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    重庆时时彩平台登录: 一种免疫脂质聚合物杂化纳米粒生物芯片及其制备方法和在疾病检测中的应用.pdf

    关 键 词:
    一种 免疫 聚合物 纳米 生物芯片 及其 制备 方法 疾病 检测 中的 应用
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    摘要
    申请专利号:

    CN201710054144.9

    申请日:

    2017.01.22

    公开号:

    CN106771206A

    公开日:

    2017.05.31

    当前法律状态:

    公开

    有效性:

    审中

    法律详情: 公开
    IPC分类号: G01N33/574 主分类号: G01N33/574
    申请人: 胡家铭; 盛燕
    发明人: 胡家铭; 盛燕
    地址: 233000 安徽省蚌埠市新城区广场五街华夏尚都A区3栋301室
    优先权:
    专利代理机构: 代理人:
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201710054144.9

    授权公告号:

    法律状态公告日:

    2017.05.31

    法律状态类型:

    公开

    摘要

    本发明公开了一种免疫脂质??聚合物杂化纳米粒生物芯片及其制备方法和在疾病检测中的应用。该免疫脂质??聚合物杂化纳米粒以微阵列形式分布在芯片上,纳米粒以脂质和聚合物的混合物为壳材,内部包埋带荧光标记的分子探针。免疫脂质??聚合物杂化纳米粒表面负载各种配体。该生物芯片可以特异性地捕获血液中的外泌体并与之融合,在不破坏外泌体的情况下,检测到外泌体内的信使RNA和/或小分子RNA并产生荧光信号,同时对荧光信号进行放大。对于检测癌症早期含有一个或少量目标RNA的外泌体,具有较高的选择性和灵敏性。同时该生物芯片具有快速、简便、灵敏、选择性高、低成本等优点,可用于各种疾病、生物和食品安全等领域的分子检测。

    权利要求书

    1.一种免疫脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片,其特征在于,所述免疫脂质-聚合物杂
    化纳米粒生物芯片包括:
    (a)脂质-聚合物杂化纳米粒和芯片;
    (b)脂质-聚合物杂化纳米粒被锚定在芯片表面;
    (c)脂质-聚合物杂化纳米粒内含分子探针,包括传统型对称式分子信标、新型锚点引
    发式分子信标或发夹DNA循环回路;
    (d)脂质-聚合物杂化纳米粒表面具有特异结合能力的配体。
    2.如权利要求1所述的免疫脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片,其特征在于,所述芯片
    包括:
    (a)金涂层的固体基板,所述固体基板为玻璃,硅晶片,聚甲基丙烯酸甲酯或陶瓷;
    (b)装载液体样本的软体孔板,所述软体孔板为聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯醚(PPO)
    或其它工程塑料;
    (c)软体孔板为m×n孔板,m(行)×n(列)排列,m为1~16,n为1~24。每一孔的尺寸为3
    到4毫米,孔与孔的间距(中心点间距)为4.5到5毫米。
    3.如权利要求1所述的免疫脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片,其特征在于,所述脂质
    为下述组分中的一种或多种混合物:1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基丙烷(DOTMA),1,2-二
    油酰-3-三甲基-丙烷(DOTAP),1,2-二-O-十八碳烯基-3-二甲基丙烷(DODMA),1,2-二油酰-
    3-二甲基-丙烷(DODAP),1,2-二油酰-sn-甘油-磷酸乙醇胺(DOPE),1,2-二棕榈酰-sn-甘
    油-3-磷酸胆碱(DPPC),1-1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC),二硬脂酰磷脂酰乙醇
    胺-聚乙二醇-生物素(DSPE-PEG-Biotin)。
    4.如权利要求1所述的免疫脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片,其特征在于,所述聚合
    物包括聚己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸或聚乳酸-乙醇酸共聚物的至少一种,所述共聚物中乳
    酸与乙醇酸的质量比为40:60~95:5。
    5.如权利要求1所述的免疫脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片,其特征在于,所述聚合
    物的重均分子量为5000~300000道尔顿。
    6.如权利要求1所述的免疫脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片,其特征在于,所述脂质
    和聚合物的质量比为5:95~70:30。
    7.如权利要求1所述的免疫脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片,其特征在于,所述分子
    探针为带荧光标记的传统型对称式分子信标、新型锚点引发式分子信标或发夹DNA催化回
    路。
    8.如权利要求7所述的新型锚点引发式分子信标,其特征在于在5’或3’末端自身形成
    一个12个碱基对左右的发夹结构并且5’(3’)末端比3’(5’)末端多出6个未配对碱基左右的
    茎环双标记寡核苷酸探针。
    9.如权利要求7所述的发夹DNA催化回路,其特征在于包括:
    (a)两个可潜在结合成双链的发夹DNA(H1和H2);
    (b)一条荧光分子标记的寡核苷酸链(RF),一条猝灭基团标记的寡核苷酸链(RQ);
    (c)在没有目标物的情况下,RF与RQ形成双链结构,无荧光激发。
    10.如权利要求1所述的免疫脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片,其特征在于,所述免疫
    脂质-聚合物杂化纳米粒表面的配体为特异性的抗体、小肽或靶向小分子。
    11.如权利要求1所述的免疫脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片,其特征在于,所述免疫
    脂质-聚合物杂化纳米粒的平均粒径为50~50nm。
    12.制备如权利要求1-11任一所述的免疫脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片的制备方
    法,其特征在于包括以下步骤:
    (1)在固体基板表面镀上一层金涂层;
    (2)在金涂层上再覆盖一层薄薄的自组装单分子层,将软体孔板固定到自组装单分子
    层上制成芯片。所述自组装单分子层为β-巯基乙醇(βME),16-巯基十六酸,巯基-聚乙二醇-
    生物素(HS-PEG-Biotin),含巯基的磷脂或含巯基的聚乙二醇化合物,所述软体孔板为聚二
    甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯醚(PPO)或其它工程塑料;
    (3)在脂质-聚合物杂化纳米粒中插入配体分子制成免疫脂质-聚合物杂化纳米粒;
    (4)将免疫脂质-聚合物杂化纳米粒锚定在芯片表面,免疫脂质-聚合物杂化纳米粒内
    含分子探针。
    13.制备如权利要求12所述的免疫脂质-聚合物杂化纳米粒的方法,其特征在于包括以
    下步骤:
    (1)提供有机溶液O,所述有机溶液O中溶解有作为壳材的脂质和聚合物的混合物;
    (2)将分子探针的水溶液与上述步骤(1)所得的有机溶液O混合,经超声波分散、剪切分
    散和/或均质分散,形成初乳液;
    (3)将上述步骤(2)所得的初乳液与含有稳定剂和表面活性剂的水溶液混合,经超声波
    分散、剪切分散和/或均质分散,形成复乳液;
    (4)将上述步骤(3)所得的复乳液加入到含有稳定剂和表面活性剂的水分散液或等渗
    溶液中,挥去有机溶剂,从而获得表面硬化成型的纳米粒;
    (5)分离上述步骤(4)所形成的纳米粒。
    14.如权利要求1所述的免疫脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片,其包裹分子探针的脂
    质-聚合物杂化纳米粒用来捕获细胞、胞外囊泡或病毒来检测其内携带的RNA分子。其检测
    平台包括全内反射荧光电子显微镜、流式细胞仪、光学分析仪以及便携式荧光检测仪。
    15.如权利要求1所述的免疫脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片,其检测的体液样本包
    括血液、血清、血浆、尿液、唾液等。

    说明书

    一种免疫脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片及其制备方法和在疾病检测中的应用

    技术领域

    本发明涉及一种生物芯片及其制备方法,更具体涉及一种免疫脂质-聚合物杂化
    纳米粒生物芯片及其制备方法以及其在疾病检测中的应用。

    背景技术

    外泌体是细胞外泌的微小膜泡,大小在50-150nm,具有脂质双层膜结构,可以稳定
    地存在于血液中。已有研究表明癌症患者血液中的外泌体浓度比正常人高,近年来发现外
    泌体内含多种功能性分子,例如:信使RNA(mRNA)、小分子RNA(microRNA)、DNA片段、蛋白质
    和多肽等。鉴于mRNA和microRNA在调节基因表达和其突变体的功能障碍在人类疾病中的重
    要地位,它们已成为癌症检测的有效生物标志物。定量测定外泌体中的目标mRNA和
    microRNA是实现癌症非侵入性检测的有效手段,对于解决临床取样的难点,满足对患者高
    频监测的需求,减轻患者痛苦等突出问题,具有十分重要的社会和现实意义。

    目前,人血液中的mRNA和microRNA可以通过qRT-PCR、微阵列和RNA测序技术来实
    现定量测定。通过收集血液中所有细胞分泌的外泌体来定量其中的目标RNA,然而癌细胞分
    泌的外泌体只占所有外泌体的一小部分,所以其检测灵敏度不高。另外,这些方法需要繁琐
    的样品制备和检测步骤,价格昂贵。一般需要几天时间来完成整个检测过程,患者的健康状
    况可能会在等待中恶化,错过最佳的药物治疗时机。

    含有DNA和RNA的纳米粒已被广泛作为靶向纳米载体,用于体内外的基因治疗和诊
    断。如CN104840947A公开了一种AFP抗体修饰荷载DCN重组质粒的聚合物纳米粒,可实现对
    肝癌细胞的高度特异性靶向抑制。如CN101484139公开了基于抗体靶向的免疫脂质体负载
    治疗剂或诊断剂及其在全身治疗和诊断中的应用?;谀擅琢5纳镄酒?,目前报道的并
    不多。如CN103197066A公布了一种免疫脂质体生物芯片的制备方法和在生物检测中的应
    用。

    一种疾病越早被诊断,就越有可能被治愈。因此,迫切需要开发一种方便、快速、精
    确、非侵入式的检测方法,用于癌症的早期检测,对于癌症的治愈具有重要意义。免疫脂质
    体能够特异性地捕获血液中的外泌体,并与之融合成较大的纳米级复合物,但是脂质体自
    身的“洋葱”结构使其不具备荧光信号放大功能,对于检测癌症早期含有一个或少量目标
    RNA的外泌体,灵敏度不高。聚合物纳米粒具有较好的力学稳定性,具有“核-壳”结构,包封
    率较高,但不具备与细胞膜融合的特点。脂质-聚合物杂化纳米粒是近年来基于脂质体和聚
    合物纳米??⒌囊恢中滦鸵┪镌靥?,兼有脂质体和聚合物纳米粒两者的优点。目前尚未
    见关于脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片的技术报道,也未见对脂质-聚合物杂化纳米粒生
    物芯片用于癌症早期检测的技术报道。

    发明内容

    针对现有技术中存在的上述不足,本发明所要解决的技术问题之一在于提供一种
    新的免疫脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片。本发明中,免疫脂质-聚合物杂化纳米粒被锚
    定在固体基板的表面形成微阵列,其中分子探针被包裹在纳米粒中,和外泌体表面的受体
    (如抗原)相结合的配体,插入到锚定的纳米粒的表面。与传统的免疫脂质体生物芯片相比,
    本发明中的免疫脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片具有荧光信号放大功能,用于检测癌症
    早期的外泌体,具有较高的选择性和灵敏性。本发明的免疫脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯
    片还可以用于检测各种疾病早期的细胞、病毒和细胞分泌的其它囊泡。

    在本发明的第一方面,提供了一种免疫脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片,所述免
    疫脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片包括免疫脂质-聚合物杂化纳米粒和芯片,免疫脂质-
    聚合物杂化纳米粒被锚定在芯片上,免疫脂质-聚合物杂化纳米粒内含分子探针,免疫脂
    质-聚合物杂化纳米粒表面插入配体,能特异性地捕获外泌体、活细胞、病毒或细胞分泌的
    其它囊泡。

    优选的,所述芯片包括金涂层的固体基板和装载液体样本的软体孔板。所述金涂
    层的固体基板为玻璃,硅晶片,聚甲基丙烯酸甲酯、陶瓷或其它固体材料。所述装载液体样
    本的软体孔板为聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯醚(PPO)或其它工程塑料;软体孔板为m×n孔
    板,m(行)×n(列)排列,m为1~16,n为1~24。每一孔的尺寸为3到4毫米,孔与孔的间距(中
    心点间距)为4.5到5毫米。

    优选的,所述分子探针为带荧光标记的对称式分子信标、锚点引发式分子信标或
    发夹DNA催化回路。对称式分子信标是一种在5’和3’末端自身形成8个碱基左右具有发夹结
    构的颈环双标记寡核苷酸探针。锚点引发式分子信标是在传统型分子信标的基础上,5’或
    3’末端有5到8个额外未配对碱基。发夹DNA催化回路(CHDC)由以下组分组成:1)两个可潜在
    结合成双链的发夹DNA(H1和H2);2)一条荧光分子标记的寡核苷酸链(RF),一条猝灭基团标
    记的寡核苷酸链(RQ)。在没有目标物的情况下,RF与RQ形成双链结构,无荧光激发。

    所述分子探针用于检测外泌体、细胞或病毒内的生物标志物,如mRNA、microRNA
    等。

    优选的,所述免疫脂质-聚合物杂化纳米粒的脂质指由脂肪酸和醇作用生成的酯
    及其衍生物。其为两性分子,一端为亲水的含氮或磷的头,另一端为疏水(亲油)的长烃基
    链。包括下述组分中的一种或其混合物:1,2-二-O-十八碳烯基-3-三甲基丙烷(DOTMA),1,
    2-二油酰-3-三甲基-丙烷(DOTAP),1,2-二-O-十八碳烯基-3-二甲基丙烷(DODMA),1,2-二
    油酰-3-二甲基-丙烷(DODAP),1,2-二油酰-sn-甘油-磷酸乙醇胺(DOPE),1,2-二棕榈酰-
    sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC),1-1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC),二硬脂酰磷脂酰
    乙醇胺-聚乙二醇-生物素(DSPE-PEG-Biotin)。

    优选的,所述免疫脂质-聚合物杂化纳米粒的聚合物指可生物降解聚合物。包括聚
    己内酯、聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸-乙醇酸共聚物(乳酸和乙醇酸的质量比为40:60-95:5)
    的至少一种。所述聚合物的重均分子量为5000-300000道尔顿。

    优选的,所述脂质和聚合物的质量比为5:95-70:30。

    优选的,所述免疫脂质-聚合物杂化纳米粒表面的配体为特异性的抗体、小肽(肽
    链长度3~40)或靶向小分子如叶酸等。

    所述的免疫脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片的制备方法包括如下步骤:

    (1)在固体基板表面镀上一层金涂层;

    (2)在金涂层上再覆盖一层薄薄的自组装单分子层,将芯片模板固定到自组装单
    分子层上制成芯片。所述自组装单分子层为β-巯基乙醇(βME),16-巯基十六酸,巯基-聚乙
    二醇-生物素(HS-PEG-Biotin),含巯基的磷脂或含巯基的聚乙二醇化合物,所述芯片模板
    为聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯醚(PPO)或其它工程塑料;

    (3)在脂质-聚合物杂化纳米粒中插入配体分子制成免疫脂质-聚合物杂化纳米
    粒;

    (4)将免疫脂质-聚合物杂化纳米粒锚定在芯片表面,免疫脂质-聚合物杂化纳米
    粒内含分子探针。

    在本发明的第二方面,提供了一种制备本发明第一方面中所述的免疫脂质-聚合
    物杂化纳米粒的制备方法,所述方法包括以下步骤:

    (1)提供有机溶液O,所述有机溶液O中溶解有作为壳材的脂质和聚合物的混合物;

    (2)将溶液W1与步骤(1)所得的有机溶液O混合,经超声波分散、剪切分散和/或均
    质分散(如高压均质分散),形成初乳液W1/O,

    其中所述的溶液W1为分子探针的水溶液;

    (3)将步骤(2)所得的初乳液W1/O与外水相W2混合,经超声波分散、剪切分散和/或
    均质分散(如高压均质分散),形成复乳液W1/O/W2,

    其中所述的W2外水相为含有稳定剂和表面活性剂的水溶液;

    (4)将步骤(3)所得的复乳液加入到含有稳定剂和表面活性剂的水分散液或等渗
    溶液中,挥去有机溶剂,从而获得表面硬化成型的纳米粒;

    (5)分离步骤(4)所形成的纳米粒。

    优选的,所述的分子探针的质量浓度为0.01%~30%。

    优选的,所述的有机溶剂选自二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮或其组合。

    优选的,所述的W2外水相为含有聚乙烯醇或聚乙二醇1000维生素E琥珀酸酯
    (TPGS)和表面活性剂的水溶液。其中聚乙烯醇或TPGS的质量浓度为0.01~30%,表面活性
    剂的质量浓度为0.1%~10%,所用的表面活性剂选自:吐温60、吐温80、吐温85、泊洛沙姆
    188、泊洛沙姆908或其组合。

    优选的,所述的方法还包括步骤:对分离的纳米粒进行冻干。

    具体的,本发明提供了一种简单的方法来制备免疫脂质-聚合物杂化纳米粒生物
    芯片。将巯基-聚乙二醇-生物素(SH-PEG-Biotin)和β-巯基乙醇(βME)在乙醇中的混合物作
    为单分子层自组装到金涂覆的玻璃基板上。通过微接触粘贴技术将聚二甲基硅氧烷(PDMS)
    模板固定到自组装单分子层上制成芯片。

    将纳米粒锚定分子抗生物素蛋白(avidin)通过生物素-抗生物素蛋白特异性亲和
    力连接到芯片表面,将免疫脂质-聚合物杂化纳米粒锚定到芯片表面制成免疫-脂质聚合物
    杂化纳米粒生物芯片。

    为了防止非特异性的细胞结合,我们选择用末端硫醇化的聚乙二醇分子(SH-PEG)
    ?;ば酒械姆钦罅星?,免疫脂质-聚合物杂化纳米粒形成微阵列区。通过动态光散射
    (DLS)法分析,锚定的免疫脂质-聚合物杂化纳米粒的粒径与常规方法所制备的非锚定的免
    疫脂质-聚合物杂化纳米粒一致。

    将用于检测捕获的外泌体内的生物标志物的分子探针封装在脂质-聚合物杂化纳
    米粒内。通过一个简单的后插入方法或生物素-抗生物素蛋白的方法将各种配体(如抗体、
    小肽、碳水化合物等)固载到脂质-聚合物杂化纳米粒表面上。

    针对不同目标RNA的分子信标混合物或发夹DNA催化回路混合物包埋在脂质-聚合
    物杂化纳米粒中,这样的多重芯片可以将含不同目标RNA的外泌体在一个组合的设计中捕
    获和检测。

    相比于常规的生物芯片,本发明中的免疫脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片用于
    外泌体的检测具有以下优点:1)免疫脂质-聚合物杂化纳米粒具有一定的力学强度,锚定在
    芯片表面时不需要使用支撑材料以防纳米粒塌陷到芯片上;2)免疫脂质-聚合物杂化纳米
    粒内部包埋有锚点引发式分子信标或发夹DNA催化回路(CHDC),具有荧光信号放大功能,能
    够检测到癌症早期外泌体中一个或少量的目标RNA,具有较高的选择性和灵敏性。

    附图说明

    图1a是LPHN-TIRF技术的操作步骤,包括:(i)连接亲和素;(ii)连接LPHN纳米粒;
    (iii)装载外泌体样本;(iv)TIRF电子显微镜检测。

    图1b是图解说明在LPHN-外泌体的复合体中发夹DNA催化回路(H1、H2和Reporter)
    与RNA目标物杂交并产生放大的荧光信号。

    图1c是不同比例的H1和H2对发夹DNA催化回路的影响。

    图1d-f是LPHN(d)、胰腺癌细胞分泌的外泌体(e)和LPHN-外泌体的复合体(f)的示
    意图和透射电镜图片。

    图2a是人工外泌体的透射电镜照片。

    图2b是人工外泌体中GPC1DNA的荧光强度对人工外泌体浓度(底部x轴)或人工外
    泌体中GPC1DNA的量(上部x轴)的标准曲线。

    图2c是LN-MB、LN-CHDC、LN-CHDC和LPHN-CHDC的检出限的线性标度。

    图2d是LPHN-CHDC检测极低浓度的人工外泌体(0.18-,0.37-,0.75-,1.5-和3.0×
    106/mL)中GPC1DNA的典型TIRF图片。

    图2e是LPHN-CHDC检测人工外泌体中GPC1DNA表达的荧光强度对低浓度的人工外
    泌体(0.18-,0.37-,0.75-,1.5-和3.0×106/mL)(下方x-轴)或人工外泌体中低含量的
    GPC1DNA(0.03-,0.06-,0.125-,0.25-和0.5pg)(上方x-轴)。

    图2f是RT-PCR中GPC1DNA表达的标准曲线(0.125-50pg)。

    图2g是Metlab软件计算人工外泌体-SCR组(样本数=20)和人工外泌体-GPC1组
    (样本数=20)的GPC1DNA信号的荧光强度。

    图2h是人工外泌体-SCR组和人工外泌体-GPC1组的GPC1DNA信号的Ct值。

    图2i是人工外泌体-检测组的ROC曲线分析。

    图3a是LN-MB、LN-CHDC、LPHN-MB和LPHN-CHDC检测AsPC-1胰腺癌细胞和HPDE6-C7
    胰腺正常细胞中GPC1mRNA表达的活细胞图片(上方左侧是放大的单个细胞的相差图片)。

    图3b是LN-MB、LN-CHDC、LPHN-MB和LPHN-CHDC检测AsPC-1胰腺癌细胞(信号)和
    HPDE6-C7胰腺正常细胞(对照)的荧光强度比较。

    图3c是LN-CHDC、LPHN-MB和LPHN-CHDC相比于LN-MB对AsPC-1胰腺癌细胞荧光信号
    的放大能力。

    图3d是LN-MB、LN-CHDC、LPHN-MB和LPHN-CHDC的信噪比(信号代表AsPC-1胰腺癌细
    胞的荧光强度;噪音代表HPDE6-C7胰腺正常细胞的荧光强度)。

    图3e是AsPC-1胰腺癌细胞和HPDE6-C7胰腺正常细胞中KRASG12D表达的Ct值。

    图3f是LPHN-CHDC检测AsPC-1胰腺癌细胞和HPDE6-C7胰腺正常细胞中KRASG12D表
    达的活细胞图片(上方左侧是放大的单个细胞的相差图片)。

    图4a是LN-MB、LN-CHDC、LPHN-MB和LPHN-CHDC检测AsPC-1细胞分泌的外泌体(上
    排,信号)和HPDE6-C7细胞分泌的外泌体(下排,对照)中GPC1mRNA表达的代表性TIRF图片。

    图4b是LN-MB、LN-CHDC、LPHN-MB和LPHN-CHDC检测AsPC-1细胞分泌的外泌体(信
    号)和HPDE6-C7细胞分泌的外泌体(对照)的荧光强度(外泌体浓度108/mL)。

    图4c是LN-CHDC、LPHN-MB和LPHN-CHDC相比于LN-MB对AsPC-1胰腺癌细胞分泌的外
    泌体荧光信号的放大能力。

    图4d是LN-MB、LN-CHDC、LPHN-MB和LPHN-CHDC的信噪比(信号代表AsPC-1胰腺癌细
    胞分泌的外泌体的荧光强度;噪音代表HPDE6-C7胰腺正常细胞分泌的外泌体的荧光强度)。

    图4e是LPHN-CHDC检测10倍、50倍、250倍和1000倍稀释的AsPC-1胰腺癌细胞分泌
    的外泌体的TIRF图片(每一个稀释下的外泌体浓度分别为107/mL、2×106/mL、4×105/mL和
    105/mL)。

    图4f是LPHN-CHDC检测AsPC-1胰腺癌细胞分泌的外泌体中GPC1mRNA的信号对低浓
    度外泌体的标准曲线。

    图4g是LPHN-CHDC检测探索组,包括健康人群(样本数=60)、胰腺炎非癌症患者
    (样本数=15)、胰腺癌一期和二期病人(样本数=86)和胰腺癌三期和四期患者(样本数=
    32)的血清外泌体中GPC1mRNA信号的代表性TIRF图片,样本总数为193(上图);Metlab软件
    计算探索组外泌体中GPC1mRNA的荧光强度(下图)。

    图4h是探索组血清外泌体中GPC1mRNA信号的荧光强度。

    图4i是探索组的ROC曲线分析。

    图4j是LPHN-CHDC检测确认组,包括健康人群(样本数=15)、胰腺炎非癌症患者
    (样本数=8)、胰腺癌一期和二期病人(样本数=25)和胰腺癌三期和四期病人(样本数=
    23)的血清外泌体中GPC1mRNA信号的代表性TIRF图片,样本总数为71(上图);Metlab软件计
    算确认组外泌体中GPC1mRNA的荧光强度(下图)。

    图4k是确认组的ROC曲线分析。

    图5a是传统式对称型分子信标和锚点引发式分子信标的结构图。

    图5b是代表性的TIRF图,表述的是传统式对称型分子信标和锚点引发式分子信标
    稳定性上的时间比较。

    图5c是传统式对称型分子信标和锚点引发式分子信标的线性比较。

    图5d是锚点引发式分子信标的稳定性和信号补偿。

    具体实施方式

    下面结合具体实施例,进一步阐明本发明,应理解这些实施例仅用于说明本发明
    而不用于限制本发明的范围,在阅读了本发明之后,本领域技术人员对本发明的各种等价
    形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。

    实施例1

    脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片的制备及理化性能表征。

    实施例1描述了一个简单的方法制备脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片(图1a,b)。
    将金涂覆的玻璃基板浸泡于βME和SH-PEG-Biotin的乙醇溶液中,形成自组装单分子层。将
    PDMS模板通过微接触粘贴技术固定到自组装单分子层上制成芯片。发夹DNA催化回路(H1、
    H2和Reporter)包裹在脂质-聚合物杂化纳米粒中,纳米粒通过生物素-抗生物素蛋白特异
    性亲和力锚定到芯片表面。阳离子的脂质-聚合物杂化纳米粒通过静电作用捕获阴离子的
    外泌体,并与之融合形成纳米级复合物,使得纳米粒中的发夹DNA催化回路(CHDC)和外泌体
    中的目标RNA杂交,并产生放大的荧光信号。通过全内反射荧光显微镜检测芯片表面300nm
    以内的荧光信号来定量目标RNA。图1c描述了发夹DNA催化回路(CHDC)中发夹DNA:H1和H2的
    优化配比。

    脂质-聚合物杂化纳米粒具有“核-壳-环”结构,平均粒径大小为110nm(图1d)。真
    实的外泌体具有双层膜封闭的囊泡结构,平均粒径大小为80nm(图1e)。图1f展示了脂质-聚
    合物杂化纳米粒与外泌体的融合。

    实施例2

    脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片用于人工外泌体检测。

    在本实施例中,模拟天然外泌体的脂质双层膜结构,内部包裹GPC1DNA,制备了人
    工外泌体(图2a)?;谔烊煌饷谔逯泻猩倭康哪勘闞NA和其它RNA,我们制备的人工外泌
    体中含有1%GPC DNA和99%miR54-DNA。图2b-i显示了分别包裹分子信标和发夹DNA催化回
    路(CHDC)的脂质体生物芯片和脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片检测人工外泌体的灵敏度
    结果比较。结果表明,包裹发夹DNA催化回路(CHDC)的脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片的
    灵敏度要比包裹分子信标的脂质体生物芯片高出600倍,表现出较高的灵敏性。

    实施例3

    脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片用于检测胰腺癌细胞中GPC1mRNA和KRASG12D
    mRNA。

    实施例3包括了应用含分子信标或发夹DNA催化回路(CHDC)的脂质-聚合物杂化纳
    米粒生物芯片区分胰腺癌细胞(AsPC-1)和胰腺正常细胞(HPDE6-C7),并与脂质体生物芯片
    进行了比较。GPC1mRNA和KRASG12D mRNA分别是胰腺癌细胞和胰腺癌突变细胞的有效生物标
    志物。图3a-d展示包裹针对GPC1mRNA的发夹DNA催化回路(CHDC)能够有效区分胰腺癌细胞
    和胰腺正常细胞。图3e-f展示包裹针对KRASG12D mRNA的发夹DNA催化回路(CHDC)能够有效
    区分胰腺癌突变细胞和胰腺正常细胞。

    实施例4

    脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片用于胰腺癌分泌的外泌体检测。

    在本实施例中,展示了含有针对GPC1mRNA的分子信标或发夹DNA催化回路(CHDC)
    的脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片在胰腺癌早期外泌体检测中的应用,并与脂质体生物
    芯片进行了比较。图4a-f展示了含有发夹DNA催化回路(CHDC)的脂质-聚合物杂化纳米粒生
    物芯片成功地检测胰腺癌早期外泌体中少量的GPC1mRNA表达,具有较高的检测灵敏度。

    实施例5

    脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片用于胰腺癌病人血清中GPC1mRNA检测。

    本实施例展示了脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片在胰腺癌病人血清检测中的应
    用。如图4g-k所示,包裹发夹DNA催化回路(CHDC)的脂质-聚合物杂化纳米粒生物芯片通过
    检测病人血清中外泌体的GPC1mRNA表达,能够成功地区分胰腺癌早期病人、胰腺癌晚期病
    人、良性胰腺炎病人和正常人。

    实施例6

    锚点引发式分子信标与传统型分子信标的比较。

    在本实施例中,展示了包裹传统型分子信标的脂质-聚合物杂化纳米粒和包裹锚
    点引发式分子信标的脂质-聚合物杂化纳米粒分别用于检测包裹miR-21的人工外泌体。图
    5a展示了传统型分子信标和锚点引发式分子信标的结构。图5b展示了包裹锚点引发式分子
    信标的脂质-聚合物杂化纳米??稍谑椅卤4?天以上,而包裹传统型分子信标的脂质-聚
    合物杂化纳米粒只能在室温保存3个小时左右。图5c展示了包裹锚点引发式分子信标的脂
    质-聚合物杂化纳米粒的信号提高了8倍,信噪比提高了20倍。图5d展示冻干之后的包裹锚
    点引发式分子信标的脂质-聚合物杂化纳米粒的信号可维持原有信号的85-95%。

    上述仅为本发明的单个具体实施方式,但本发明的设计构思并不局限于此,凡利
    用此构思对本发明进行非实质性的改动,均应属于侵犯本发明?;さ姆段У男形?。但凡是
    未脱离本发明技术方案的内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何形式的简
    单修改、等同变化与改型,仍属于本发明技术方案的?;し段?。

    关于本文
    本文标题:一种免疫脂质聚合物杂化纳米粒生物芯片及其制备方法和在疾病检测中的应用.pdf
    链接地址://www.4mum.com.cn/p-6003135.html
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