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    重庆时时彩10分走势图: SP8蛋白及其应用、SP8蛋白抗体的制备方法、应用及杂交瘤细胞.pdf

    关 键 词:
    SP8 蛋白 及其 应用 抗体 制备 方法 杂交瘤 细胞
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    摘要
    申请专利号:

    CN201611167176.1

    申请日:

    2016.12.16

    公开号:

    CN106771240A

    公开日:

    2017.05.31

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/68申请日:20161216|||公开
    IPC分类号: G01N33/68; C07K16/18; C07K14/47; C12N5/20; C12R1/91(2006.01)N 主分类号: G01N33/68
    申请人: 成都朴华科技有限公司
    发明人: 许文明; 刘畅
    地址: 610000 四川省成都市高新区高朋大道5号1幢206室
    优先权:
    专利代理机构: 北京超凡志成知识产权代理事务所(普通合伙) 11371 代理人: 李丙林
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201611167176.1

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.06.23|||2017.05.31

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明提供了SP8蛋白及其应用、SP8蛋白抗体的制备方法、应用及杂交瘤细胞,属于基因工程技术领域。SP8蛋白作为标志物在制备男性不育检测试剂盒中的应用,以SP8蛋白作为检测靶点,具有很好的灵敏性和特异性;SP8蛋白抗体在制备男性不育检测试剂盒中的应用,该试剂盒包括胶体金试剂盒或酶联免疫试剂盒,SP8蛋白抗体与SP8蛋白具有抗原抗体反应,反应灵敏,特异性强;一种SP8蛋白抗体的制备方法,包括蛋白表达步骤、细胞融合步骤、抗体制备步骤,这种方法能通过简单易行的操作、普通的条件就能大量获得SP8蛋白抗体;同时获得杂交瘤细胞能大量的分泌SP8蛋白抗体。

    权利要求书

    1.SP8蛋白作为标志物在制备男性不育检测试剂盒中的应用,其特征在于,所述SP8蛋
    白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
    2.SP8蛋白抗体在制备男性不育检测试剂盒中的应用,其特征在于,所述SP8蛋白抗体
    与所述SP8蛋白具有抗原抗体反应,所述SP8蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
    3.一种男性不育检测试剂盒,其特征在于,所述男性不育检测试剂盒是胶体金试剂盒
    或酶联免疫试剂盒,所述胶体金试剂盒和所述酶联免疫试剂盒均包括所述SP8蛋白抗体,所
    述SP8蛋白抗体与所述SP8蛋白具有抗原抗体反应,所述SP8蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1
    所示。
    4.根据权利要求3所述的男性不育检测试剂盒,其特征在于,所述胶体金试剂盒包括试
    纸条,所述SP8蛋白抗体包被于所述试纸条的检测线。
    5.一种SP8蛋白抗体的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
    蛋白表达步骤:将重组载体转化表达菌株表达得到所述SP8蛋白,所述重组载体包括有
    能表达所述SP8蛋白的Sp8基因,所述SP8蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID No.1所示;
    细胞融合步骤:用所述SP8蛋白免疫第一宿主动物,研磨经免疫后的所述第一宿主动物
    的脾脏,得到脾细胞,将所述脾细胞与骨髓瘤细胞融合,得到融合的杂交瘤细胞,所述第一
    宿主动物是小鼠;
    抗体制备步骤:将所述杂交瘤细胞注射第二宿主动物腹腔,7-10天后,取所述第二宿主
    动物的腹水,纯化所述腹水得到所述SP8蛋白抗体。
    6.根据权利要求5所述SP8蛋白抗体的制备方法,其特征在于,所述Sp8基因的碱基序列
    如SEQ ID No.2所示。
    7.根据权利要求5所述SP8蛋白抗体的制备方法,其特征在于,所述表达菌株为大肠杆
    菌、酵母菌或农杆菌。
    8.根据权利要求5所述SP8蛋白抗体的制备方法,其特征在于,用所述SP8蛋白免疫所述
    第一宿主动物是指:将所述SP8蛋白、弗氏佐剂和YOULONG佐剂按照1.8-2.2:0.8-1.1:0.8-
    1.2的体积比混合后,得到乳化液,将所述乳化液免疫所述第一宿主动物。
    9.根据权利要求5所述SP8蛋白抗体的制备方法,其特征在于,所述第二宿主动物为小
    鼠或家兔或山羊。
    10.一种用于产生SP8蛋白抗体的杂交瘤细胞,其特征在于,其保藏编号是CGMCC
    No.13284,所述杂交瘤细胞产生的所述SP8蛋白抗体与所述SP8蛋白具有抗原抗体反应,所
    述SP8蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID No.1所示。

    说明书

    SP8蛋白及其应用、SP8蛋白抗体的制备方法、应用及杂交瘤细胞

    技术领域

    本发明涉及基因工程技术领域,特别涉及SP8蛋白及其应用、SP8蛋白抗体的制备
    方法、应用及杂交瘤细胞。

    背景技术

    随着现在生活的压力的加大,男性不育的比例也在不断的增长,加上男性的生活
    习惯,比如酗酒、吸烟等都会影响甚至导致男性不育。男性不育的问题给渴望做父母的人带
    来很大的伤害。

    无精子症或严重少精子症的发病原因可分为睾丸前性、睾丸性和睾丸后性三大
    类。如果是由于在睾丸精子发生过程中精子发生出现障碍,则称为睾丸性的精子发生障碍;
    如果是由于附睾或输精管阻塞,而精子发生正常则称为梗阻性无精子症,准确鉴别这两种
    不同的病理类型对于不育症的处置具有重要的临床价值。目前对于无精症或严重少精子症
    的确诊主要基于睾丸穿刺活组织病理学检查,睾丸穿刺为有创性诊断技术,不能反复进行,
    存在出血、感染并发症的可能,病人接受度不高。另外,由于穿刺取样部位的随机性,不能准
    确判断睾丸精子发生情况。

    市场上的检测试剂盒大多是通过检测精细胞的SP10蛋白位点,该类检测灵敏度也
    不尽如人意,容易误检;容易给被检测人带来一些负面的影响。

    发明内容

    本发明的第一目的在于提供SP8蛋白作为标志物在制备男性不育检测试剂盒中的
    应用;该应用以SP8蛋白作为男性不育症检测的蛋白靶点,其具有更好的灵敏度和特异性。

    本发明的第二目的在于提供SP8蛋白抗体在制备男性不育检测试剂盒中的应用,
    该试剂盒中的SP8蛋白抗体,专门针对SP8蛋白,针对性更强,反应更灵敏。

    本发明的第三目的在于提供一种男性不育检测试剂盒,该试剂盒能够更准确地检
    测出待测样本中的SP8蛋白浓度。

    本发明的第四目的在于提供一种SP8蛋白抗体的制备方法,该方法简单易行,操作
    方便,制备的SP8蛋白抗体与SP8蛋白具有更好结合能力,针对性强,反应灵敏,制备的浓度
    较高,利于大量制备。

    本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的:

    SP8蛋白作为标志物在制备男性不育检测试剂盒中的应用,SP8蛋白氨基酸序列如
    SEQ ID No.1所示。

    SP8蛋白抗体在制备男性不育检测试剂盒中的应用,SP8蛋白抗体与SP8蛋白具有
    抗原抗体反应,SP8蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

    一种男性不育检测试剂盒,该男性不育检测试剂盒是胶体金试剂盒或酶联免疫试
    剂盒,胶体金试剂盒和酶联免疫试剂盒均包括SP8蛋白抗体,SP8蛋白抗体与SP8蛋白具有抗
    原抗体反应,SP8蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

    一种SP8蛋白抗体的制备方法,包括如下步骤:

    蛋白表达步骤:将重组载体转化表达菌株表达得到SP8蛋白,重组载体包括有能表
    达SP8蛋白的Sp8基因,SP8蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID No.1所示。

    细胞融合步骤:用SP8蛋白免疫第一宿主动物,研磨经免疫后的第一宿主动物的脾
    脏得到脾细胞,将脾细胞与骨髓瘤细胞融合,得到融合的杂交瘤细胞,第一宿主动物是小
    鼠。

    抗体制备步骤:将杂交瘤细胞注射第二宿主动物腹腔,7-10天后,取第二宿主动物
    的腹水,纯化腹水得到SP8蛋白抗体。

    与现有技术相比,本发明的有益效果是:相对于现有的以SP10蛋白作为标志物用
    于检测男性不育症,本发明提供的SP8蛋白作为标志物在制备男性不育检测试剂盒中的应
    用,其具有更好的灵敏度和特异性,该两项指标均达到100%。

    具体实施方式

    为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中
    的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建
    议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产
    品。

    下面对本发明实施例的SP8蛋白及SP8蛋白抗体的应用作进一步的说明。

    男性不育很多情况是无精子症或严重少精子症。SP8蛋白是一种在男性的睾丸特
    异表达的蛋白,本研究表明其在精子膜表达,并分泌到精浆,是一个在精子运动调节作用中
    起重要作用的蛋白。通过SP8蛋白免疫小鼠等宿主动物,制备针对SP8蛋白的抗体,将抗体制
    备成试剂盒,能快速准确的鉴定样品中是否含有SP8蛋白。

    SP8蛋白作为标志物在制备男性不育检测试剂盒中的应用,SP8蛋白氨基酸序列如
    SEQ ID No.1所示。SP8蛋白作为男性不育检测的蛋白靶点,具有更高的特异性,在抗原抗体
    反应中的检测灵敏度就更高。该男性不育检测试剂盒的应用以SP8蛋白作为检测靶点,根据
    检测出的SP8蛋白浓度用以判断是否患有男性不育症。SP8蛋白作为检测靶点其具有较高的
    灵敏度和特异性。

    SP8蛋白抗体在制备男性不育检测试剂盒中的应用,SP8蛋白抗体与SP8蛋白具有
    抗原抗体反应,SP8蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。针对SP8蛋白而制备的抗体,特异
    性也更高,更容易取得检测结果。该男性不育检测试剂盒含有SP8蛋白抗体,用以检测待测
    样本中的SP8蛋白浓度,根据检测出的SP8蛋白浓度判断是否患有男性不育症。

    一种男性不育检测试剂盒,所述男性不育检测试剂盒是胶体金试剂盒或酶联免疫
    试剂盒,胶体金试剂盒和所述酶联免疫试剂盒均包括SP8蛋白抗体,SP8蛋白抗体与SP8蛋白
    具有抗原抗体反应,SP8蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

    进一步地,当男性不育检测试剂盒是胶体金试剂盒时,胶体金试剂盒包括试纸条,
    SP8蛋白抗体包被于试纸条的检测线。

    胶体金试剂盒是一类能快速定性分析的试剂盒,能快速获知检测的结果;而酶联
    免疫试剂盒检测步骤略多,但是酶联免疫试剂盒是能够定量分析的试剂盒。

    本发明实施例提供一种SP8蛋白抗体的制备方法,包括如下步骤:

    蛋白表达步骤:将重组载体转化表达菌株表达得到SP8蛋白,重组载体包括有能表
    达SP8蛋白的Sp8基因。其中,SP8蛋白的氨基酸序列为如SEQ ID No.1所示。

    进一步地,本发明的较佳实施例中,上述Sp8基因使用的是去掉信号肽表达片段的
    基因;上述表达菌株为大肠杆菌、酵母菌、乳酸菌或农杆菌等。蛋白表达的表达菌株可以选
    用很多的菌株,本发明优选常见和常用的大肠杆菌、酵母菌或农杆菌作为表达菌株。

    细胞融合步骤:用SP8蛋白免疫第一宿主动物,研磨免疫后的第一宿主动物的脾
    脏,得到脾细胞,将脾细胞与骨髓瘤细胞融合,得到融合的杂交瘤细胞,第一宿主动物为小
    鼠。

    抗体制备步骤:将杂交瘤细胞注射第二宿主动物腹腔,7-10天后,取第二宿主动物
    的腹水,纯化腹水得到SP8蛋白抗体。

    进一步地,本发明的较佳实施例中,上述SP8蛋白免疫第一宿主动物是指:将SP8蛋
    白、弗氏佐剂和YOULONG佐剂按照1.8-2.2:0.8-1.1:0.8-1.2的体积比混合后,得到乳化液,
    用乳化液免疫第一宿主动物。其中,弗氏佐剂、YOULONG佐剂等均为常规试剂。

    进一步地,本发明的较佳实施例中,第二宿主动物为小鼠或家兔或山羊。试验中的
    第一宿主动物和第二宿主动物可以包括很多的哺乳动物,但是从实验的可行性和可操作性
    分析,并且从经济节约的角度考虑,本实验将第一宿主动物优选为小鼠,将第一宿主动物优
    选为小鼠、家兔和山羊。

    本发明提供的杂交瘤细胞,其能够产生SP8蛋白抗体,其生物保藏信息:分类命名
    为抗体细胞株,于2016年11月18日在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生
    物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号:CGMCC
    No.13284。

    以下结合实施例对本发明一种SP8蛋白抗体制备方法、应用及制备试剂盒作进一
    步的详细描述。

    实施例1

    本实施例提供的一种SP8蛋白抗体的制备方法,包括如下步骤:

    蛋白表达步骤:将能表达SP8蛋白的Sp8基因通过酶切连接,重组到pET-30a载体
    上,得到重组载体,将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,得到表达菌种;取活化
    的表达菌种,以1:50的接种量接种到500mL的液体LB培养基(卡那霉素的浓度50μg/mL)中,
    待培养基的OD值在0.4到0.6的时候,加入浓度为0.8mM的IPTG,37℃诱导表达12h,获得SP8
    蛋白。

    细胞融合步骤:将获得的SP8蛋白、弗氏佐剂和YOULONG佐剂按照2.2:1.1:1.2的体
    积比混合后,得到乳化液;用乳化液免疫Balb/c小鼠,取免疫过的Balb/c小鼠的脾脏,磨碎
    过80目筛网,得到的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG4000作用下融合,筛选得到阳性的杂
    交瘤细胞。该杂交瘤细胞,其生物保藏信息:分类命名为抗体细胞株,于2016年11月18日在
    位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管
    理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号:CGMCC No.13284。

    抗体制备步骤:将获得的阳性的杂交瘤细胞,将杂交瘤细胞配成杂交瘤细胞悬浮
    液,细胞密度为8×105个/mL;用1.5mL杂交瘤细胞悬浮液注射小鼠腹腔,10天后,取小鼠的
    腹水,纯化腹水得到SP8蛋白抗体。

    实施例2

    本实施例提供的一种SP8蛋白抗体的制备方法,包括如下步骤:

    蛋白表达步骤:将能表达SP8蛋白的Sp8基因通过酶切连接,重组到pET-30a载体
    上,得到重组载体,将重组载体转化酵母菌感受态细胞,得到表达菌种;取活化的表达菌种,
    诱导大量表达SP8蛋白,获得SP8蛋白。

    细胞融合步骤:将获得的SP8蛋白、弗氏佐剂和YOULONG佐剂按照2.0:0.8:1.2的体
    积比混合后,得到乳化液;用乳化液免疫Balb/c小鼠,取免疫过的Balb/c小鼠的脾脏,磨碎
    过90目筛网,得到的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG4000作用下融合,筛选得到阳性的杂
    交瘤细胞。

    抗体制备步骤:将获得的阳性的杂交瘤细胞,将杂交瘤细胞配成杂交瘤细胞悬浮
    液,细胞密度为1×106个/mL;用1.2mL杂交瘤细胞悬浮液注射山羊腹腔,8天后,取山羊的腹
    水,纯化腹水得到SP8蛋白抗体。

    实施例3

    本实施例提供的一种SP8蛋白抗体的制备方法,包括如下步骤:蛋白表达步骤:将
    能表达SP8蛋白的Sp8基因通过酶切连接,重组到pET-30a载体上,得到重组载体,将重组载
    体热激法转化农杆菌GV3101感受态细胞,得到表达菌种;取活化的表达菌种,大量表达SP8
    蛋白,获得SP8蛋白。

    细胞融合步骤:将获得的SP8蛋白、弗氏佐剂和YOULONG佐剂按照2.0:1.0:1.0的体
    积比混合后,得到乳化液;用乳化液免疫Balb/c小鼠,取免疫过的Balb/c小鼠的脾脏,磨碎
    过100目筛网,得到的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG4000作用下融合,筛选得到阳性的杂
    交瘤细胞。

    抗体制备步骤:将获得的阳性的杂交瘤细胞,将杂交瘤细胞配成杂交瘤细胞悬浮
    液,细胞密度为1.2×106个/mL;用1.0mL杂交瘤细胞悬浮液注射家兔腹腔,8天后,取家兔的
    腹水,纯化腹水得到SP8蛋白抗体。

    实施例4

    本实施例提供的一种SP8蛋白抗体的制备方法,包括如下步骤:

    蛋白表达步骤:将能表达SP8蛋白的Sp8基因通过酶切连接,重组到pET-32a载体
    上,得到重组载体,将重组载体热激法转化大肠杆菌Rosetta感受态细胞,得到表达菌种;取
    活化的表达菌种,大量表达SP8蛋白,获得SP8蛋白。

    细胞融合步骤:将获得的SP8蛋白、弗氏佐剂和YOULONG佐剂按照1.8:0.8:0.8的体
    积比混合后,得到乳化液;用乳化液免疫Balb/c小鼠,取免疫过的Balb/c小鼠的脾脏,磨碎
    过80目筛网,得到的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG4000作用下融合,筛选得到阳性的杂
    交瘤细胞。

    抗体制备步骤:将获得的阳性的杂交瘤细胞,将杂交瘤细胞配成杂交瘤细胞悬浮
    液,细胞密度为1.0×106个/mL;用1.0mL杂交瘤细胞悬浮液注射家兔腹腔,10天后,取家兔
    的腹水,纯化腹水得到SP8蛋白抗体。

    实施例5

    本实施例提供了一种检测男性不育的试剂盒。

    该检测男性不育的试剂盒是胶体金试剂盒。该试剂盒包括试纸条,试纸条上设置
    有质控线和检测线,检测线包被有由实施例1得到的SP8蛋白抗体。

    使用方法,取样品1mL加到EP管中,同时取SP8蛋白标准品用缓冲液稀释到工作浓
    度;取试纸条分别放入EP管中并计时;5-15min后观察反应结果;如果质控线和检测线均有
    颜色反应,且与标准品的反应一致,就可以判断样品含有SP8蛋白靶点;如果阴性对照显示
    仅质控线显色,说明试纸条正常,若检测结果与阴性对照反应一致,说明样本不含SP8蛋白
    靶点?;撼逡嚎梢宰员敢部梢允泄?。

    该检测男性不育的试剂盒以SP8蛋白作为靶点,能够快速准确的检测并得出结果,
    说明该试剂盒具有很好地灵敏度和特异性。

    实施例6

    本实施例提供了一种检测男性不育的酶联免疫试剂盒。

    该检测男性不育的酶联免疫试剂盒,SP8蛋白抗体(通过实施例1提供的方法获
    得)。

    采用本实施例提供的检测男性不育的酶联免疫试剂盒进行检测的方法:1、设置空
    白孔,只添加显色液和终止液;待测样本和不同浓度的SP8蛋白标准品100μL分别加到相应
    的酶标板的孔里,密封酶标板,孵育30-120min;2、洗涤液洗板3-5次,拍干;3、加入酶标试剂
    50μL,空白孔不加酶标试剂;4、孵育30-120min,洗涤液洗板3-5次,6、加入显色剂100μL,轻
    轻混匀,37℃避光反应10-20min;7、终止反应并读数,加入终止液50μL,终止反应,以450nm
    波长读数。

    根据空白孔调零酶标仪,根据不同浓度的标准品的读数建立一个标准曲线,根据
    标准曲线和样本的OD450值,计算出样本的SP8蛋白浓度,并根据SP8蛋白的浓度及相应的用
    以判断男性不育症的标准值,对样本做出相应的评价。

    所用的酶标板、SP8蛋白标准品及稀释液、酶标试剂显色剂A和B、终止液和洗涤液
    均购买

    该检测男性不育的试剂盒以SP8蛋白作为靶点,以实施例1制备的SP8蛋白抗体预
    先包被酶标板,通过酶联免疫吸附测定,能精确的读取计算出样本的SP8蛋白的含量,即使
    SP8蛋白的含量很低也能被检出,所以该检测男性不育的试剂盒具有很好的检测灵敏度和
    抗原抗体结合的特异性。

    实施例7

    本实施例提供了一种检测男性不育的酶联免疫试剂盒。

    该检测男性不育的酶联免疫试剂盒包括SP8蛋白抗体(由实施例1的方法制得),以
    及酶标板、SP8蛋白标准品及稀释液、酶标试剂显色剂A和B、终止液和洗涤液。

    检测方法同实施例6。

    效果同实施例6。

    试验例1

    抗体配对检测,取实施例1-4制备的SP8蛋白抗体,进行抗体配对检测实验。参考以
    下步骤:

    1.1包被:将实施例1-4得到的SP8蛋白抗体分别用CB buffer稀释至5ug/ml,分别
    加入酶标板孔中,每孔100ul,37℃包被3小时。每个实施例的SP8蛋白抗体均设置一个阳性
    对照组和一个阴性对照组。

    1.2封闭:洗涤上述包被有SP8蛋白抗体酶标板3次,拍干,用CB buffer稀释羊血清
    至10%,加入酶标板孔中,每孔150ul,37℃封闭2小时。

    1.3抗原孵育:洗涤封闭过的酶标板3次,拍干,往阳性对照组加入100ul浓度为
    1ug/ml的阳性样本(SP8蛋白)提取液,往阴性对照组加入00ul浓度稀释至1ug/ml的阴性样
    本(不含SP8蛋白),37℃反应45分钟。

    1.4多抗及二抗孵育:洗涤抗原孵育过的酶标板3次,拍干,加入对应的兔多抗,每
    孔100ul,37℃反应30分钟;洗涤三次,拍干;加入二抗即碱性磷酸酶标记的抗兔多抗抗体,
    每孔100ul,37℃避光反应30分钟。

    1.5显色:洗涤3次,拍干,加入BCIP/NBT显色剂,每孔100ul,37℃避光反应15分钟。

    1.6终止反应与读数:加入终止液终止反应,在酶标仪上,检测每个实施例对应的
    阳性对照组和阴性对照组的最终读数,结果如表1所示。

    表1 抗体配对检测结果


    本试验例中,以450nm/620nm双波长读数的差值ΔA表征被检样本的浓度,该差值
    ΔA与被检样本的浓度成正比。从表1可以看出,通过抗原抗体反应显色,实施例1-4获得的
    SP8蛋白抗体均能与抗原发生特异性结合反应,实施例1-4获得的SP8蛋白抗体与抗原即SP8
    蛋白具有特异性的结合能力。

    试验例2

    抗体灵敏度检测,选取实验例1-4制备的SP8蛋白抗体,稀释高浓度的抗原得到不
    同浓度的稀释抗原,通过抗原抗体反应,检测抗体灵敏度。参考以下步骤:

    2.1包被:将实施例1-4获得的SP8蛋白抗体用CB buffer稀释至0.1ug/ml,加入酶
    标板孔中,每孔100ul,37℃包被3小时。

    2.2封闭:洗涤上述添加了抗体的酶标板3次,拍干,用CB buffer稀释羊血清至
    10%,加入酶标板孔中,每孔150ul,37℃封闭2小时。

    2.3抗原孵育:洗涤上述封闭过的酶标板3次,拍干,同一抗体的一组4个酶标孔分
    别加入100ul不同浓度的抗原,抗原浓度分别是1000ppb、100ppb、10pp和0ppb,37℃反应45
    分钟。

    2.4多抗孵育:洗涤上述加入过抗原的酶标板3次,拍干,分别加入稀释1倍(1X)、3
    倍(3X)、9倍(9X)和27倍(27X)的兔多抗,每孔100ul,37℃反应30分钟。

    2.5酶孵育:洗涤上述多抗孵育过的酶标板3次,拍干,加入酶标二抗即碱性磷酸酶
    标记的抗兔多抗抗体,每孔100ul,37℃反应30分钟。

    2.6显色:用洗涤缓冲液,洗涤上述酶标二抗孵育过的酶标板3次,拍干,加入显色
    剂,每孔100ul,37℃避光反应15分钟。

    2.7终止反应与读数:加入终止液终止反应在酶标仪上以450nm/620nm双波长读
    数。结果如表2所示。

    表2 抗体灵敏度检测结果



    从表2可看出,随着抗原浓度的不断降低,SP8蛋白抗体的检出能力也在不断地减
    低;兔多抗的浓度越低,SP8蛋白抗体的检出能力也随着减低。当兔多抗的浓度稀释27倍后,
    抗原浓度降到10ppb时候,实施例1-4的SP8蛋白抗体的检出能力略高于空白对照。所以从灵
    敏度的检测可以看出,实施例1-4的抗体的灵敏度基本上达到10ppb。

    试验例3

    本试验提供的杂交瘤细胞制备方法,该杂交瘤细胞可用于生产SP8蛋白抗体,所得
    到的SP8蛋白抗体能够特异性地与SP8蛋白结合。该制备方法包括如下步骤:

    蛋白表达步骤:将能表达SP8蛋白的Sp8基因通过酶切连接,重组到pET-30a载体
    上,得到重组载体,将重组载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,得到表达菌种;取活化
    的表达菌种,以1:50的接种量接种到500mL的液体LB培养基(卡那霉素的浓度50μg/mL)中,
    待培养基的OD值在0.4到0.6的时候,加入浓度为0.8mM的IPTG,37℃诱导表达12h,获得SP8
    蛋白。

    细胞融合步骤:将获得的SP8蛋白、弗氏佐剂和YOULONG佐剂按照2.2:1.1:1.2的体
    积比混合后,得到乳化液;用乳化液免疫Balb/c小鼠,取免疫过的Balb/c小鼠的脾脏,磨碎
    过80目筛网,得到的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG4000作用下融合,筛选得到阳性的杂
    交瘤细胞。

    本发明提供的杂交瘤细胞,其能够产生SP8蛋白抗体,其生物保藏信息:分类命名
    为抗体细胞株,于2016年11月18日在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生
    物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号:CGMCC
    No.13284。

    综上所述,以SP8蛋白作为标志物在制备男性不育检测试剂盒中的应用,该应用以
    SP8蛋白作为男性不育症检测的蛋白靶点,其具有更好的灵敏度和特异性;以SP8蛋白抗体
    在制备男性不育检测试剂盒中的应用,男性不育检测试剂盒包括能够特异性结合SP8蛋白
    的SP8蛋白抗体,因此,该试剂盒能快速准确的检测出样本的SP8蛋白的情况;另外,本发明
    得到的杂交瘤细胞能分泌SP8蛋白抗体,该杂交瘤细胞分泌的SP8蛋白抗体能够特异性结合
    SP8蛋白,其可在制备男性不育试剂盒中进行应用。

    本发明实施例的一种SP8蛋白抗体的制备方法,该方法操作简单易行,成本低廉,
    针对性较强;而且成功率较高。通过该方法制得的SP8蛋白抗体,经抗体配对检测,能够与抗
    原发生抗原抗体反应,是能够工作的;而通过抗体灵敏度实验检测,抗体的灵敏度在10ppb
    的水平依然能够发生抗原抗体反应,说明制得的抗体灵敏度较高;通过抗体的验证进一步
    验证抗体的制备方法的有效。

    以上所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。本发明的实
    施例的详细描述并非旨在限制要求?;さ谋痉⒚鞯姆段?,而是仅仅表示本发明的选定实施
    例?;诒痉⒚髦械氖凳├?,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的
    所有其他实施例,都属于本发明?;さ姆段?。




    SEQUENCE LISTING

    <110> 成都朴华科技有限公司

    <120> -一种SP8蛋白抗体的制备方法及其应用

    <160> 2

    <170> PatentIn version 3.5

    <210> 1

    <211> 224

    <212> PRT

    <213> Homo sapiens

    <400> 1

    Leu Tyr Cys Gln Lys Gly Leu Ser Met Thr Val Glu Ala Asp Pro Ala

    1 5 10 15

    Asn Met Phe Asn Trp Thr Thr Glu Glu Val Glu Thr Cys Asp Lys Gly

    20 25 30

    Ala Leu Cys Gln Glu Thr Ile Leu Ile Ile Lys Ala Gly Thr Glu Thr

    35 40 45

    Ala Ile Leu Ala Thr Lys Gly Cys Ile Pro Glu Gly Glu Glu Ala Ile

    50 55 60

    Thr Ile Val Gln His Ser Ser Pro Pro Gly Leu Ile Val Thr Ser Tyr

    65 70 75 80

    Ser Asn Tyr Cys Glu Asp Ser Phe Cys Asn Asp Lys Asp Ser Leu Ser

    85 90 95

    Gln Phe Trp Glu Phe Ser Glu Thr Thr Ala Ser Thr Val Ser Thr Thr

    100 105 110

    Leu His Cys Pro Thr Cys Val Ala Leu Gly Thr Cys Phe Ser Ala Pro

    115 120 125

    Ser Leu Pro Cys Pro Asn Gly Thr Thr Arg Cys Tyr Gln Gly Lys Leu

    130 135 140

    Glu Ile Thr Gly Gly Gly Ile Glu Ser Ser Val Glu Val Lys Gly Cys

    145 150 155 160

    Thr Ala Met Ile Gly Cys Arg Leu Met Ser Gly Ile Leu Ala Val Gly

    165 170 175

    Pro Met Phe Val Arg Glu Ala Cys Pro His Gln Leu Leu Thr Gln Pro

    180 185 190

    Arg Lys Thr Glu Asn Gly Ala Thr Cys Leu Pro Ile Pro Val Trp Gly

    195 200 205

    Leu Gln Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu Pro Ser Phe Ile His Phe Ser

    210 215 220

    <210> 2

    <211> 672

    <212> DNA

    <213> Homo sapiens

    <400> 2

    ctgtattgtc aaaagggtct gtccatgact gtggaagcag atccagccaa tatgtttaac 60

    tggaccacag aggaagtgga gacttgtgac aaaggggcac tttgccagga aaccatacta 120

    ataattaaag cagggactga gacagccatt ttggccacga agggctgcat cccggaaggg 180

    gaggaggcca taacaattgt ccagcactct tcacctcccg gcctgatcgt gacctcctac 240

    agtaactact gtgaggattc cttctgtaat gacaaagaca gcctgtctca gttttgggag 300

    ttcagtgaga ccacagcttc cactgtgtca acaaccctcc attgtccaac ctgtgtggct 360

    ttggggacct gtttcagtgc tccttctctt ccctgtccca atggtacaac tcgatgctat 420

    caaggaaaac ttgagatcac tggaggtggc attgagtcgt ctgtggaggt caaaggctgt 480

    acagccatga ttggctgcag gctgatgtct ggaatcttag cagtaggacc catgtttgtg 540

    agggaagcgt gcccacatca gctgctcact caacctcgaa agactgaaaa tggggccacc 600

    tgtcttccca ttcctgtttg ggggttacag ctactgctgc cattgctgct gccatcattt 660

    attcactttt cc 672

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    本文标题:SP8蛋白及其应用、SP8蛋白抗体的制备方法、应用及杂交瘤细胞.pdf
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