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    重庆时时彩预测推荐: 一种基于NAFION修饰的玻碳电极检测凝血酶的方法.pdf

    关 键 词:
    一种 基于 NAFION 修饰 电极 检测 凝血酶 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201710001684.0

    申请日:

    2017.01.03

    公开号:

    CN106770556A

    公开日:

    2017.05.31

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 27/30申请日:20170103|||公开
    IPC分类号: G01N27/30; G01N27/327; G01N33/68 主分类号: G01N27/30
    申请人: 福州大学
    发明人: 付才力; 刘畅; 林振宇; 罗芳; 苏凌珊
    地址: 350108 福建省福州市闽侯县上街镇大学城学园路2号福州大学新区
    优先权:
    专利代理机构: 福州元创专利商标代理有限公司 35100 代理人: 蔡学俊;陈彩芳
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201710001684.0

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2018.12.25|||2017.06.23|||2017.05.31

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开一种基于Nafion修饰的玻碳电极定量检测凝血酶的方法,其中Nafion修饰到玻碳电极上,会在玻碳电极上形成具有较强负电性的Nafion膜。在同时加入凝血酶的情况下,凝血酶能挣脱出DNA双链中的适配体链,释放出修饰有亚甲基蓝的互补DNA单链,此时再加入Exo??I,单链DNA将被特异性剪切,产生大量具有亚甲基蓝的DNA短碎片,该碎片所含碱基少,则负电性小,能够靠近电极产生较强的电化学信号,通过信号的差异,即可检测凝血酶的浓度。本发明具有操作简单、成本低、灵敏度高、特异性好、稳定性好等优点。

    权利要求书

    1.一种基于Nafion修饰的玻碳电极定量检测凝血酶的方法,其特征在于:包括如下步
    骤:
    (1)使用传统的溶剂挥发法,将Nafion修饰到玻碳电极上,在玻碳电极上形成带有较强
    负电性的膜;
    (2)设计凝血酶适配体DNA链及其互补链,并在适配体互补链一端修饰电活性物质——
    亚甲基蓝;
    (3)DNA杂交反应,适配体链与其互补链混合杂交形成双链DNA结构;
    (4)加入含有目标物凝血酶的待测样品,凝血酶与适配体链特异性结合,释放修饰有亚
    甲基蓝的DNA单链;
    (5)DNA酶切反应,用Exo I酶酶解单链的标记有亚甲基蓝的DNA链,释放出连接有亚甲
    基蓝的DNA碎片;
    (6)Nafion修饰的玻碳电极作为工作电极进行检测,多通路电信号读取装置检测并记
    录体系的电化学信号,分析凝血酶的含量。
    2.根据权利要求1所述的一种基于Nafion修饰的玻碳电极定量检测凝血酶的方法,其
    特征在于:步骤(1)中所述的Nafion的浓度为0.01wt.%,滴加体积为3.5 μL,使用传统的溶
    剂挥发法,置于室温下溶剂自然挥发进行修饰,储存备用。
    3.根据权利要求1所述的一种基于Nafion修饰的玻碳电极定量检测凝血酶的方法,其
    特征在于:步骤(2)中所述的凝血酶适配体DNA链序列为:5′-GTGGTAGGGCAGGTTGGGGTGACT-
    3′。
    4.根据权利要求1所述的一种基于Nafion修饰的玻碳电极定量检测凝血酶的方法,其
    特征在于:步骤(2)中所述的一端修饰亚甲基蓝的适配体互补链序列为:
    5′-AGTCACCCCAACCTGCCCTACCAC-Methylene blue (MB)-3′。
    5.根据权利要求1所述的一种基于Nafion修饰的玻碳电极定量检测凝血酶的方法,其
    特征在于:步骤(3)中所述的的DNA杂交反应,在缓冲溶液中进行,使用的缓冲溶液为磷酸盐
    缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
    6.根据权利要求1所述的一种基于Nafion修饰的玻碳电极定量检测凝血酶的方法,其
    特征在于:步骤(3)中所述的DNA杂交反应,其中反应体系总体积为100 μL,凝血酶适配体
    DNA链的浓度为1 μM,修饰亚甲基蓝的互补链的浓度为1 μM。
    7.根据权利要求1所述的一种基于Nafion修饰的玻碳电极定量检测凝血酶的方法,其
    特征在于:步骤(5)中所述的酶切反应,其中Exo I酶的使用量为20 U。
    8.根据权利要求1所述的一种基于Nafion修饰的玻碳电极定量检测凝血酶的方法,其
    特征在于:步骤(6)中使用Nafion修饰的玻碳电极作为工作电极进行检测,包括如下步骤:
    (1)将凝血酶适配体DNA链与修饰亚甲基蓝的互补DNA链混入含1 mM DTT的Tris-HCl缓
    冲体系中,在37℃下反应1小时;
    (2)加入含有凝血酶的待测样品和Exo I酶混合,在含1 mM DTT的Tris-HCl缓冲体系中
    37 ℃下反应1小时;
    (3)使用Nafion修饰的玻碳电极进行检测,用多路输出电化学工作站进行DPV示差脉冲
    电信号的收集;通过DPV电信号的变化趋势来监测凝血酶浓度。

    说明书

    一种基于Nafion修饰的玻碳电极检测凝血酶的方法

    技术领域

    本发明涉及一种基于Nafion修饰的玻碳电极定量检测凝血酶的方法,属于电化学
    定量分析方法技术领域。

    背景技术

    凝血酶是凝血过程中一种重要的丝氨酸蛋白酶,可以加速和巩固凝血过程,调控
    炎症、贫血和伤口愈合速度等生理及病理过程,其浓度和活性在许多发病机理如白血病、动
    脉血栓症等中占主导作用。此外,在分子生物学中也扮演着非常重要的角色,如肿瘤生长,
    转移过程以及血管生成。因此对凝血酶的分析检测在医学、生物学上具有重要的意义。

    到目前为止,已经开发大量的生物传感器被用于凝血酶的检测。市场上比较多的
    方法主要有光学技术;可视化比色法;表面增强拉曼光谱法和电化学方法等?;诠庋Ъ际?br />的这类方法相较于电化学方法,通常灵敏度较低,检测限较高,一定程度上限制了凝血酶检
    测的临床价值。而现有的电化学方法基本都需要将探针修饰于电极之上或者使用多种材料
    修饰电极,这类技术耗时耗力,且在电极界面上的反应的空间位阻效应极大限制了反应效
    率,重现性不高。因此,有必要开发出更加简易且适应凝血酶检测需求的新方法,以实现该
    指标对疾病诊断和临床应用。

    Nafion是一种全氟代磺化物,含有电离基团的离子聚合物。由于其化学性质稳定、
    热稳定性好、和高阳离子交换能力,已被广泛应用于燃料电池制造、传感器的开发、以及有
    机合成中。Nafion修饰的电极,对疏水性大阳离子交换能力强,其磺酸基可选择地预浓缩阳
    离子,而对阴离子有较强的阻隔作用。DNA的磷酸骨架带负电,且其负电性与所含碱基数大
    小相关。碱基数越多,负电性越强。因此修饰亚甲基蓝的DNA长链,由于其负电性较强,将与
    带负电的Nafion修饰的玻碳电极相排斥,使得亚甲基蓝不能靠近电极表面,导致检测电化
    学信号弱。而短的具有亚甲基蓝的DNA碎片负电性较弱,亚甲基蓝能够靠近电极表面,则检
    测到的电化学信号较强?;诖嗽砉菇庑奘蔚牡缁Х椒ㄓ糜谀傅募觳?。

    发明内容

    本发明针对现有凝血酶检测手段繁复,单体样品耗用量大等问题,提出一种基于
    Nafion修饰的玻碳电极的灵敏,简单,稳定且耗样量少的电化学定量监测方法。

    本发明的技术方案为:

    一种基于Nafion修饰的玻碳电极定量检测凝血酶的方法,包括如下步骤:

    (1)使用传统的溶剂挥发法,将Nafion修饰到玻碳电极上,在玻碳电极上形成具有较强
    负电性的膜;

    (2)根据文献设计凝血酶适配体DNA链及其互补链,并在适配体互补链一端修饰电活性
    物质——亚甲基蓝;

    (3)DNA杂交反应,适配体链与其互补链混合杂交形成双链DNA结构;

    (4)加入含有目标物凝血酶的待测样品,凝血酶与适配体链特异性结合,释放修饰有亚
    甲基蓝的DNA单链;

    (5)DNA酶切反应,用Exo I酶酶解单链的标记有亚甲基蓝的DNA链,释放出连接有亚甲
    基蓝的DNA碎片;

    (6)Nafion修饰的玻碳电极作为工作电极进行检测,多通路电信号读取装置检测并记
    录体系的电化学信号,分析凝血酶的含量。

    步骤(1)中所述的带负电的Nafion修饰的玻碳电极的制作,使用传统溶剂挥发法
    进行玻碳电极的Nafion修饰,Nafion浓度和体积分别为:0.01wt.%、3.5 μL,置于室温下使
    其溶剂自然挥发。

    步骤(2)中所述的使用的凝血酶适配体DNA链为:5′-GTGGTAGGGCAGGTT
    GGGGTGACT-3′;

    步骤(2)中所述的修饰了亚甲基蓝的适配体互补链为:5′-AGTCACC
    CCAACCTGCCCTACCAC-Methylene blue (MB)-3′;

    步骤(3)中所述的适配体链与修饰亚甲基蓝互补链在缓冲液中杂交形成双链DNA结构,
    其中反应体系总体积为100 μL,加入两条DNA链的终浓度均为1 μM。

    步骤(3)种所述的DNA杂交反应,在缓冲液中进行,使用的缓冲液体系为磷酸盐缓
    冲液或Tris-HCl缓冲液。

    步骤(5)中所述的酶切反应,加入的Exo I酶总量为20 U。

    步骤(6)中所述的凝血酶的检测,具体步骤如下:

    (1)将凝血酶适配体DNA链与修饰亚甲基蓝的互补DNA链混入含1 mM DTT(二硫苏糖醇)
    的Tris-HCl缓冲体系中,在37℃下反应1小时;

    (2)加入凝血酶和Exo I酶混合,在含1 mM DTT(二硫苏糖醇)的Tris-HCl缓冲体系中37
    ℃下反应1小时;

    (3)使用Nafion修饰的玻碳电极进行检测,用多路输出电化学工作站进行DPV示差脉冲
    电信号的收集。通过DPV电信号的变化趋势来监测凝血酶浓度。

    本发明的优点在于:

    (1)Nafion的修饰较稳定,其负电性排斥力强,能降低信号背景,且具有较高的灵敏度。
    对于传统电化学检测方法,本方法不需要DNA的固定且反应过程在均一相中进行,避免了复
    杂的DNA修饰过程,简化了硬件前期准备过程,并且还避免了在电极表面反应的空间位阻效
    应;

    (2)本发明的DNA及修饰DNA的合成方法简单、快速、反应条件温和、容易控制;

    (3)本发明涉及的样品试剂耗用量少,对于检测昂贵样品源或稀少样品源有极大的优
    势,且操作步骤简单、便捷、灵敏、成本低而且无毒害,实用性强;

    (4)可使用不同适配体,设计多通路模型,实现对多个样品同时检测的高通量检测效
    果,减少实验耗时,提高测样的效率。

    附图说明

    图1为Nafion修饰玻碳电极示意图。

    图2为Nafion修饰前后的阻抗图。

    图3为添加与不添加凝血酶体系的DPV信号图。

    图4为凝血酶的检测原理图。

    图5为凝血酶检测线性图。

    具体实施方式

    实施例1 Nafion修饰的玻碳电极的制作

    玻碳裸电极依次使用0.3 nm、0.05 nm的铝粉进行打磨抛光,在铁氰化钾溶液中扫描CV
    曲线,其峰电压差值在80~100 mV,吹干备用。使用的Nafion浓度为0.01wt.%,滴加体积为
    3.5 μL。将Nafion溶液滴加至玻碳电极中心,使其自然扩散,放置于室温中,自然挥发,在玻
    碳电极上形成一层均匀的Nafion膜,即可获得带负电的Nafion修饰玻碳工作电极。图1为
    Nafion修饰玻碳电极示意图;图2为Nafion修饰前后的阻抗图。

    实施例2凝血酶定量检测

    反应体系的总体积为100 μL。用5 mM的Tris-HCl缓冲液(包含1 mM的MgCl2,10 mM的
    NaCl,1 mM DTT(二硫苏糖醇),且pH为7.5)作为溶剂混合1 μM的凝血酶适配体DNA链(5′-
    GTGGTAGGGCAGGTT GGGGTGACT-3′)和标记有亚甲基蓝的互补DNA链(5′-AGTCACC
    CCAACCTGCCCTACCAC-Methylene blue (MB)-3′),在恒温37℃下反应1小时进行杂交,形成
    双链DNA结构。由于DNA的磷酸骨架带负电,且其负电性与所含碱基数大小相关。碱基数越
    多,负电性越强。当溶液中没有目标物凝血酶时,加入20 U的 Exo I酶,由于溶液中只含双
    链DNA结构(结构中含有修饰亚甲基蓝的DNA链),Exo I酶对其无法剪切,该双链DNA结构的
    负电性较强,将与带负电的Nafion修饰的玻碳电极相排斥,使得亚甲基蓝不能靠近电极表
    面,则检测到的DPV信号弱。而当存在目标物凝血酶时,加入20 U的 Exo I酶,因为目标物与
    适配体较强结合,释放出单链的标记亚甲蓝的互补DNA序列,Exo I酶将特异性地剪切DNA单
    链,进而释放出短链的具有亚甲基蓝的DNA碎片。而短的具有亚甲基蓝的DNA碎片负电性较
    弱,亚甲基蓝能够靠近电极表面,则检测到的DPV信号较强。因此将Nafion修饰的玻碳电极
    插入有无目标物的100μL样品中,使用电化学工作站对其DPV示差脉冲电信号进行收集,DPV
    电信号的差值高低即可表示凝血酶的浓度。图3为添加与不添加凝血酶体系的DPV信号图。

    图4为检测的原理图,加入目标物凝血酶后,单链DNA被酶解,产生较短的带有亚甲
    基蓝的核苷酸片段,该片段碱基数很小,则负电性较弱,使之接近Nafion修饰的玻碳电极表
    面,得到增强的DPV电信号。因此,建立起了凝血酶浓度和DPV电信号之间的正相关性。

    实施例3凝血酶检测线性

    反应体系的总体积为100 μL。用5 mM的Tris-HCl缓冲液(包含1 mM的MgCl2,10 mM的
    NaCl,1 mM DTT(二硫苏糖醇),且pH为7.5)作为溶剂混合1 μM的凝血酶适配体DNA链和标记
    有亚甲基蓝的互补DNA链,在恒温37℃下反应1小时进行杂交,形成双链DNA结构。然后加入
    不同浓度的凝血酶反应1h以挣脱凝血酶适配体DNA链后,再加入20 U的 Exo I酶用以特异
    性地剪切标记有亚甲基蓝的互补DNA单链,进而释放出短链的具有亚甲基蓝的DNA碎片。将
    Nafion修饰的玻碳电极插入反应溶液中,使用电化学工作站对其DPV示差脉冲电信号进行
    收集。

    经过检测,在0.01 nM ~ 1000 nM的范围内,DPV信号随着凝血酶浓度的增加而增
    加(图5 A)。图5B表明了凝血酶浓度与DPV信号的增强值(?Ip= Ip(凝血酶) - Ip0,Ip0为空白背
    景信号)的关系。DPV响应信号与凝血酶浓度的对数在0.01 nM至1000 nM的范围内具有良好
    的线性关系。其线性回归方程可表示为:

    △Ip / nA =-22.74 × Log C / nM – 93.20, R2 = 0.995

    其中?Ip为传感器响应信号与背景信号的差值;C为凝血酶的浓度;R2表示相关回归系
    数。经计算,本方法对凝血酶的检测限为4.6 pM(S / N = 3)。

    以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与
    修饰,皆应属本发明的涵盖范围。

    SEQUENCE LISTING

    <110> 福州大学

    <120> 一种基于Nafion修饰的玻碳电极检测凝血酶的方法

    <130> 2

    <160> 2

    <170> PatentIn version 3.3

    <210> 1

    <211> 24

    <212> DNA

    <213> 人工序列

    <400> 1

    gtggtagggc aggttggggt gact 24

    <210> 2

    <211> 24

    <212> DNA

    <213> 人工序列

    <400> 2

    agtcacccca acctgcccta ccac 24

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