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    彩蝴蝶重庆时时彩计划软件: 一种土壤细菌磷组分的液体SUP31/SUPPNMR测定方法.pdf

    关 键 词:
    一种 土壤 细菌 组分 液体 SUP31 SUPPNMR 测定 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201611094847.6

    申请日:

    2016.12.02

    公开号:

    CN106770609A

    公开日:

    2017.05.31

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 27/62申请日:20161202|||公开
    IPC分类号: G01N27/62; G01N24/08 主分类号: G01N27/62
    申请人: 临沂大学
    发明人: 张广娜; 林祥杰; 郭绍芬; 胡青; 贾广菊
    地址: 276000 山东省临沂市兰山区双岭路中段临沂大学
    优先权:
    专利代理机构: 济南泉城专利商标事务所 37218 代理人: 徐明双
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201611094847.6

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.06.23|||2017.05.31

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种土壤细菌磷组分的液体31P??NMR测定方法。该方法避免了把微生物磷转化为正磷酸盐才能测定的缺憾,实现了土壤微生物磷的量化定性分析;本发明中应用土壤浸出液制作培养基,最大程度的保留了土壤细菌样品与其在土壤环境中的一致性;将土壤细菌中磷组分通过细菌富集、提取、前处理,应用液体31P??NMR技术将微生物中的磷酸单酯、磷酸二酯、焦磷酸盐、膦酸盐和正磷酸盐等一一区分。通过对土壤优势细菌磷组分和土壤磷组分的31P??NMR谱图对比,对明确土壤微生物磷在土壤中的转化有重要意义。

    权利要求书

    1.一种土壤细菌磷组分的液体31P NMR测定方法,其特征在于,它包括以下步骤:
    (1)土壤细菌样品的获?。?br />a)将采集的土样过2mm筛,通过10-3~10-4梯度稀释后的土壤悬液涂布于LB培养基平板,
    30℃过夜培养12小时后挑取菌落放置于含5ml LB培养基的试管中,30℃振荡培养至试管浑
    浊;
    b)称取1g过筛后的土样加至120ml广口瓶,然后向广口瓶中加入100ml超纯水,于
    150rpm振荡30min,振荡结束后在8180rpm离心15min,吸取离心上清液至250ml三角瓶,称取
    1g NaCl、1g蛋白胨和0.5g酵母粉加至三角瓶中,混合均匀后封口120℃灭菌,三角瓶降至室
    温;取下步骤a)中振荡结束的试管,然后在超净台下酒精灯旁转移其中的菌液至三角瓶中,
    迅速封口后,30℃振荡培养至三角瓶浑浊后离心,最后将多次离心后富集的细菌样品冷冻
    干燥得到细菌样品冻干粉末,备用;
    (2)土壤细菌磷组分的提?。航掣珊蟮南妇烦迫?.5g于50ml离心管,然后向其中
    加入30ml NaOH-EDTA溶液,在20℃条件下低速往复振荡16h,浸提液在10000×g下离心
    30min,吸取上清液再次进行冷冻干燥得到土壤细菌磷组分冻干粉;
    (3)土壤细菌磷的定量分析:取1ml步骤2)中未冷冻干燥前的上清液加4ml超纯水稀释
    后,采用ICP-MS测定细菌磷浸提液的全磷含量,用于谱图中量化分析不同磷化合物的含量;
    (4)土壤细菌磷组分的液体31P NMR测定:将步骤(2)得到的土壤细菌磷组分的冻干粉末
    称取100mg重溶解于由0.1mL D2O和0.9mL 1.0M NaOH与100mM Na2EDTA构成的缓冲液共同组
    成的混合溶液中,移入5mm NMR测试管中进行谱图测定,仪器采用500M核磁测定,延迟时间
    2.0s,采集时间0.4s,45度脉冲6μs,化学位移范围为50ppm,扫描次数3万次左右,即可获得
    土壤细菌磷组分的液体31P NMR谱图。
    2.根据权利要求1所述的测定方法,其特征在于,所述步骤(1)b)中离心的具体方法为:
    首先,直接离心培养后的菌液,离心后取下部沉降物,加15ml用无菌水制备的浓度9‰的
    NaCl溶液,离心弃去上清液,此过程重复离心清洗四次后,向离心沉降物中加入15ml无菌
    水,继续离心清洗,弃去上清液,此过程重复三次,最后将离心后富集沉降物即为细菌样品,
    然后冷冻干燥。
    3.根据权利要求1所述的测定方法,其特征在于,所述NaOH-EDTA溶液为0.05M的Na2EDTA
    溶液和0.25M的NaOH溶液组成。

    说明书

    一种土壤细菌磷组分的液体31P NMR测定方法

    技术领域

    本发明涉及土壤微生物磷组分的浸提及测定,具体为一种土壤细菌磷组分的液
    体31P

    NMR测定方法。

    背景技术

    磷是所有有机生命体所必需的营养元素(Cade-Menun et al.,2006),对植物体而
    言,磷既是植物体内重要有机化合物的组分,同时又以多种方式参与植物体内各种代谢过
    程(陆景陵,2005)。植物所需要的磷,多来源于其着生的土壤和外源磷肥的施入。土壤中的
    磷可分为有机磷和无机磷两大组分,其中有机磷占土壤全磷的50%~80%(Dalal,1977)。
    土壤中不同的磷化合物形式决定了其水解为无机磷的难易。1980年,Newman和Tate首次将
    31P NMR技术应用于土壤磷组分测定,目前,液体31P NMR技术在土壤磷组分中的测定应用广
    泛,可将土壤磷区分为核酸类、磷脂类、肌醇磷酸酯类、磷酸酰胺类、磷蛋白类、磷酸糖类、膦
    酸酯类等(McKelvie,2005)。土壤微生物磷库是土壤有机磷的重要组成部分,而土壤中微生
    物磷组分的测定方法较少。目前土壤微生物磷的测定,仅限于用熏蒸法结合钼蓝比色法测
    定土壤微生物量磷,因此,应用31P NMR技术,建立一种土壤微生物磷组分,特别是土壤细菌
    磷组分的浸提、测定方法,对于提高对土壤磷组分的认识,明确土壤微生物磷与土壤磷组分
    的转化关系,有重要的现实意义。

    发明内容

    本发明目的在于提供一种土壤细菌磷组分的液体31P NMR测定方法。该方法首先从
    土壤样品中富集细菌样品,将样品冷冻干燥后浸提,浸提液离心后再次进行冷冻干燥,其后
    应用液体31P NMR技术进行磷组分测定。本发明为分析土壤微生物中磷组分特别是细菌磷组
    分的组成及含量,提供一种准确、高效的测定方法。

    本发明采用以下技术方案:

    一种土壤细菌磷组分的液体31P NMR测定方法,它包括以下步骤:

    (1)土壤细菌样品的获?。?br />

    a)将采集的土样过2mm筛,通过10-3~10-4梯度稀释后的土壤悬液涂布于LB培养基
    平板,30℃过夜培养12小时后挑取菌落放置于含5ml LB培养基的试管中,30℃振荡培养至
    试管浑浊;

    b)称取1g过筛后的土样加至120ml广口瓶,然后向广口瓶中加入100ml超纯水,于
    150rpm振荡30min,振荡结束后在8180rpm离心15min,吸取离心上清液至250ml三角瓶,称取
    1g NaCl、1g蛋白胨和0.5g酵母粉加至三角瓶中,混合均匀后封口120℃灭菌,三角瓶降至室
    温;取下步骤a)中振荡结束的试管,然后在超净台下酒精灯旁转移其中的菌液至三角瓶中,
    迅速封口后,30℃振荡培养至三角瓶浑浊后离心,最后将多次离心后富集的细菌样品冷冻
    干燥得到细菌样品冻干粉末,备用;

    (2)土壤细菌磷组分的提?。航掣珊蟮南妇烦迫?.5g于50ml离心管,然后向
    其中加入30ml NaOH-EDTA溶液,在20℃条件下低速往复振荡16h,浸提液在10000×g下离心
    30min,吸取上清液再次进行冷冻干燥得到土壤细菌磷组分冻干粉;

    (3)土壤细菌磷的定量分析:取1ml步骤2)中未冷冻干燥前的上清液加4ml超纯水
    稀释后,采用ICP-MS测定细菌磷浸提液的全磷含量,用于谱图中量化分析不同磷化合物的
    含量;

    (4)土壤细菌磷组分的液体31P NMR测定:将步骤(2)得到的土壤细菌磷组分的冻干
    粉末称取100mg重溶解于由0.1mL D2O和0.9mL 1.0M NaOH与100mM Na2EDTA构成的缓冲液共
    同组成的混合溶液中,移入5mm NMR测试管中进行谱图测定,仪器采用500M核磁测定,延迟
    时间2.0s,采集时间0.4s,45度脉冲6μs,化学位移范围为50ppm,扫描次数3万次左右,即可
    获得土壤细菌磷组分的液体31P NMR谱图。

    所述步骤(1)b)中离心的具体方法为:首先,直接离心培养后的菌液,离心后取下
    部沉降物,加15ml用无菌水制备的浓度9‰的NaCl溶液,离心弃去上清液,此过程重复离心
    清洗四次后,向离心沉降物中加入15ml无菌水,继续离心清洗,弃去上清液,此过程重复三
    次,最后将离心后富集沉降物即为细菌样品,然后冷冻干燥。

    所述NaOH-EDTA溶液为0.05M的Na2EDTA溶液和0.25M的NaOH溶液组成。

    本发明的有益效果是:

    1.本发明通过对土壤样品细菌富集培养,浸提并测定其磷组分,得到了土壤微生
    物磷组分测定的新方法,通过对土壤优势细菌磷组分和土壤磷组分的31P NMR谱图对比,对
    明确土壤微生物磷在土壤中的转化有重要意义。

    2.本发明通过土壤细菌样品的NaOH-EDTA浸提,增加了浸提液中各磷组分的浸提
    比例,为获取更详尽的土壤细菌磷组分谱图,了解土壤中的细菌磷组分创造了条件。

    3.本发明通过对细菌样品NaOH-EDTA浸提液的冷冻干燥,富集了细菌磷组分,为获
    取信噪比更好的土壤细菌磷组分谱图创造了条件。

    4.本发明通过对液体31P NMR测定时相关参数的确定,提高了谱图的分辨率,增加
    了谱图解析时的准确性。

    附图说明

    图1是三种不同土壤优势细菌液体31P NMR谱图。

    具体实施方式

    下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。

    实施例1

    土壤优势细菌磷组分的液体31P NMR测定

    本实施例采用土壤悬液培养富集土壤细菌样品,细菌样品离心冻干后采用NaOH–
    EDTA浸提离心的方法将细菌中的磷浸提出来,得到细菌磷浸提液;浸提液冷冻干燥处理后,
    得到粉末样品;将干燥后的粉末用0.1mL D2O和0.9mL含1.0M NaOH和100mM Na2EDTA的缓冲
    液重溶解后进行31P NMR上机测试,即可得到细菌磷组分的相关信息。具体方法详述如下:

    (1)土壤细菌样品的获?。?br />

    a)取褐土秸秆还田后土样,过2mm筛,通过10-3~10-4梯度稀释后的土壤悬液涂布
    于LB培养基平板,30℃过夜培养12小时后挑取菌落放置于含5ml LB培养基的试管中,30℃
    振荡培养至试管浑浊;

    b)称取1g过筛后的土样加至120ml广口瓶,然后向广口瓶中加入100ml超纯水,于
    150rpm振荡30min,振荡结束后在8180rpm离心15min,吸取离心上清液至250ml三角瓶,称取
    1g NaCl、1g蛋白胨和0.5g酵母粉加至三角瓶中,混合均匀后封口120℃灭菌,三角瓶降至室
    温;取下步骤a)中振荡结束的试管,然后在超净台下酒精灯旁转移其中的菌液至三角瓶中,
    迅速封口后,30℃振荡培养至三角瓶浑浊后离心,最后将多次离心后富集的细菌样品冷冻
    干燥得到细菌样品冻干粉末,备用;离心的具体方法为:首先,直接离心培养后的菌液,离心
    后取下部沉降物,加15ml用无菌水制备的浓度9‰的NaCl溶液,离心弃去上清液,此过程重
    复离心清洗四次后,向离心沉降物中加入15ml无菌水,继续离心清洗,弃去上清液,此过程
    重复三次,最后将离心后富集沉降物即为细菌样品,然后冷冻干燥。

    (2)土壤细菌磷组分的提?。航掣珊蟮南妇烦迫?.5g于50ml离心管,然后向
    其中加入30ml NaOH-EDTA溶液,在20℃条件下低速往复振荡16h,浸提液在10000×g下离心
    30min,吸取上清液再次进行冷冻干燥得到土壤细菌磷组分冻干粉;所述NaOH-EDTA溶液为
    0.05M的Na2EDTA溶液和0.25M的NaOH溶液组成。

    (3)土壤细菌磷的定量分析:取1ml步骤2)中未冷冻干燥前的上清液加4ml超纯水
    稀释后,采用ICP-MS测定细菌磷浸提液的全磷含量,用于谱图中量化分析不同磷化合物的
    含量;

    (4)土壤细菌磷组分的液体31P NMR测定:将步骤(2)得到的土壤细菌磷组分的冻干
    粉末称取100mg重溶解于由0.1mL D2O和0.9mL的1.0M NaOH和100mM Na2EDTA的缓冲液,移入
    5mm NMR测试管中进行谱图测定,仪器采用500M核磁测定,延迟时间2.0s,采集时间0.4s,6μ
    s脉冲(45°),化学位移范围为50ppm,扫描次数3万次左右,即可获得土壤细菌磷组分的液
    体31P NMR谱图,如图1所示。图1为沂蒙山区典型石灰性褐土区设置的20%秸秆还田量的不
    同处理下土壤优势细菌磷组分谱图,所得谱图均较清晰,杂峰较少,化学位移表达较准确,
    表明其谱图准确性以及分辨率较高,质量较好。通过谱图分析细菌磷中正磷酸盐、磷酸单酯
    (磷酸糖、植酸盐)、磷酸二酯(DNA和磷脂)、焦磷酸盐、膦酸盐多聚磷酸盐等的峰面积,以
    ICP-MS中全磷含量计算,可得各组分中的磷含量。

    表1液体31P NMR测定褐土秸秆还田后三种处理优势细菌NaOH–EDTA浸提液中的磷
    组分及其化学位移



    表2褐土秸秆还田后三种处理土壤优势细菌液体31P NMR谱图磷组分分析



    其中,膦酸盐1,2分别为膦酸盐在19.95ppm处和18.20ppm处出现的两个膦酸盐谱
    峰;nd为未检测到。

    本发明开创了土壤微生物磷组分测定的新方法,避免了把微生物磷转化为正磷酸
    盐才能测定的缺憾,实现了土壤微生物磷的量化定性分析;本发明应用土壤浸出液制作培
    养基,最大程度的保留了土壤细菌样品与其在土壤环境中的一致性;本发明将土壤细菌中
    磷组分通过细菌富集、提取、前处理,应用液体31P NMR技术将微生物中的磷酸单酯、磷酸二
    酯、焦磷酸盐、膦酸盐和正磷酸盐等一一区分;本发明最大程度的保留了细菌磷组分的原有
    形态,并将其明确为具体磷化合物。避免了通过磷浸提的难易程度来笼统划分磷组分。

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