3。

    本发明涉及的“MES缓冲液(25mmol/L,pH5.0)”的配制方法为:称取2-(N-吗啉)乙
    磺酸一水合物5.33g溶于950ml水中,调节pH=5.0后补定容至1000ml,室温保存备用。

    本发明涉及的“MOPSO缓冲液(30mmol/L,pH6.5)”的配制方法为:称取MOPSO 6.76g
    溶于950ml水中,调节pH=6.5后补定容至1000ml,室温保存备用。

    本发明涉及的“HEPES缓冲液(50mmol/L,pH8.0)”的配制方法为:称取HEPES
    13.42g溶于950ml水中,调节pH=8.0后补定容至1000ml,室温保存备用。

    本发明涉及的“NHS”的全称为N-羟基琥珀酰亚胺,分子式为C4H5NO3,CAS号为6066-
    82-6。

    本发明涉及的“EDC”的全称为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐,分子
    式为C8H17N3·HCl,CAS号为25952-53-8。

    本发明涉及的“含1%BSA的PBS缓冲液(0.01M,pH7.0)”的配制方法为:称取10gBSA
    (牛血清白蛋白)、8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中,
    用HCl调节溶液的pH值至7.0,最后加蒸馏水定容至1L。

    本发明涉及的“提取缓冲液”的配制方法为:称取150.15g尿素、2.78g CaCl2、
    48.04g柠檬酸、5g叠氮钠和12.5g BSA,加入0.25M pH8.0Tris缓冲液定容至1L,即得提取缓
    冲液,室温保存备用。

    本发明具有以下有益效果:

    (1)本发明提供的试剂盒中,采用已配制好的含多聚物的缓冲液作为试剂R1,已配
    制好的结合抗人钙卫蛋白抗体的聚苯乙烯胶乳溶液作为试剂R2,在使用时只需在两个时间
    点分别加入即可,操作非常方便快捷。

    (2)本发明提供的试剂盒检测钙卫蛋白时灵敏度很高,保证能够检测到极低水平
    的钙卫蛋白。

    (3)本发明提供的试剂盒中的各组分经过精密的搭配设计,用其检测钙卫蛋白时
    特异性强、重复性好且成本低。

    (4)本发明提供的试剂盒检测钙卫蛋白时抗干扰能力强,即使检测样本中存在一
    定浓度的干扰物包括血红蛋白、胆红素、Vc、甘油三酯等,对本发明试剂盒的检测结果影响
    很小。

    综上,本发明因具有以上优势,且能适应单人份、快速和即时出结果的定量检测,
    具有很大的临床应用价值。

    附图说明

    图1是为本发明的实施例1中的校准品的钙卫蛋白含量检测的标准曲线。

    图2是本发明的实施例5中采用本发明的检测钙卫蛋白试剂盒与国外对比试剂盒
    的比较结果示意图。图中横坐标为本发明的方法测定的结果,纵坐标为瑞士Buhlman
    Laboratories AG公司的粪便钙卫蛋白检测试剂盒测定的结果。

    具体实施方式

    除非特殊说明,本发明所用术语具有本发明所属领域中的一般含义。

    下面参考具体实施例和附图,对本发明进行说明,需要说明的是,这些实施例仅仅
    是说明性的,而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领
    域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂
    商者,均为可以通过市购获得的常规产品;所用试剂在未注明其他要求时,均指符合相应国
    家标准的分析纯试剂;所用试剂未注明配制方法时,均指按照本领域常规方法进行配制。

    实施例1

    本实施例提供了一种试剂盒,包括试剂R1、试剂R2和校准品。

    所述试剂R1包括如下浓度的各组分:

    三羟甲基氨基甲烷 25mmol/L

    氯化钠 8.5g/L

    Triton X-100 5g/L

    牛血清蛋白 5g/L

    乙二醇聚氧乙烯醚 50g/L

    叠氮钠 4g/L

    所述试剂R1的pH值为7.0。

    所述试剂R1采用如下方法制备而成:

    准确称取3.03g三羟甲基氨基甲烷、8.5g氯化钠、5g Triton X-100(阿拉丁,货号:
    T109026,批号:G1604036)、5g牛血清蛋白(Proliant,货号:68100,批号:BB52650101)、50g
    乙二醇聚氧乙烯醚、4g叠氮钠溶于900ml水中,搅拌至完全溶解后,用盐酸调节pH=7.0,再
    定容至1000ml,保存备用。

    所述试剂R2包括如下浓度的各组分:

    磷酸盐 100mmol/L

    抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒 15%(W/V)

    氯化钠 8.5g/L

    牛血清蛋白 5g/L

    叠氮钠 5g/L

    试剂R2的pH值为7.5。

    所述试剂R2采用如下方法制备而成:

    取5ml聚苯乙烯胶乳(Millipore,粒径150nm,5%w/v)加入45mlMES缓冲液
    (25mmol/L,pH5.0)中,同时加入0.05g EDC(Thermo,货号:22981,批号:RC233685)和0.05g
    NHS(Thermo,货号:24500,批号:RC230146),待溶解混合均匀后,置于37±1℃的环境中孵育
    1小时进行活化胶乳,当胶乳活化完成后,将胶乳分为两份,每份25ml,其中一份胶乳加入
    2.5mg抗人钙卫蛋白单克隆抗体A(Anti-h Calprotectin 3402SPTN-5,货号:10045,品牌:
    MedixBiochemica),另一份胶乳加入2.5mg抗人钙卫蛋白单克隆抗体B(Anti-h
    Calprotectin 3404SPTN-5,货号:100468,品牌:MedixBiochemica),并将两者均置于37±1
    ℃的环境中孵育3小时进行交联,交联完成后均在温度为4.0℃且转速为12000rpm下离心
    60min,弃去上清液,分别将两者的沉淀溶于25ml的MES缓冲液(25mmol/L,pH5.0)中,得到两
    者的钙卫蛋白单克隆抗体标记液,然后将两者的钙卫蛋白单克隆抗体标记液按1:1的体积
    比进行混合,即制得试剂R2,放置于2~8℃保存备用。

    所述校准品为钙卫蛋白校准品,所述钙卫蛋白校准品从A到E的浓度为分别为10,
    30,100,300,600ug/g。

    所述钙卫蛋白校准品的来源:采用购自MedixBiochemica的钙卫蛋白抗原,用含
    1%BSA的PBS缓冲液(0.01M,pH7.0)稀释至目标浓度A~E。

    将上述试剂R1、试剂R2和校准品分别包装,即得本实施例的钙卫蛋白的检测试剂
    盒。

    实施例2

    本实施例提供了一种试剂盒,包括试剂R1、试剂R2和校准品。

    所述试剂R1包括如下浓度的各组分:

    磷酸盐 80mmol/L

    氯化钠 8.5g/L

    Triton X-100 10g/L

    牛血清蛋白 6g/L

    乙二醇聚氧乙烯醚 50g/L

    叠氮钠 5g/L

    所述试剂R1的pH值为7.5。

    所述试剂R1采用如下方法制备而成:准确称取28.65g磷酸氢二钠十二水合物、
    10.89g磷酸二氢钾、8.5g氯化钠、10g Triton X-100(阿拉丁,货号:T109026,批号:
    G1604036)、6g牛血清蛋白(Proliant,货号:68100,批号:BB52650101)、50g乙二醇聚氧乙烯
    醚、5g叠氮钠溶于900ml水中,搅拌至完全溶解后,用盐酸调节pH=7.5,再定容至1000ml,保
    存备用。

    所述试剂R2包括如下浓度的各组分:

    磷酸盐 100mmol/L

    抗人钙卫蛋白抗体包被胶乳颗粒30%(w/v)

    氯化钠 8.5g/L

    牛血清蛋白 6g/L

    叠氮钠 5g/L

    试剂R2的pH值为8.0。

    所述试剂R2采用如下方法制备而成:

    取10ml聚苯乙烯胶乳(Millipore,粒径200nm,5%w/v)加入90mlMOPSO缓冲液
    (30mmol/L,pH6.5)中,同时加入0.1g EDC(Thermo,货号:22981,批号:RC233685)和0.1g
    NHS(Thermo,货号:24500,批号:RC230146),待溶解混合均匀后,置于37±1℃的环境中孵育
    2小时进行活化胶乳,当胶乳活化完成后,将胶乳分为两份,每份50ml,其中一份胶乳加入
    5.0mg抗人钙卫蛋白单克隆抗体A(Anti-h Calprotectin 3402SPTN-5,货号:100459,品牌:
    MedixBiochemica),另一份胶乳加入5.0mg抗人钙卫蛋白单克隆抗体B(Anti-h
    Calprotectin 3404SPTN-5,货号:100468,品牌:MedixBiochemica),并将两者均置于37±1
    ℃的环境中孵育5小时进行交联,交联完成后均在温度为4.0℃且转速为12000rpm下离心
    60min,弃去上清液,分别将两者的沉淀溶于50ml的MOPSO缓冲液(30mmol/L,pH6.5)中,得到
    两者的钙卫蛋白单克隆抗体标记液,然后将两者的钙卫蛋白单克隆抗体标记液按1:1的体
    积比进行混合,即制得试剂R2,放置于2~8℃保存备用。

    所述校准品同实施例1。

    将上述试剂R1、试剂R2和校准品分别包装,即得本实施例的钙卫蛋白的检测试剂
    盒。

    实施例3

    本实施例提供了一种试剂盒,包括试剂R1、试剂R2和校准品。

    所述试剂R1包括如下浓度的各组分:


    所述试剂R1的pH值为7.0。

    所述试剂R1采用如下方法制备而成:

    准确称取1.56g二合水磷酸二氢钠、3.58g磷酸氢二钠十二水合物、8.5g氯化钠、
    4.0g Tween-20、5g牛血清蛋白(Proliant,货号:68100,批号:BB52650101)、4g叠氮钠溶于
    900ml水中,搅拌至完全溶解后,用盐酸调节pH=7.0,再定容至1000ml,保存备用。

    所述试剂R2包括如下浓度的各组分:


    试剂R2的pH值为7.5。

    所述试剂R2采用如下方法制备而成:

    取5ml聚苯乙烯胶乳(Millipore,粒径250nm,3%w/v)加入25mlHEPES缓冲液
    (50mmol/L,pH8.0)中,同时加入0.03g EDC(Thermo,货号:22981,批号:RC233685)和0.03g
    NHS(Thermo,货号:24500,批号:RC230146),待溶解混合均匀后,置于37±1℃的环境中孵育
    1.5小时进行活化胶乳,当胶乳活化完成后,将胶乳分为两份,每份15ml,其中一份胶乳加入
    1.5mg抗人钙卫蛋白单克隆抗体A(Anti-h Calprotectin 3402SPTN-5,货号:100459,品牌:
    MedixBiochemica),另一份胶乳加入1.5mg抗人钙卫蛋白单克隆抗体B(Anti-h
    Calprotectin 3404SPTN-5,货号:100468,品牌:MedixBiochemica),并将两者均置于37±1
    ℃的环境中孵育3小时进行交联,交联完成后均在温度为4.0℃且转速为12000rpm下离心
    60min,弃去上清液,分别将两者的沉淀溶于15ml的HEPES缓冲液(50mmol/L,pH8.0)中,得到
    两者的钙卫蛋白单克隆抗体标记液,然后将两者的钙卫蛋白单克隆抗体标记液按1:1的体
    积比进行混合,即制得试剂R2,放置于2~8℃保存备用。

    所述校准品同实施例1。

    将上述试剂R1、试剂R2和校准品分别包装,即得本实施例的钙卫蛋白的检测试剂
    盒。

    实施例4

    本实施例提供了检测钙卫蛋白的方法,具体为利用胶乳增强免疫比浊法定量检测
    粪便中钙卫蛋白浓度,该方法使用了实施例1或实施例2的试剂盒。

    上述方法包括如下步骤:

    一、样本提取

    将50-100mg粪便样本放入试管中,加入粪便样本净重的49倍的提取缓冲液(含
    2.5M尿素、0.025M CaCl2、0.25M柠檬酸、0.5%叠氮钠、1.25%BSA的pH8.0的0.25M Tris缓
    冲液),混合混匀,室温放置10分钟,3000g离心5分钟,取上清即为样本提取物(也即待测样
    本)。

    二、试剂盒检测

    包括如下步骤:

    (1)使用钙卫蛋白校准品在全自动生化分析仪(MINDRAY,BS-380)上测定反应度
    (吸光度差值)并拟合标准曲线。如图1所示,为本发明的实施例1中的校准品的钙卫蛋白含
    量检测的标准曲线。

    (2)取10ul待测样本,加入到250ul试剂R1中,得到第一混合液,并在37℃中反应5
    分钟,读取第一混合液的吸光度OD1。

    (3)向第一混合液中加入50ul试剂R2,得到第二混合液,并在37℃中反应5分钟,然
    后读取第二混合液的吸光度OD2。

    上述检测的主波长为546nm。

    三、结果分析

    计算测量样本的反应度:反应度(吸光度差值)=OD1-OD2,然后根据反应度与校准
    曲线的回归方程计算分析得到待测样品的钙卫蛋白的含量。

    实施例5

    本实施例对实施例4建立的检测钙卫蛋白的方法进行了特异性和准确度验证。

    采用本发明的实施例2的试剂盒,且按照实施例4的检测方法检测了40例样本(来
    自深圳市中医院);同时,使用瑞士Buhlman Laboratories AG公司的货号为HR0593的粪便
    钙卫蛋白检测试剂盒,采用其试剂盒说明书的方法(酶联免疫法)检测上述的40例样本。

    检测结果如表1所示。

    表1




    以瑞士Buhlman Laboratories AG公司的粪便钙卫蛋白检测试剂盒的测定值(来
    自表1)为纵坐标,以本发明的试剂盒测定值(来自表1)为横坐标,绘制相关性曲线,如图2所
    示,线性回归得到的回归方程为y=0.9917x+0.5498,相关系数R2=0.9889。结果表明二者
    相关性很好,从而说明本发明试剂盒和检测方法对检测粪便钙卫蛋白具有很好的特异性和
    准确度。

    实施例6

    本实施例对实施例4建立的检测钙卫蛋白的方法进行了精密度和重复性验证。

    采用实施例1的试剂盒,且按照实施例4的检测方法检测了随机临床粪便样本1份,
    使用BS-380全自动生化分析仪对同一样本重复检测10次,

    检测结果如表2所示,变异系数为2.35%,小于5%,表明本发明的试剂盒具有较高
    的精密度和重复性。

    表2



    实施例7

    本实施例对实施例4建立的检测钙卫蛋白的方法进行了抗干扰性验证。

    采用实施例1的试剂盒,且按照实施例4的样本提取后,将样本提取物分成若干组,
    分别添加不同的干扰物,在每组的样本提取物中按样本提取物:不同浓度的干扰物=99:1
    的体积比添加干扰物,按实施例4中的检测方法对添加干扰物后的样本(即实施例4中检测
    时样本提取物用量为10ul,对比于本实施例则是样本提取物+干扰物总用量为10ul)进行了
    检测。

    1组:样本提取物+甘油三酯;其中添加甘油三酯浓度分别为0g/dl、1g/dl、10g/dl、
    20g/dl。

    2组:样本提取物+血红蛋白;其中添加血红蛋白浓度分别为0g/dl、10g/dl、50g/
    dl、100g/dl。

    3组:样本提取物+Vc;其中添加Vc浓度分别为0g/dl、10g/dl、20g/dl、50g/dl。

    4组:样本提取物+胆红素;其中添加胆红素浓度分别为0mg/dl、10mg/dl、50mg/dl、
    100mg/dl。

    检测结果如表3所示。在样本中分别添加各种干扰物后,利用本发明试剂盒依次进
    行检测时,结果显示,当存在0.1g/dl甘油三酯、0.5g/dl血红蛋白、0.2g/dl Vc、0.5mg/dl胆
    红素时,本发明试剂盒测定结果相对偏差均在10%以内;这表明即使在检测样本中存在一
    定浓度的干扰物包括血红蛋白、胆红素、Vc、甘油三酯等,对本发明试剂盒的检测结果影响
    仍然很小。

    表3





    以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明,不能认定
    本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说,在
    不脱离本发明构思的前提下做出若干等同替代或明显变型,而且性能或用途相同,均应包
    括在本发明的?;し段е?。

    关于本文
    本文标题:一种快速检测钙卫蛋白的试剂盒.pdf
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