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    重庆时时彩后一: 一种用于杆状病毒GP64蛋白的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及方法.pdf

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    一种 用于 杆状病毒 GP64 蛋白 夹心 免疫 检测 试剂盒 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201611262295.5

    申请日:

    2016.12.30

    公开号:

    CN106771249A

    公开日:

    2017.05.31

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 著录事项变更IPC(主分类):G01N 33/68变更事项:申请人变更前:广东华南联合疫苗开发院有限公司变更后:广东华南疫苗股份有限公司变更事项:地址变更前:510663 广东省广州市科学城揽月路3号国际企业孵化器F栋715变更后:510663 广东省广州市高新技术产业开发区科学城揽月路3号广州国际企业孵化器F区F715号房|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/68申请日:20161230|||公开
    IPC分类号: G01N33/68; G01N33/535 主分类号: G01N33/68
    申请人: 广东华南联合疫苗开发院有限公司
    发明人: 谭远贞; 彭涛; 马书智; 许煜华; 陈丽云; 黄杨波; 卢全占; 丁东
    地址: 510663 广东省广州市科学城揽月路3号国际企业孵化器F栋715
    优先权:
    专利代理机构: 广州嘉权专利商标事务所有限公司 44205 代理人: 许飞
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201611262295.5

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2018.02.27|||2017.06.23|||2017.05.31

    法律状态类型:

    著录事项变更|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了杆状病毒GP64蛋白双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及方法。试剂盒包括稀释液、洗液、显色液、终止液、一抗包被的酶标板、杆状病毒GP64蛋白标准品和标记的二抗,一抗为豚鼠抗杆状病毒GP64蛋白抗体,二抗为兔抗杆状病毒GP64蛋白抗体。本发明的试剂盒,操作简便,检测结果准确可靠,标准曲线线性为R2=0.9999,线性关系较好,线性范围在2ng/ml??100ng/ml,线性范围较理想。日内、日间准确度在95.3%??101.8%之间,精密度在4.2%??6.7%之间,表明试剂盒具有较好的准确度和精密度。不同批试剂盒对高、中、低浓度质控品进行测定,测定值的准确度在96.4%??100.2%之间,精密度在5.7%??8.6%之间,差异较小。

    权利要求书

    1.一种用于杆状病毒GP64蛋白的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒,包括稀释液、洗液、显
    色液、终止液、一抗包被的酶标板、杆状病毒GP64蛋白标准品和标记的二抗,其特征在于:一
    抗为哺乳动物抗杆状病毒GP64蛋白抗体,二抗为标记的抗杆状病毒GP64蛋白抗体。
    2.根据权利要求1所述的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒,其特征在于:哺乳动物抗杆状
    病毒GP64蛋白抗体的制备方法为:首次免疫采用抗原免疫,注射杆状病毒GP64蛋白;首次免
    疫后进行加强免疫,进行3~5次加强免疫,最后一次加强免疫后进行取血。
    3.根据权利要求1所述的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒,其特征在于:兔抗杆状病毒
    GP64蛋白抗体的制备方法为:首次免疫采用抗原多点免疫,注射杆状病毒GP64蛋白;首次免
    疫后进行加强免疫,共进行3~5次加强免疫,最后一次加强免疫后进行取血。
    4.根据权利要求1~3任意一项所述的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒,其特征在于:酶
    标板的处理方法为:将抗杆状病毒GP64蛋白抗体用包被液稀释后加入酶标板,包被过夜,再
    用封闭液封闭,封存。
    5.根据权利要求1所述的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒,其特征在于:标记二抗的为
    HRP。
    6.根据权利要求1所述的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒,其特征在于:杆状病毒GP64蛋
    白的制备方法为:
    1)使用引物扩增杆状病毒 GP64基因;
    2)使用扩增得到的杆状病毒 GP64基因构建杆状病毒 GP64基因原核表达载体并诱导
    表达;
    3)将表达得到的杆状病毒GP64蛋白分离、纯化得到杆状病毒GP64蛋白。
    7.一种检测杆状病毒GP64蛋白含量的方法,包括如下步骤:
    1)取出包被一抗的酶标板,加入杆状病毒GP64蛋白抗原标准品,孵育完成后弃去孔内
    液体,洗液清洗后拍干;
    2)加入HRP标记的抗杆状病毒GP64蛋白抗体,孵育完成后弃去孔内液体,洗液清洗后拍
    干;
    3)加入TMB显色液,室温反应显色;
    4)加入硫酸终止液;
    5)在酶标仪上测450nm下的OD值;
    6)根据标准曲线得到所述待检样品中杆状病毒GP64蛋白含量。
    8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:杆状病毒GP64蛋白抗原标准品浓度为0ng/
    ml~100ng/ml。
    9.根据权利要求7所述的方法,其特征在于:HRP标记的兔抗杆状病毒GP64蛋白抗体浓
    度为0.5μg/ml~5μg/ml。

    说明书

    一种用于杆状病毒GP64蛋白的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及方法

    技术领域

    本发明涉及生物检测领域,尤其是涉及用于检测杆状病毒GP64蛋白残留的双抗夹
    心酶联免疫检测试剂盒及方法。

    背景技术

    昆虫细胞/杆状病毒表达系统具有安全性高,对外源基因克隆容量大,重组病毒易
    于筛选,具有完备的翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力等特点,已经广泛应
    用于重组蛋白的表达和研究中。国外公司利用昆虫细胞/杆状病毒表达系统生产的多种人
    用疫苗或药物已批准上市。

    膜融合蛋白GP64是杆状病毒的主要糖蛋白,序列高度保守,含512个氨基酸,相对
    分子质量约为59300Da,主要以二硫键相连三聚体的形式存在于棒状杆状病毒的一端,形成
    典型的膜粒结构。其具有pH依赖的膜融合活性,介导病毒与宿主细胞的融合,在杆状病毒侵
    染细胞和子代核衣壳有效出芽释放的过程中均起关键作用。因此,对昆虫细胞/杆状病毒表
    达系统生产的重组蛋白生物制品中的杆状病毒GP64蛋白进行定量检测,能够对杆状病毒蛋
    白残余量进行控制。

    获得高质量的抗体是ELISA法检测蛋白含量的关键,抗原的免疫原性对抗体的效
    价有着直接的影响,抗体的具体制备方法对效价同样存在巨大的影响。

    发明内容

    本发明的目的在于提供用于检测杆状病毒GP64蛋白的双抗夹心酶联免疫检测试
    剂盒及方法。

    本发明所采取的技术方案是:

    一种用于检测杆状病毒GP64蛋白的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒,包括稀释液、
    洗液、显色液、终止液、一抗包被的酶标板、杆状病毒GP64蛋白标准品和标记的二抗,一抗为
    哺乳动物抗杆状病毒GP64蛋白抗体,二抗为标记的抗杆状病毒GP64蛋白抗体。

    作为上述双抗夹心酶联免疫检测试剂盒的进一步改进,哺乳动物抗杆状病毒GP64
    蛋白抗体的制备方法为:首次免疫采用抗原多点免疫,注射杆状病毒GP64蛋白;首次免疫进
    行加强免疫,共进行3~5次加强免疫,最后一次加强免疫后取血。

    作为上述双抗夹心酶联免疫检测试剂盒的进一步改进,兔抗杆状病毒GP64蛋白抗
    体的制备方法为:首次免疫采用抗原多点免疫,注射杆状病毒GP64蛋白;首次免疫后进行加
    强免疫,共进行3~5次加强免疫,最后一次加强免疫后取血。

    作为上述双抗夹心酶联免疫检测试剂盒的进一步改进,酶标板的处理方法为:酶
    标板的处理方法为:将一抗(抗杆状病毒GP64蛋白抗体用包被液稀释后加入酶标板),包被
    过夜,再用封闭液封闭,封存。

    作为上述双抗夹心酶联免疫检测试剂盒的进一步改进,标记二抗的为HRP。

    杆状病毒GP64蛋白的制备方法为:

    1)使用引物扩增杆状病毒GP64基因;

    2)使用扩增得到的杆状病毒GP64基因构建杆状病毒GP64基因原核表达载体并诱
    导表达;

    3)将表达得到的杆状病毒GP64蛋白分离、纯化得到杆状病毒GP64蛋白。

    一种检测杆状病毒GP64蛋白含量的方法,包括如下步骤:

    1)取出包被一抗的酶标板,加入杆状病毒GP64蛋白抗原标准品,孵育完成后弃去
    孔内液体,洗液清洗后拍干;

    2)加入HRP标记的抗杆状病毒GP64蛋白抗体(二抗),孵育完成后弃去孔内液体,洗
    液清洗后拍干;

    3)加入TMB显色液,室温反应显色;

    4)加入硫酸终止液;

    5)在酶标仪上测450nm下的OD值;

    6)根据标准曲线得到所述待检样品中杆状病毒GP64蛋白含量。

    作为上述方法的进一步改进,杆状病毒GP64蛋白抗原标准品浓度为0ng/ml~
    100ng/ml。

    作为上述方法的进一步改进,HRP标记的兔抗杆状病毒GP64蛋白抗体浓度为0.5μ
    g/ml~5μg/ml。

    本发明的有益效果是:

    本发明的试剂盒,操作简便,检测结果准确可靠,标准曲线线性为R2=0.9999,线
    性关系较好,线性范围在2ng/ml-100ng/ml,线性范围较理想。日内、日间准确度在95.3%-
    101.8%之间,精密度在4.2%-6.7%之间,表明试剂盒具有较好的准确度和精密度。不同批
    试剂盒对高、中、低浓度质控品进行测定,测定值的准确度在96.4%-100.2%之间,精密度
    在5.7%-8.6%之间,差异较小。

    附图说明

    图1是杆状病毒基因组中GP64基因扩增结果;

    图2是pET32a-N工程菌扩增结果;

    图3是杆状病毒GP64基因工程菌表达蛋白的SDS-PAGE分析;

    图4是杆状病毒GP64蛋白纯度分析;

    图5是蛋白含量测定标准曲线图;

    图6是杆状病毒GP64蛋白抗体纯度;

    图7是杆状病毒GP64蛋白SDS-PAGE(A)及其抗体Western blot(B)分析;

    图8是检测限和定量限实验的标准曲线;

    图9是准确度和精密度实验的标准曲线。

    具体实施方式

    为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解,下面结
    合具体实验,进一步阐述本发明。

    杆状病毒GP64蛋白的制备

    1材料

    TOP10和DE3感受态细胞;原核表达载体pET-32a(+);病毒DNA提取试剂盒;质粒提
    取试剂盒;DNA胶回收试剂盒;DNA marker;限制性内切酶和T4DNA连接酶;氯化钠、氯化钾、
    十二水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、酶标板、BSA标准品、Bradford蛋白测定试剂盒;KOD FX;
    HisTrap FF crude镍螯合层析柱;高速冷冻离心机;凝胶成像系统;紫外分光光度计;聚丙
    烯酰胺凝胶电泳及蛋白质转印系统;基因扩增仪;超声波破碎仪。

    2方法

    2.1杆状病毒GP64基因引物设计及PCR扩增

    根据GenBank中登录的杆状病毒GP64基因全长序列(NC_001623),采用引物,序列
    如下:GP64-PF:5′-CGGAATTCGCGGAGCACTGCAACGCGC-3′(引入EcoRⅠ酶切位点),GP64-PR:5′-
    GGGAAGCTTGCCGCCAAACTTGGTGTTCTC-3′(引入HindⅢ酶切位点)。

    2.2杆状病毒GP64基因原核表达载体的构建

    2.2.1提取杆状病毒基因组DNA;

    2.2.2利用引物扩增GP64蛋白基因;

    2.2.3胶回收目的条带,用EcoRⅠ和HindⅢ进行酶切,胶回收并纯化,再连入用相同
    酶消化的原核表达载体pET-32a(+)载体中,转化TOP10感受态细胞,得到pET32a-GP64重组
    表达载体;

    2.2.4经酶切鉴定再转化表达菌DE3感受态细胞,该菌种即为表达杆状病毒GP64蛋
    白的工程菌。

    2.3杆状病毒GP64基因的诱导表达

    2.3.1将构建好的pET32a-GP64工程菌接种于含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养
    基中,于37℃振荡培养过夜;

    2.3.2第二天按1:100的比例接种于新鲜LB培养基中,继续培养至菌液A600值约为
    0.6时,加入IPTG至终浓度分别为0.5mmol/L,诱导表达4h;

    2.3.3收集菌体,取1ml样品进行12%SDS-PAGE分析,同时设无GP64基因重组菌作
    为阴性对照;

    2.3.4确定杆状病毒GP64蛋白表达后,用PBS(含0.5%Triton X-100)重悬菌体,冰
    浴中超声裂解,4℃,12000×g离心30min,收集沉淀,于-20℃保存备用。

    2.4杆状病毒GP64蛋白的纯化及鉴定

    2.4.1用含2mol/L尿素的磷酸盐缓冲液(含500mmol/L NaCl,20mmol/L磷酸盐,
    pH7.4)溶解裂解后的菌体沉淀,12000×g离心30min,收集包涵体;

    2.4.2用含8mol/L尿素的磷酸盐缓冲液溶解包涵体,12000×g离心30min,收集上
    清,用0.45μm滤膜过滤;

    2.4.3利用HisTrap FF crude镍螯合层析柱对杆状病毒GP64蛋白进行纯化;

    2.4.4利用透析袋透析尿素,复性蛋白。

    2.5杆状病毒GP64蛋白含量测定

    2.5.1标准曲线制备:用PBS将1mg/ml BSA标准品稀释成:300μg/ml、250μg/ml、200
    μg/ml、150μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、0μg/ml。

    2.5.2待测样品制备:用PBS将样品按4倍进行稀释。

    2.5.3取20μl加入96孔板中,做3个复孔,再加入200μl Bradford试剂,然后在酶标
    仪上测595nm下的OD值。

    2.5.4以蛋白质浓度为横坐标,OD值为纵坐标,绘制标准曲线并计算待测样品蛋白
    含量。

    3结果

    3.1杆状病毒基因组中GP64基因扩增结果

    图1是杆状病毒基因组中GP64基因扩增结果。由结果可知,利用杆状病毒GP64基因
    引物对杆状病毒基因组进行PCR,扩增出1539bp左右的目的条带,与预期大小一致。

    3.2pET32a-GP64工程菌中GP64基因扩增结果

    结果如图2所示,由结果可知,利用杆状病毒GP64基因引物对构建的pET32a-GP64
    工程菌进行PCR,扩增出1539bp左右的目的条带,与预期大小一致,表明载体pET-32a-GP64
    构建成功。

    3.3杆状病毒GP64基因工程菌表达蛋白的SDS-PAGE分析

    结果如图3所示,由结果可知,杆状病毒GP64基因工程菌在75kDa左右位置有大量
    的表达蛋白,表明该菌体能成功表达杆状病毒GP64蛋白。

    3.4杆状病毒GP64蛋白纯度分析

    结果如图4所示,由结果可知,杆状病毒GP64蛋白在75kD左右,SDS-PAGE分析显示
    纯度较高。

    3.5杆状病毒GP64蛋白含量测定

    表1蛋白含量测定标准曲线

    浓度(μg/ml)
    平均OD值
    CV(%)
    300
    1.0113
    0.6
    250
    0.9540
    1.1
    200
    0.8873
    1.5
    150
    0.7927
    1.6
    100
    0.6847
    1.7
    50
    0.5493
    0.1
    0
    0.4780
    2.4
    杆状病毒GP64蛋白(稀释4倍)
    0.8957
    0.9

    其标准曲线如图5所示,由图可知,标准曲线相关系数为0.9939,杆状病毒GP64蛋
    白浓度为0.8957μg/ml。

    豚鼠抗杆状病毒GP64蛋白抗体血清和兔抗杆状病毒GP64蛋白抗体血清的制备

    1材料

    离心机、微型搅拌器、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、豚鼠、家兔、注射器、离心
    管、酒精棉、乌来糖麻醉剂。

    2方法

    2.1抗原乳化:佐剂与抗原按1:1体积比例加入离心管,在冰浴中用微型搅拌器快
    速搅拌进行乳化,当乳液滴入水中不扩散即可。

    2.2首次免疫:采用弗氏完全佐剂进行抗原乳化,豚鼠或家兔背部皮下多点免疫,
    前者注射杆状病毒GP64蛋白0.2mg/只,后者注射杆状病毒GP64蛋白0.5mg/只。

    2.3皮下注射操作:将豚鼠或家兔固定在手术台上,用酒精棉球消毒给药部位,左
    手充分提起给药部位皮肤,右手持注射器以45度角将注射针刺入皮下。确定针在皮下后缓
    缓注入药液。注射完毕后,用手指压住并轻柔刺入部位少许时间。

    2.4加强免疫:首次免疫14天后进行加强免疫,采用弗氏不完全佐剂进行抗原乳
    化,其它步骤与首次免疫相同,每次加强免疫间隔时间为10天,共进行3次加强免疫。

    2.5第三次加强免疫后的第5天进行心脏取血,固定好豚鼠或家兔,每只腹腔注射
    20%乌来糖麻醉剂进行麻醉。完全麻醉后,用剪刀剪开胸腔,暴露心脏位置,用一次性注射
    器从心尖处进针,针尖进入心室,缓慢回抽注射器,抽完血,拔掉针头,注射器贴着离心管壁
    缓慢推动,将注射器的血液沿着管壁流入离心管。

    2.6采集的血液于4℃过夜,第二天于3000rpm,离心10min,取上层血清于-70℃保
    存。

    间接ELISA法测定兔抗杆状病毒GP64蛋白抗体血清效价

    1材料

    酶标仪、酶标板、涡漩混合器、吐温-20、氯化钠、氯化钾、十二水磷酸氢二钠、磷酸
    二氢钾、NBS、TMB、浓硫酸。

    2溶液配制

    2.1包被液(碳酸盐缓冲液,pH9.5、0.05M):称Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.93g加超纯
    水800ml溶解,调pH9.5后加水至1000ml。

    2.2磷酸盐缓冲液(PBS):称氯化钠8g,氯化钾0.2g,十二水磷酸氢二钠1.42g,磷酸
    二氢钾0.27g,加超纯水1000ml溶解。

    2.3洗液:量取0.5ml吐温-20,加,加PBS 1000ml混匀。

    2.4封闭液:量取NBS 20ml,加洗液100ml溶解。

    2.5稀释液:量取NBS 2ml,加洗液100ml溶解。

    2.6终止液:量取超纯水178.3ml,逐滴加入浓硫酸21.7ml。

    3方法

    3.1用杆状病毒GP64蛋白以20μg/ml包被于96孔板,每孔加入100μl,置于4℃过夜,
    用洗液洗3遍,拍干。

    3.2每孔加入200μl封闭液,于37℃孵育2小时,用洗液洗3遍,拍干。

    3.3将兔抗杆状病毒GP64蛋白抗体血清按1:10000、1:50000、1:100000和1:200000
    比例稀释(阴性对照血清按相同倍比稀释),每孔加入100μl,37℃孵育1小时,用洗液洗3遍,
    拍干。

    3.4加入HRP标记的羊抗兔1:10000,每孔加100μl,37℃孵育1小时,用洗液洗6遍,
    拍干。

    3.5每孔加入100μl TMB显色液,室温显色反应10min。

    3.6每孔加入50μl终止液终止反应。

    3.7在酶标仪上测450nm下的OD值。当样品吸光值/阴性吸光值>2.1时,即认为是阳
    性,同时计算效价。

    4结果

    表2兔抗杆状病毒GP64蛋白抗体血清效价


    表3豚鼠抗杆状病毒GP64蛋白抗体血清效价


    由结果可知,兔抗杆状病毒GP64蛋白抗体血清和豚鼠抗杆状病毒GP64蛋白抗体血
    清的效价均大于1:200000,具有较高的效价。

    抗体纯化

    1材料

    Protein A sepharose,纯化仪,十二水磷酸氢二钠,,二水磷酸二氢钠,氯化钠,柠
    檬酸,Tris,氯化钾,磷酸二氢钾,0.45μm滤膜,透析袋。

    2溶液配制

    2.1 250mM Na2HPO4:称取Na2HPO4.12H2O 26.86g,加超纯水250ml,搅拌溶解,再加
    超纯水定容至300ml。

    2.2 250mM NaH2PO4:称取NaH2PO4.2H2O 2.75g,加超纯水70ml,搅拌溶解,再加超纯
    水定容至80ml。

    2.3 250mM PB(pH7.4):取250mM Na2HPO4溶液300ml,加入250mM NaH2PO471ml。

    2.4Buffer A(25mM PB,0.3M NaCl,pH7.4):取250mM PB缓冲液100ml,称取NaCl
    17.53g,加超纯水800ml搅拌溶解,再加超纯水定容至1000ml。

    2.5Buffer B(0.1M柠檬酸,pH3.0):称取柠檬酸10.50g,加超纯水400ml搅拌溶解,
    用1M NaOH溶解,调pH至3.0,再加超纯水定容至500ml。

    2.6Buffer C(1M Tris-Base):称取Tris-Base 12.11g,加超纯水80ml搅拌溶解,
    调pH8.0,再加超纯水定容至100ml。

    2.7磷酸盐缓冲液(PBS):称取氯化钠8g,氯化钾0.2g,十二水磷酸氢二钠1.42g,磷
    酸二氢钾0.27g,加超纯水1000ml溶解,调pH7.4,再加超纯水定溶至1000ml。

    3方法

    3.1将血清样品稀释3倍,补加NaCl浓度至2M,12000×g离心15min,取上清液,再过
    0.45μm滤膜。

    3.2Protein A层析柱用Buffer A平衡,流速3ml/min。

    3.3将处理过的样品以2.5ml/min的流速经过层析柱。

    3.4用Buffer A缓冲液以3ml/min的流速冲洗层析柱。

    3.5用Buffe B缓冲液以3ml/min的流速经过层析柱,观察280nm波长吸收值的变
    化,当280nm呈直线上升时,立即收集洗脱样品,至吸收值回归至基线水平停止收集,按每
    1ml洗脱液加入40μl Buffer C进行中和pH值至7.0~7.4范围。

    3.6将洗脱样品,装进透析袋,在PBS pH7.4缓冲液中透析,4℃,过夜。

    抗体验证

    1材料

    电泳仪,电泳槽,电磁炉,台式高速离心机,离心管,海绵,滤纸,PVDF膜,镊子,剪
    子,计时器,X-光片,X-光片暗夹,托盘,暗室灯,小塑料盒,显影液,定影液,ECL化学发光试
    剂。

    2溶液配制

    2.1电泳缓冲液:Tris Base 3.0g;甘氨酸18.8g;SDS 1g;加超纯水至1000ml。

    2.2转膜缓冲液:甘氨酸2.9g;Tris 5.8g;SDS 0.37g;甲醇200ml;加超纯水定容至
    1000ml。

    2.3PBS(0.01M,pH7.4)):NaCl 8.0g;KCl 0.2g;Na2HPO4 1.44g;KH2PO4 0.24g;加
    超纯水至1000ml。

    2.4PBST:吐温-20 0.5ml,加入PBS 1000ml。

    2.5膜染色液:考马斯亮兰0.25g;甲醇45ml;乙酸10ml;加超纯水至100ml。

    2.6封闭液(5%脱脂奶粉,现配):脱脂奶粉5g溶于1000ml PBST。

    3方法

    3.1SDS-PAGE电泳

    3.1.1制胶:按比例配制8%分离胶及5%浓缩胶,完全聚合后使用。

    3.1.2预电泳:拔去梳子,加入电泳缓冲液后低电压10V进行预电泳20min。

    3.1.3样品准备:按样品:上样buffer为4:1体积比加入上样bufer混匀,沸水煮
    10min,冰上5min。

    3.1.4加样:预电泳后加入标准品和待分析样品。每个泳道上样10μl。

    3.1.5电泳:加样完毕,选择90V恒压进行电泳,电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶
    交界处,更换至130V恒压电泳,电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处,即停止电泳。

    3.2染色

    3.2.1切胶:将电泳完毕的胶割取左半部分去掉浓缩胶部分并放在盛有电转液的
    玻璃皿中,另外部分放在盛有考马斯亮蓝染色液的玻璃皿中。

    3.2.2置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动,室温染色1h或更长时间。

    3.2.3倒出染色液,加入适量考马斯亮蓝染色脱色液,确保脱色液可以充分覆盖凝
    胶。置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动,室温脱色1h。期间更换脱色液2-4次,直至蓝色背
    景基本上全部被脱去,并且蛋白条带染色效果达到预期。通常蛋白条带在脱色30min后即可
    出现。

    3.2.4完成脱色后,用超纯水浸泡,并扫描最终结果。

    3.3转膜

    3.3.1切胶:将电泳完毕的胶去掉浓缩胶部分,其余完整的放在盛有电转液的玻璃
    皿中。

    3.3.2剪膜和滤纸:按胶的尺寸剪膜和滤纸(滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm,PVDF膜
    长宽较凝胶大0.5~1mm),膜放入甲醇中10s,然后将两者都放入盛有电转液的玻璃皿中
    5min。

    3.3.3向电转槽中倒入部分电转液,将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”,从正
    极到负极按如下顺序排列:正极-海绵-双层滤纸-PVDF膜-凝胶-双层滤纸-海绵-负极。(其
    中不能留有气泡)卡紧转膜板,电转槽中倒满电转液,将转膜板浸入电转槽中,注意正负极
    要正确。插上电源,设定恒流200mA转膜,冰浴电转60min。

    3.4膜的封闭:用PBST液洗涤印迹膜10s,加入5%脱脂奶粉封闭液,室温轻柔摇动
    封闭1.5h。

    3.5一抗孵育:按相应抗体的效价加入PBST稀释一抗,加入一抗约10ml,室温轻柔
    摇动孵育2h,用PBST洗涤膜4次,每次5min。

    3.6二抗孵育:按相应抗体的效价加入PBST稀释的二抗,加入二抗约10ml,室温轻
    柔摇动孵育1h,用PBST洗涤膜4次,每次5min。

    3.7ECL显色:在避光的容器中按A液:B液=1:1的比例配制1ml,将ECL工作液覆盖
    到膜表面,放置1min后在凝胶成像系统中观察拍照或者暗房内显影曝光。

    4结果

    结果如图6和图7所示。由结果可知,纯化的兔抗杆状病毒GP64蛋白抗体和豚鼠抗
    杆状病毒GP64蛋白抗体纯度较高。纯化的兔抗杆状病毒GP64蛋白抗体能够与杆状病毒GP64
    蛋白特异性结合,具有较高的特异性。

    辣根过氧化物酶标记兔抗杆状病毒GP64蛋白抗体

    1材料

    高碘酸钠(NaIO4)、硼氢化钠(NaBH4)、醋酸钠(NaAc)、醋酸(HAc)、碳酸钠(Na2CO3)、
    碳酸氢钠(NaHCO3)、硫酸铵、超纯水、透析袋。

    2溶液配制

    2.1 0.1M NaIO4:称取241mg高碘酸钠溶于10ml蒸馏水中(需新鲜配制)。

    2.2 1mM PH4.4醋酸钠缓冲液:取0.2M NaAc(1.361g/50ml)3.7ml,0.2M HAc
    (0.601ml/50ml)6.3ml,加超纯水至2000ml。

    2.3 0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液:称取Na2CO3 0.32g,NaHCO3 0.586g,加超纯水至
    50ml,再用超纯水作20倍稀释,即成0.01M pH9.5的碳酸盐缓冲液。

    2.4NaBH4溶液(4mg/ml):临用时称取NaBH4 4mg溶于1ml超纯水中。

    2.5磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4):称量KH2PO4 0.2g,Na2HPO4·12H2O 2.9g,
    NaCl8.0g,KCl 0.2g加超纯水至1000ml,调pH7.4。

    2.6 100%饱和硫酸铵:称取767g硫酸铵,加入超纯水1000ml,微波加热溶解,静置
    过夜,第二天有结晶析出,取上清即可。

    2.7半饱和硫酸铵:将100%饱和硫酸铵溶液按1:1体积比稀释。

    3方法

    3.1称取2mg HRP溶解于2ml超纯水中。

    3.2于上液中加入0.4ml新配的0.1M NaIO4溶液,室温下避光搅拌20min。

    3.3将上述溶液装入透析袋中,对1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析,4℃过夜。

    3.4加入40μl 0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液,然后立即加入约3mg抗体在2ml 0.01M碳
    酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌2h。

    3.5加入0.2ml新配的4mg/ml NaBH4液,混匀,再置4℃2h。

    3.6将上述混合液装入透析袋中,在PBS缓冲液中透析,4℃过夜。

    3.7将混合液从透析袋倒入离心管中,在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4
    ℃1h。

    3.8于3000rpm,4℃离心30min,弃上清。沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次,最后沉淀
    物用3ml PBS溶解。

    3.9将上述混合液装入透析袋中,对PBS缓冲液透析,去除铵离子后,12,000rpm离
    心10min去除沉淀,上清液即为酶结合物,分装后,于-20℃保存。

    棋盘法确定包被抗体和检测抗体的浓度

    1材料

    酶标仪、酶标板、涡漩混合器、吐温-20、氯化钠、氯化钾、十二水磷酸氢二钠、磷酸
    二氢钾、NBS、TMB、浓硫酸。

    2溶液配制

    2.1包被液(碳酸盐缓冲液,pH9.5、0.05M):称Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.93g加超纯
    水800ml溶解,调pH9.5后加水至1000ml。

    2.2磷酸盐缓冲液(PBS):称氯化钠8g,氯化钾0.2g,十二水磷酸氢二钠1.42g,磷酸
    二氢钾0.27g,加超纯水1000ml溶解。

    2.3洗液:量取0.5ml吐温-20,加,加PBS 1000ml混匀。

    2.4封闭液:量取NBS 20ml,加洗液100ml溶解。

    2.5稀释液:量取NBS 2ml,加洗液100ml溶解。

    2.6终止液:量取超纯水178.3ml,逐滴加入浓硫酸21.7ml。

    3方法

    3.1包被:用包被液将豚鼠抗杆状病毒GP64蛋白抗体按1:50、1:100、1:200、1:500
    和1:1000进行稀释,包被于96孔板,每孔加100μl,放入4℃冰箱过夜。

    3.2封闭:弃去孔内液体,用洗液洗3遍,拍干。每孔加入200μl封闭液,37℃封闭2h
    后,弃去孔内液体,用洗液洗涤3次,拍干。

    3.3加样:用稀释液将杆状病毒GP64蛋白稀释成500ng/ml和0ng/ml,每份样品加入
    100μl,做2个复孔,37℃孵育1h,弃去孔内液体,用洗液洗涤3次,拍干。

    3.4加检测抗体:用稀释液将HRP标记的兔抗杆状病毒GP64蛋白抗体按1:200、1:
    400和1:600稀释,每孔加100μl,37℃孵育1h,弃去孔内液体,用洗液洗涤6次,拍干。

    3.5加显色液:每孔加入100μl TMB显色液,室温下避光反应20min。

    3.6加终止液:每孔加入50μl终止液。

    3.7检测:15min内在酶标仪上测450nm下的OD值。

    4结果

    表4棋盘法优化结果


    由结果可知,当包被抗体为1:500,检测抗体为1:600时,结果较理想。

    检测限和定量限

    1材料

    酶标仪、酶标板、涡漩混合器、吐温-20、氯化钠、氯化钾、十二水磷酸氢二钠、磷酸
    二氢钾、NBS、TMB、浓硫酸。

    2溶液配制

    2.1包被液(碳酸盐缓冲液,pH9.5、0.05M):称Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.93g加超纯
    水800ml溶解,调pH9.5后加水至1000ml。

    2.2磷酸盐缓冲液(PBS):称氯化钠8g,氯化钾0.2g,十二水磷酸氢二钠1.42g,磷酸
    二氢钾0.27g,加超纯水1000ml溶解。

    2.3洗液:量取0.5ml吐温-20,加,加PBS 1000ml混匀。

    2.4封闭液:量取NBS 20ml,加洗液100ml溶解。

    2.5稀释液:量取NBS 2ml,加洗液100ml溶解。

    2.6终止液:量取超纯水178.3ml,逐滴加入浓硫酸21.7ml。

    3方法

    检测限(灵敏度)是对20份阴性对照样品进行测定,取平均值后加2倍标准差,即X+
    2S,代入标准方程中,计算出来的浓度即为本试剂盒的灵敏度,重复3次实验。定量限是将杆
    状病毒GP64蛋白稀释至最低浓度,最低浓度的准确度应在80%-120%,变异系数应小于
    20%,重复5次实验。

    3.1包被:用包被液将豚鼠抗杆状病毒GP64蛋白抗体按1:500进行稀释,包被于96
    孔板,每孔加100μl,放入4℃冰箱过夜。

    3.2封闭:弃去孔内液体,用洗液洗3遍,拍干。每孔加入200μl封闭液,37℃封闭2h
    后,弃去孔内液体,用洗液洗涤3次,拍干。

    3.3加样:用稀释液将杆状病毒GP64蛋白稀释成100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、
    10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml、1ng/ml、0.5ng/ml和0ng/ml,每份样品加入100μl,做4个复孔,37
    ℃孵育1h,弃去孔内液体,用洗液洗涤3次,拍干。

    3.4加检测抗体:用稀释液将HRP标记的兔抗杆状病毒GP64蛋白抗体按1:600稀释,
    每孔加100μl,37℃孵育1h,弃去孔内液体,用洗液洗涤6次,拍干。

    3.5加显色液:每孔加入100μl TMB显色液,室温下避光反应20min。

    3.6加终止液:每孔加入50μl终止液。

    3.7检测:15min内在酶标仪上测450nm下的OD值。

    3结果

    表5检测限


    表6定量限

    实验编号
    理论值(ng/ml)
    平均测量值(ng/ml)
    准确度(%)
    CV(%)
    1
    2
    2.23
    111.4
    2.7
    2
    2
    2.19
    109.6
    1.9
    3
    2
    1.91
    95.4
    2.2
    4
    2
    2.10
    105.2
    2.3
    5
    2
    2.05
    102.6
    5.1

    由结果可知,杆状病毒蛋白GP64双抗夹心Elisa法的检测限为0.49ng/ml,定量限
    为2ng/ml。

    标准曲线的确定

    1材料

    酶标仪、酶标板、涡漩混合器、吐温-20、氯化钠、氯化钾、十二水磷酸氢二钠、磷酸
    二氢钾、NBS、TMB、浓硫酸。

    2方法

    2.1包被:用包被液将豚鼠抗杆状病毒GP64蛋白抗体按1:500进行稀释,包被于96
    孔板,每孔加100μl,放入4℃冰箱过夜。

    2.2封闭:弃去孔内液体,用洗液洗3遍,拍干。每孔加入200μl封闭液,37℃封闭2h
    后,弃去孔内液体,用洗液洗涤3次,拍干。

    2.3加样:用稀释液将杆状病毒GP64蛋白稀释成100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、
    10ng/ml、5ng/ml、2ng/ml和0ng/ml,每份样品加入100μl,做4个复孔,37℃孵育1h,弃去孔内
    液体,用洗液洗涤3次,拍干。

    2.4加检测抗体:用稀释液将HRP标记的兔抗杆状病毒GP64蛋白抗体按1:600稀释,
    每孔加100μl,37℃孵育1h,弃去孔内液体,用洗液洗涤6次,拍干。

    2.5加显色液:每孔加入100μl TMB显色液,室温下避光反应20min。

    2.6加终止液:每孔加入50μl终止液。

    2.7检测:15min内在酶标仪上测450nm下的OD值。

    3结果

    表7标准曲线

    浓度(ng/ml)
    平均OD值
    CV(%)
    100
    1.3598
    2.9
    50
    0.8758
    1.6
    20
    0.4368
    3.1
    10
    0.2500
    2.8
    5
    0.1528
    2.9
    2
    0.0922
    3.5
    0
    0.0515
    7.6

    其标准曲线如图8所示。

    由结果可知,标准曲线线性为R2=0.9999,线性关系较好,线性范围在2ng/ml-
    100ng/ml,线性范围较理想。

    准确度和精密度

    1材料

    酶标仪、酶标板、涡漩混合器、吐温-20、氯化钠、氯化钾、十二水磷酸氢二钠、磷酸
    二氢钾、NBS、TMB、浓硫酸。

    2方法

    日内准确度和精密度是一天内分别对高、中、低浓度(60ng/ml、30ng/ml、6ng/ml)
    进行测定,每个浓度重复20次。日间准确度和精密度是每天分别对高、中、低浓度(60ng/ml、
    30ng/ml、6ng/ml)进行测定,每个浓度重复4次,测定5天。

    2.1包被:用包被液将豚鼠抗杆状病毒GP64蛋白抗体按1:500进行稀释,包被于96
    孔板,每孔加100μl,放入4℃冰箱过夜。

    2.2封闭:弃去孔内液体,用洗液洗3遍,拍干。每孔加入200μl封闭液,37℃封闭2h
    后,弃去孔内液体,用洗液洗涤3次,拍干。

    2.3加样:加入杆状病毒GP64蛋白100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、
    2ng/ml和0ng/ml标准品溶液和60ng/ml、30ng/ml和6ng/ml质控品,每份样品加入100μl,做4
    个复孔,37℃孵育1h,弃去孔内液体,用洗液洗涤3次,拍干。

    2.4加检测抗体:加入HRP标记的兔抗杆状病毒GP64蛋白抗体溶液,每孔加100μl,
    37℃孵育1h,弃去孔内液体,用洗液洗涤6次,拍干。

    2.5加显色液:每孔加入100μl TMB显色液,室温下避光反应20min。

    2.6加终止液:每孔加入50μl终止液。

    2.7检测:15min内在酶标仪上测450nm下的OD值。

    3结果

    3.1日内准确度和精密度

    表8标准曲线

    浓度(ng/ml)
    平均OD值
    CV(%)
    100
    1.3628
    3.3
    50
    0.8668
    2.7
    20
    0.4220
    1.1
    10
    0.2543
    2.0
    5
    0.1560
    3.4
    2
    0.0978
    2.7
    0
    0.0561
    4.4

    其标准曲线如图9所示。

    表9日内准确度和精密度

    理论值(ng/ml)
    实际测定平均值(ng/ml)
    准确度(%)
    CV(%)
    高浓度(60)
    57.9
    96.5
    4.2
    中浓度(30)
    28.7
    95.3
    6.0
    低浓度(6)
    5.7
    95.6
    6.7

    3.2日间准确度和精密度

    表10标准曲线方程

    时间
    标准曲线方程
    相关系数(R2)
    1d
    Y=-0.00006X2+0.0193X+0.0614
    0.9999
    2d
    Y=-0.00009X2+0.024X+0.0756
    0.9996
    3d
    Y=-0.00005X2+0.0169X+0.0713
    0.9992
    4d
    Y=-0.00006X2+0.0176X+0.0672
    0.9998
    5d
    Y=-0.00004X2+0.0155X+0.0607
    0.9999

    表11日间准确度和精密度

    理论值(ng/ml)
    实际测定平均值(ng/ml)
    准确度(%)
    CV(%)
    高浓度(60)
    61.1
    101.8
    6.1
    中浓度(30)
    30.3
    100.9
    6.7
    低浓度(6)
    5.8
    96.1
    6.2

    由结果可知,日内、日间准确度在95.3%-101.8%之间,精密度在4.2%-6.7%之
    间,表明试剂盒具有较好的准确度和精密度。

    批间差异

    1材料

    酶标仪、酶标板、涡漩混合器、吐温-20、氯化钠、氯化钾、十二水磷酸氢二钠、磷酸
    二氢钾、NBS、TMB、浓硫酸。

    2方法

    制备3批试剂盒,对高、中、低浓度(60ng/ml、30ng/ml、6ng/ml)进行测定,每个浓度
    重复4次,分析批间的差异。

    2.1包被:用包被液将豚鼠抗杆状病毒GP64蛋白抗体按1:500进行稀释,包被于96
    孔板,每孔加100μl,放入4℃冰箱过夜。

    2.2封闭:弃去孔内液体,用洗液洗3遍,拍干。每孔加入200μl封闭液,37℃封闭2h
    后,弃去孔内液体,用洗液洗涤3次,拍干。

    2.3加样:加入杆状病毒GP64蛋白100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、
    2ng/ml和0ng/ml标准品溶液和60ng/ml、30ng/ml和6ng/ml质控品,每份样品加入100μl,做4
    个复孔,37℃孵育1h,弃去孔内液体,用洗液洗涤3次,拍干。

    2.4加检测抗体:加入HRP标记的兔抗杆状病毒GP64蛋白抗体溶液,每孔加100μl,
    37℃孵育1h,弃去孔内液体,用洗液洗涤6次,拍干。

    2.5加显色液:每孔加入100μl TMB显色液,室温下避光反应20min。

    2.6加终止液:每孔加入50μl终止液。

    2.7检测:15min内在酶标仪上测450nm下的OD值。

    3结果

    表12批间差异分析

    理论值(ng/ml)
    实际测定平均值(ng/ml)
    准确度(%)
    CV(%)
    高浓度(60)
    60.0
    100.0
    7.2
    中浓度(30)
    30.1
    100.2
    8.6
    低浓度(6)
    5.8
    96.4
    5.7

    由结果可知,不同批试剂盒对高、中、低浓度质控品进行测定,测定值的准确度在
    96.4%-100.2%之间,精密度在5.7%-8.6%之间,差异较小。

    重组蛋白疫苗中杆状病毒蛋白残留量测定

    1材料

    酶标仪、酶标板、涡漩混合器、吐温-20、氯化钠、氯化钾、十二水磷酸氢二钠、磷酸
    二氢钾、NBS、TMB、浓硫酸。

    2方法

    2.1包被:用包被液将豚鼠抗杆状病毒GP64蛋白抗体按1:500进行稀释,包被于96
    孔板,每孔加100μl,放入4℃冰箱过夜。

    2.2封闭:弃去孔内液体,用洗液洗3遍,拍干。每孔加入200μl封闭液,37℃封闭2h
    后,弃去孔内液体,用洗液洗涤3次,拍干。

    2.3加样:加入杆状病毒GP64蛋白100ng/ml、50ng/ml、20ng/ml、10ng/ml、5ng/ml、
    2ng/ml和0ng/ml标准品溶液和经过2倍稀释的重组蛋白疫苗纯化样品,每份样品加入100μ
    l,做4个复孔,37℃孵育1h,弃去孔内液体,用洗液洗涤3次,拍干。

    2.4加检测抗体:加入HRP标记的兔抗杆状病毒GP64蛋白抗体溶液,每孔加100μl,
    37℃孵育1h,弃去孔内液体,用洗液洗涤6次,拍干。

    2.5加显色液:每孔加入100μl TMB显色液,室温下避光反应20min。

    2.6加终止液:每孔加入50μl终止液。

    2.7检测:15min内在酶标仪上测450nm下的OD值。

    3结果

    经测定,重组蛋白疫苗A中杆状病毒蛋白残留量为1.8ng/ml,重组蛋白疫苗B中杆
    状病毒蛋白残留量为6.4ng/ml,表明重组蛋白疫苗中杆状病毒蛋白残留量较低。

    SEQUENCE LISTING

    <110> 广东华南联合疫苗开发院有限公司

    <120> 一种用于检测杆状病毒GP64蛋白的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及方法

    <130> GP64

    <160> 2

    <170> PatentIn version 3.5

    <210> 1

    <211> 27

    <212> DNA

    <213> 人工引物

    <400> 1

    cggaattcgc ggagcactgc aacgcgc 27

    <210> 2

    <211> 30

    <212> DNA

    <213> 人工引物

    <400> 2

    gggaagcttg ccgccaaact tggtgttctc 30

    关于本文
    本文标题:一种用于杆状病毒GP64蛋白的双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及方法.pdf
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