• 四川郎酒股份有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度环保奖 2019-05-13
  • 银保监会新规剑指大企业多头融资和过度融资 2019-05-12
  • 韩国再提4国联合申办世界杯 中国网友无视:我们自己来 2019-05-11
  • 中国人为什么一定要买房? 2019-05-11
  • 十九大精神进校园:风正扬帆当有为 勇做时代弄潮儿 2019-05-10
  • 粽叶飘香幸福邻里——廊坊市举办“我们的节日·端午”主题活动 2019-05-09
  • 太原设禁鸣路段 设备在测试中 2019-05-09
  • 拜耳医药保健有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度企业奖 2019-05-08
  • “港独”没出路!“梁天琦们”该醒醒了 2019-05-07
  • 陈卫平:中国文化内涵包含三方面 文化复兴表现在其中 2019-05-06
  • 人民日报客户端辟谣:“合成军装照”产品请放心使用 2019-05-05
  • 【十九大·理论新视野】为什么要“建设现代化经济体系”?   2019-05-04
  • 聚焦2017年乌鲁木齐市老城区改造提升工程 2019-05-04
  • 【专家谈】上合组织——构建区域命运共同体的有力实践者 2019-05-03
  • 【华商侃车NO.192】 亲!楼市火爆,别忘了买车位啊! 2019-05-03
    • / 9
    • 下载费用:30 金币  

    重庆时时彩网站是那个: 指示植物核仁和柯浩体亚细胞定位的试剂盒及检测方法.pdf

    关 键 词:
    指示植物 核仁 柯浩体亚 细胞 定位 试剂盒 检测 方法
      专利查询网所有资源均是用户自行上传分享,仅供网友学习交流,未经上传用户书面授权,请勿作他用。
    摘要
    申请专利号:

    CN201611204136.X

    申请日:

    2016.12.23

    公开号:

    CN106771243A

    公开日:

    2017.05.31

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/68申请日:20161223|||公开
    IPC分类号: G01N33/68; G01N21/64; C12Q1/02 主分类号: G01N33/68
    申请人: 福建农林大学
    发明人: 郑璐平; 张冬梅; 丁作美; 张成龙; 吴祖建
    地址: 350002 福建省福州市仓山区上下店路15号
    优先权:
    专利代理机构: 福州元创专利商标代理有限公司 35100 代理人: 蔡学俊;陈彩芳
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201611204136.X

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.06.23|||2017.05.31

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明提供了指示植物核仁和柯浩体亚细胞定位的试剂盒及检测方法,所述试剂盒包括两种融合蛋白烟草纤维蛋白,为带有黄色荧光的融合蛋白YFP??NbFib2和带有青色荧光的融合蛋白CFP??NbFib2。本发明采用的试剂盒特异性更强,能具体指示细胞核上的核仁和柯浩体亚细胞器;操作更为简单:可以与预观察的蛋白同时注射,减少对植株的伤害;操作更为安全:避免了在使用DAPI过程中接触有毒等致癌物质;结果判定简单:只需在共聚焦下观察荧光颜色即可。

    权利要求书

    1.一种指示植物核仁和柯浩体亚细胞定位的试剂盒,其特征在于:所述试剂盒包括烟
    草纤维蛋白的两种融合蛋白,为带有黄色荧光的融合蛋白YFP-NbFib2和带有青色荧光的融
    合蛋白CFP-NbFib2。
    2.根据权利要求1所述的一种指示植物核仁和柯浩体亚细胞定位的试剂盒,其特征在
    于:所述试剂盒还包括:1)溶液1:10 mmol/L EMS;2)溶液2:10mmol/L MgCl2+10mmol/
    LNa3PO4·12H2O;3)溶液3:30 mmol/L葡萄糖;4)诱导剂:100umol/L 乙酰丁香酮。
    3.如权利要求1所述的一种指示植物核仁和柯浩体亚细胞定位的试剂盒的检测方法,
    其特征在于:包括如下步骤:
    1)取10μL YFP-NbFib2或CFP-NbFib2至3 mL LB液体中于28 ℃、200 rpm摇床中复苏,
    复苏至OD600 =0.6-0.8,得复苏液;
    2)配制悬浮液,即各取2.5 mL 溶液1和溶液2,5μL诱导剂至25 mL 无菌管中,并用溶液
    3补至25 mL;
    3)取步骤1复苏液各1 mL至1.5 mL 离心管中,10000 rpm离心1 min,加入1 mL悬浮液
    悬浮沉淀,10000 rpm离心1 min,重复一次;
    4)沉淀用1mL悬浮液悬浮,20℃-25℃室温静置2-3h;
    5)用一次性注射器针头在植物叶片背部扎1-2个针孔,用注射器吸取步骤4)的沉淀悬
    浮液,沿着针孔缓缓注射,直至液体浸润叶片;
    6)将注射好的本氏烟放在暗室培养2-3天,在荧光显微镜或共聚焦下观察;
    7)结果判定:取注射叶片部分在共聚焦或者荧光显微镜下观察,YFP-NbFib2和CFP-
    NbFib2注射叶片区域分别呈现黄色和青色球状圆点,大圆点的为核仁位置,旁边的小圆点
    为柯浩体位置;若观察蛋白是否定位在核仁或柯浩体上,则是观察核仁或柯浩体的颜色是
    否发生变化,如果细胞器呈现白色,说明融合蛋白定位在此细胞器上,反之,则不定位在此
    细胞器上。

    说明书

    指示植物核仁和柯浩体亚细胞定位的试剂盒及检测方法

    技术领域

    本发明属于生物技术领域,具体涉及指示植物核仁和柯浩体亚细胞定位的试剂盒
    及检测方法。

    背景技术

    植物病害的发生往往都是由病原物引起的,而这些病原物无论是病毒、细菌或者
    是真菌与植物的互作成为了多年的研究重点。植物的细胞器在植物细胞生长、发育过程中
    起着非常重要的作用,因此,病原物编码的蛋白是如何借助植物细胞器中的蛋白来抑制植
    物生成是这几年的研究热点。

    在植物的细胞器中,细胞核包含了细胞的大多数遗传物质,用于维持基因的完整
    性并由此影响细胞活动。核仁是细胞核中重要的细胞器之一,是系统的控制中心,调节生命
    活动的节奏,它是rDNA转录,rRNA前体/RNA加工和修饰,核糖体前体装配和成熟以及一些信
    号识别粒子RNA以及microRNAs组装的场所??潞铺?cajal body, CB)是存在于细胞核中的
    次核体,以小球状结构分布在核仁内部或外围,它参与RNA的成熟和加工,还能与特异基因
    互作来反馈调控基因的表达,是细胞剪切、组装和转录后修饰的场所。一些病原物通过结合
    植物的核仁和柯浩体来影响植物的生长和发育,因此,存在于这两种细胞器及其定位在这
    两种细胞器的蛋白也成为了研究热点的对象。

    目前,研究者往往都是通过DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚这种荧光燃料来定位
    细胞核,在荧光显微镜下,该燃料会使植物细胞核呈现紫色荧光,但它无法具体指示细胞核
    的核仁及其他亚细胞器,该染料是一种毒性致癌物质,在染色过程中也存在一定的不稳定
    性。因此,开发能具体指示核仁或其他细胞核亚细胞器的安全试剂是一种发展趋势。

    发明内容

    本发明所要解决的问题是提供可指示植物核仁和柯浩体亚细胞定位的试剂盒及
    其检测方法,能够快速、准确地指示核仁和柯浩体的具体位置,并能快速指示其他带黄色荧
    光或者青色荧光蛋白是否定位在这2个细胞器上,本试剂盒适用于可以进行农杆菌注射的
    植物(如本氏烟、烟草、拟南芥、番茄等)。

    本发明技术方案如下:

    本发明为解决上述问题,通过RT-PCR和农杆菌转化法构建了可以同时指示核仁和柯浩
    体的融合蛋白烟草纤维蛋白(NbFib2),YFP-NbFib2表示带有黄色荧光的融合蛋白,CFP-
    NbFib2表示带有青色荧光的融合蛋白。

    本发明提供了用于指示植物核仁和柯浩体亚细胞定位试剂盒,其中包括上述两种
    融合蛋白,具体包括:1)溶液1;2)溶液2;3)溶液3;4)诱导剂;5)YFP-NbFib2;6)CFP-NbFib2;
    7)25mL无菌管;8) 1mL注射器;

    其中,1)溶液1:10 mmol/L EMS;2)溶液2:10mmol/L MgCl2+10mmol/LNa3PO4·12H2O;3)
    溶液3:30 mmol/L葡萄糖;4)诱导剂:100umol/L 乙酰丁香酮。

    本发明还提供了上述用于指示植物核仁和柯浩体亚细胞定位试剂盒的使用方法,
    具体包括以下步骤:

    1)取10μL YFP-NbFib2或CFP-NbFib2至3 mL LB液体中于摇床中复苏(28 ℃,200
    rpm),复苏至OD600 =0.6-0.8;

    2)配制悬浮液,即各取2.5 mL 溶液1和溶液2,5μL诱导剂至25 mL 无菌管中,并用溶液
    3补至25 mL;

    3)取复苏好的菌液各1 mL至1.5 mL 离心管中,10,000 rpm离心1 min,加入1 mL悬浮
    液悬浮沉淀,10,000 rpm离心1 min,重复一次;

    4)沉淀用1mL悬浮液悬浮,20℃-25℃室温静置2-3h;

    5)用一次性注射器针头在植物(一般为本氏烟)叶片背部扎1-2个针孔,用注射器吸取
    步骤4)适量的沉淀悬浮液,沿着针孔缓缓注射,直至液体浸润叶片;

    6)将注射好的本氏烟放在暗室培养2-3天,在荧光显微镜或共聚焦下观察。

    7)如需观察其他蛋白是否定位在核仁或柯浩体上,可以构建与试剂盒所提供的蛋
    白可发生共定位的融合蛋白,如:YFP-NbFib2可以与融合了CFP荧光的蛋白配套使用;CFP-
    NbFib2可以与融合了YFP荧光的蛋白配套使用;融合蛋白按步骤1-4操作,只是在步骤5将需
    要观察共定位的蛋白按1:1(V/V)进行混合后注射烟草,进而观察融合蛋白是是否定位在核
    仁或柯浩体上;

    8)结果判定:取注射叶片部分在共聚焦或者荧光显微镜下观察,YFP-NbFib2和CFP-
    NbFib2注射叶片区域分别呈现黄色和青色球状圆点,大圆点的为核仁位置,旁边的小圆点
    为柯浩体位置(有时会出现2个以上);若是观察蛋白是否定位在核仁或柯浩体上,则是观察
    核仁或柯浩体的颜色是否发生变化,如果细胞器呈现白色,说明融合蛋白定位在此细胞器
    上,反之,则不定位在此细胞器上。

    与现有技术相比,本发明提供的植物核仁和柯浩体亚细胞定位的试剂盒及其使用
    方法效果在于:1)特异性更强:能具体指示细胞核上的核仁和柯浩体亚细胞器;2)操作更为
    简单:可以与预观察的蛋白同时注射,减少对植株的伤害;3)操作更为安全:避免了在使用
    DAPI过程中接触有毒等致癌物质;4)结果判定简单:只需在共聚焦下观察荧光颜色即可。

    附图说明

    图1为实施例2的试剂盒YFP-NbFib2和CFP-NbFib2的亚细胞定位结果。其中(A):
    YFP-NbFib2; (B): 透射光; (C): (A) 和(B)的叠加; (D): CFP-NbFib2; (E): 透射光;
    (F): (C)和(E)的叠加。(NO: 核仁; CB: 柯浩体 )。

    图2为实施例2的试剂盒YFP-NbFib2和CFP-NbFib2在DAPI染色情况下的亚细胞定
    位结果。其中(A): DAPI荧光染色; (B):YFP-NbFib2; (C): (A)和(B)的叠加; (D): DAPI
    荧光染色; (E) : CFP-NbFib2;(F) (D)和(E)的叠加。(NO: 核仁; CB: 柯浩体 )。

    图3为实施例3的YFP-NbFib2和CFP-P2的亚细胞共定位结果。其中(A): CFP-P2;
    (B): YFP-NbFib2; (C): 透射光; (D): (A)、(B)和(C)的叠加。(NO: 核仁; CB: 柯浩体
    )。

    图4为实施例4的CFP-NbFib2和YFP-P1的亚细胞共定位结果。其中(A): CFP-P2;
    (B): YFP-NbFib2; (C): 透射光; (D): (A)、(B)和(C)的叠加。(NO: 核仁; CB: 柯浩体 )
    其中(A): CFP- NbFib2; (B): YFP -P2; (C): 透射光; (D): (A)、(B)和(C)的叠加。(NO:
    核仁; CB: 柯浩体)。

    具体实施方式

    以下通过具体实施例对本发明进一步说明。

    实施例1:植物核仁和柯浩体亚细胞定位的试剂盒的配备

    1)菌液准备:取YFP-NbFib2、CFP-NbFib2(根据GenBank中报道的NbFib2的序 列(Gen
    Bank accession number: AM269909.1))、YFP-P1(自备)、CFP-P2(自备)各10μL于3 mL LB
    溶液中;

    2)配制悬浮液:即各取2.5 mL 溶液1和溶液2,5μL诱导剂至25 mL 无菌管中,加溶液3
    至25 mL;

    实施例2:植物核仁和柯浩体亚细胞定位的试剂盒的检测方法

    1) 将含有YFP -NbFib2或CFP-NbFib2的LB菌液于摇床中复苏(28 ℃,200 rpm),复苏
    至OD600 =0.6-0.8,得复苏液;

    2)取复苏好的复苏液各1 mL至1.5 mL 离心管中,10000 rpm离心1 min,加入1 mL悬浮
    液悬浮沉淀,10000 rpm离心1 min,重复一次;

    3)沉淀用1 mL 悬浮液悬浮,20℃-25℃室温静置2-3h;

    4) 用一次性注射器针头在本氏烟叶片背部扎1-2个针孔,用注射器吸取适量的3)中的
    沉淀悬浮液,沿着叶背针孔缓缓注射,直至液体浸润叶片;

    5)将本氏烟放在暗室培养2-3天后,在荧光显微镜或共聚焦下观察。

    6)结果判定:在共聚焦显微镜下观察,发现YFP-NbFib2呈现黄色荧光定位在核仁
    (NO)和柯浩体上(CB)上(图1 A-C);CFP-NbFib2呈现青色色荧光定位在核仁(NO)和柯浩体
    上(CB)上(图1 D-F);

    7)通过DAPI染色实验,进一步证明YFP-NbFib2和CFP-NbFib2确定确实定位在细胞核
    上。

    实施例3:检测其他蛋白是否定位在核仁和柯浩体亚细胞定位的试剂盒的检测方

    1) 将含有YFP -NbFib2和CFP-P2的LB菌液于摇床中复苏(28℃,200 rpm),复苏至OD600
    =0.6-0.8;

    2)取复苏好的菌液各1 mL至1.5 mL 离心管中,10000 rpm离心1 min,加入1 mL悬浮液
    悬浮沉淀,10000 rpm离心1 min,重复一次;

    3)沉淀用1 mL 悬浮液悬浮,室温静置(20℃-25℃)2-3h;

    4) 用一次性注射器针头在 本氏烟叶片背部扎1-2个针孔,将YFP-NbFib2和CFP-P2进
    行1:1(v/v)进行混合用注射器吸取适量上述混合液,沿着叶背的针孔分别缓缓注射叶片,
    直至液体浸润叶片;

    5)将本氏烟放在暗室培养2-3天后,在荧光显微镜或共聚焦下观察。

    6)结果判定:在共聚焦显微镜下观察,发现CFP-P2和YFP-NbFib2能共定位在核仁
    和柯浩体上,共定位部呈现白色荧光,说明P2蛋白定位在核仁和柯浩体上。

    实施例4:检测其他蛋白是否定位在核仁和柯浩体亚细胞定位的试剂盒的检测方

    1) 将含有CFP-NbFib2和YFP-P1的LB菌液于摇床中复苏(28 ℃,200 rpm),复苏至OD600
    =0.6-0.8;

    2)取复苏好的菌液各1 mL至1.5 mL 离心管中,10,000 rpm

    离心1 min,加入1 mL悬浮液悬浮沉淀,10,000 rpm离心1 min,重复一次;

    3)沉淀用1 mL 悬浮液悬浮,室温静置(20℃-25℃)2-3h;

    4) 用一次性注射器针头在本氏烟叶片背部扎1-2个针孔,将CFP-NbFib2和YFP-P1进行
    1:1(v/v)进行混合,用注射器吸取适量上述混合液,沿着叶背的针孔分别缓缓注射叶片,直
    至液体浸润叶片;

    5)将本氏烟放在暗室培养2-3天后,在荧光显微镜或共聚焦下观察。

    6)结果判定:在共聚焦显微镜下观察,发现CFP- NbFib2和YFP- P1不能发生共定
    位,说明P1蛋白不定位在核仁和柯浩体上。

    关于本文
    本文标题:指示植物核仁和柯浩体亚细胞定位的试剂盒及检测方法.pdf
    链接地址://www.4mum.com.cn/p-6003238.html
    关于我们 - 网站声明 - 网站地图 - 资源地图 - 友情链接 - 网站客服 - 联系我们

    [email protected] 2017-2018 www.4mum.com.cn网站版权所有
    经营许可证编号:粤ICP备17046363号-1 
     


    收起
    展开
  • 四川郎酒股份有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度环保奖 2019-05-13
  • 银保监会新规剑指大企业多头融资和过度融资 2019-05-12
  • 韩国再提4国联合申办世界杯 中国网友无视:我们自己来 2019-05-11
  • 中国人为什么一定要买房? 2019-05-11
  • 十九大精神进校园:风正扬帆当有为 勇做时代弄潮儿 2019-05-10
  • 粽叶飘香幸福邻里——廊坊市举办“我们的节日·端午”主题活动 2019-05-09
  • 太原设禁鸣路段 设备在测试中 2019-05-09
  • 拜耳医药保健有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度企业奖 2019-05-08
  • “港独”没出路!“梁天琦们”该醒醒了 2019-05-07
  • 陈卫平:中国文化内涵包含三方面 文化复兴表现在其中 2019-05-06
  • 人民日报客户端辟谣:“合成军装照”产品请放心使用 2019-05-05
  • 【十九大·理论新视野】为什么要“建设现代化经济体系”?   2019-05-04
  • 聚焦2017年乌鲁木齐市老城区改造提升工程 2019-05-04
  • 【专家谈】上合组织——构建区域命运共同体的有力实践者 2019-05-03
  • 【华商侃车NO.192】 亲!楼市火爆,别忘了买车位啊! 2019-05-03
  • 移动棋牌手机版 湖北11选5计划软件 脉动棋牌免费版下载 极速快3方法 ewin棋牌官网 大乐透周一走势图2018 cp126大乐透走势图 棋牌游戏365大厅下载 浙江七乐彩走势图 中彩票的号码 宁夏十一选五开奖/ 上证指数吧 辽宁11选5胆码 双色球蓝球分区走势图 银河棋牌游戏官网安卓版 快乐飞艇通网的吗