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    一种 检测 病原微生物 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201710036540.9

    申请日:

    2017.01.18

    公开号:

    CN106771194A

    公开日:

    2017.05.31

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/569申请日:20170118|||公开
    IPC分类号: G01N33/569 主分类号: G01N33/569
    申请人: 青岛大学
    发明人: 刘爱骅; 刘培
    地址: 266071 山东省青岛市宁夏路308号
    优先权:
    专利代理机构: 沈阳科苑专利商标代理有限公司 21002 代理人: 李颖;周秀梅
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201710036540.9

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2018.07.20|||2017.06.23|||2017.05.31

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明属于纳米生物技术检测领域,具体是指一种基于噬菌体表面展示多肽配体和仿酶纳米材料检测病原微生物的方法。利用多功能生物纳米探针与待检测靶标病原微生物进行孵育,而后在显色体系下即可实现对其检测;其中,多功能生物纳米探针为利用生物淘选技术从风景噬菌体文库中筛选出与病原微生物特异性结合的噬菌体单克隆,再进一步分离纯化获得展示有特异性多肽的噬菌体相应位点的蛋白;而后展示有特异性多肽的噬菌体衣壳蛋白组装于仿酶纳米材料上。本发明探针不仅能特异性识别和结合靶标微生物,又因其仿酶活性可实现信号放大,从而实现副溶血弧菌的免疫比色定量检测。该方法操作简单、成本低廉、特异性和灵敏度均较高,为实现致病微生物的灵敏检测提供了一条有效途径。

    权利要求书

    1.一种检测病原微生物的方法,其特征在于:利用多功能生物纳米探针与待检测靶标
    病原微生物进行孵育,而后在显色体系下即可实现对其检测;其中,多功能生物纳米探针为
    利用生物淘选技术从风景噬菌体文库中筛选出与病原微生物特异性结合的噬菌体单克隆,
    再进一步纯化获得离纯化展示有特异性多肽的噬菌体衣壳蛋白;而后展示有特异性多肽的
    噬菌体衣壳蛋白组装于仿酶纳米材料上。
    2.按权利要求1所述的检测病原微生物的方法,其特征在于:所述多功能生物纳米探针
    为,利用生物淘选技术从风景噬菌体文库中筛选出与副溶血弧菌特异性结合的噬菌体单克
    隆,再进一步纯化获得展示有特异性多肽的噬菌体蛋白主要衣壳蛋白pVIII(fusion
    pVIII),再将fuisonpVIII组装在蛋白模板法合成的仿酶纳米材料表面从而构建检测副溶
    血弧菌的多功能生物纳米探针。
    3.按权利要求1所述的检测病原微生物的方法,其特征在于:所述多功能生物纳米探针
    的构建首先利用氨基甲酸叔丁酯(BOC)?;usionpVIII的具有与副溶血弧菌结合活性的N
    端,然后将其C端用1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺
    (NHS)进行活化,将fusion pVIII组装在仿酶纳米材料(表面pVIII蛋白残基)后,加入三氟
    乙酸将fusion pVIII去BOC?;?,使得其N端恢复与副溶血弧菌特异性结合的活性,即可。
    4.按权利要求3所述的检测病原微生物的方法,其特征在于:所述多功能生物纳米探针
    是通过酰胺键将fusion pVIII的C端与仿酶纳米材料表面的pVIII蛋白残基的N端相互作用
    构建得到的。
    5.按权利要求2、3或4所述的检测病原微生物的方法,其特征在于:所述多功能生物纳
    米探针的构建过程中fusion pVIII与仿酶纳米材料的摩尔比例为1000:1。
    6.按权利要求1所述的检测病原微生物的方法,其特征在于:所述显色体系为140μl乙
    酸-乙酸钠缓冲液(10mM,pH 4)、20μl 10mM H2O2和20μl 6mM四甲基联苯胺(TMB)。

    说明书

    一种检测病原微生物的方法

    技术领域

    本发明属于纳米生物技术检测领域,具体是指一种基于噬菌体表面展示多肽配体
    和仿酶纳米材料组装成多功能生物纳米探针检测病原微生物的方法。

    背景技术

    病原微生物是指可直接或间接造成人、动物损害的生物,种类繁多且对人类感染
    十分普遍,几乎威胁到每一个人。由食源性致病微生物造成的食源性疾病是目前对人类及
    社会最为常见的一种威胁。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是在公共医疗保健体
    系中全球最普遍的病原体之一,同时也是污染普通食品和水产品的最主要微生物。由这种
    病原微生物引起的食源性疾病,如食物中毒、肠胃炎、败血症、中毒性休克综合征等致命性
    疾病,是目前国内外医疗体系的至关重要的难题。

    传统检测病原微生物的方法主要依靠具体微生物学、生物化学和分子生物技术,
    如平板培养法和PCR法。这些传统方法虽然灵敏度和特异性都比较好,但是检测需要的时间
    比较长(一般需要3-7天),因而并不适用于现场的快速检测。目前研究者已开发多种具有高
    灵敏度和特异性的快速检测方法,主要可分为以免疫学为基础的方法和基于生物传感器的
    方法。这两种方法的特点和难点均是选择可特异性识别和结合靶标微生物的抗体。但是,抗
    体分子具有制备复杂、造价昂贵、稳定性差等缺点,这极大地限制了其在生物领域中的广泛
    应用。因此,开发实用性广、廉价、可再生、稳定性强、特异性好的靶向特异性配体成为必然。
    特异性多肽具有稳定性高、分子量小、特异性高、易合成等优点,成为新型靶向试剂。噬菌体
    展示技术可以将外源随机多肽展示于噬菌体衣壳蛋白的表面,构建的噬菌体展示文库通过
    高通量筛选获得靶标特异性多肽配体。

    纳米酶是具有仿酶活性的纳米材料,其本质是一种化学催化剂。纳米酶具有价廉、
    稳定性高、表面积大、催化活性强等优势。目前,纳米酶的研究已成为近几年相关领域中的
    热点方向。过渡金属氧化物纳米酶是目前研究最为广泛的一种纳米酶。因其具有独特的理
    化性能,纳米酶在催化工业、生物医药、检测、环境?;さ攘煊蚓哂泄憷挠τ们熬?。

    综上所述,急需一种可特异性结合靶标微生物的多肽配体来实现靶标微生物的特
    异性识别和结合,同时急需一种具有优良仿酶活性的纳米酶实现信号放大,将二者有效结
    合,实现病原微生物的灵敏、特异、快速检测。

    发明内容

    本发明目的在于提供一种基于噬菌体表面展示多肽配体和仿酶纳米材料制备多
    功能生物纳米探针检测病原微生物的方法。

    为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:

    一种检测病原微生物的方法,利用多功能生物纳米探针与待检测靶标病原微生物
    进行孵育,而后在显色体系下即可实现对其检测;其中,多功能生物纳米探针为采用噬菌体
    主要衣壳蛋白pVIII为模板合成仿酶纳米材料;而后利用生物淘选技术从风景噬菌体文库
    中筛选出与病原微生物特异性结合的噬菌体单克隆,再进一步分离纯化获得展示有特异性
    多肽的噬菌体主要衣壳蛋白;而后展示有特异性多肽的噬菌体衣壳蛋白组装于仿酶纳米材
    料上。从而构建一种多功能生物纳米探针。该探针不仅能特异性识别和结合靶标微生物,又
    因其仿酶活性可实现信号放大,从而实现靶标病原微生物的定量检测。

    所述多功能生物纳米探针的制备如下,采用蛋白模板法合成仿酶纳米材料二氧化
    锰;而后利用生物淘选技术从风景噬菌体文库中筛选出与副溶血弧菌特异性结合的噬菌体
    单克隆,再进一步纯化获得展示有特异性多肽的噬菌体衣壳蛋白pVIII(fusion pVIII),再
    将fusion pVIII组装在二氧化锰材料的表面从而构建检测副溶血弧菌的多功能生物纳米
    探针。该探针不仅能特异性识别和结合靶标微生物,又因其仿酶活性可实现信号放大,从而
    实现副溶血弧菌的免疫比色定量检测。其中,二氧化锰仿酶纳米材料是具有仿过氧化物酶
    活性的MnO2纳米片(MnO2 NSs)。

    所述多功能生物纳米探针的构建如下,首先利用氨基甲酸叔丁酯(BOC)?;?br />fusion pVIII的具有与副溶血弧菌结合活性的N端,然后将其C端用1-乙基-3-(3-二甲基氨
    丙基)-碳化二亚胺(EDC)/N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行活化,将fusion pVIII组装在二氧
    化锰仿酶纳米片表面pVIII蛋白残基后加入三氟乙酸将fusion pVIII去BOC?;?,使得其N
    端恢复与副溶血弧菌特异性结合的活性,即可。

    所述噬菌体表面展示多肽配体以病原微生物副溶血弧菌为靶标,利用生物淘选技
    术从风景噬菌体f8/9文库进行淘选,生物淘选技术共经过3轮严格的淘选过程,并通过特异
    性测试,成功获得能够特异性识别副溶血弧菌的噬菌体单克隆。进一步大量扩增噬菌体并
    通过饱和酚分离纯化展示有特异性多肽的噬菌体fusion pVIII。

    所述多功能生物纳米探针是通过酰胺键将fusion pVIII的C端与二氧化锰材料表
    面蛋白残基的N端相互作用构建得到的。

    所述多功能生物纳米探针的构建过程中fusion pVIII与二氧化锰材料的摩尔比
    例为1000:1。

    所述检测副溶血弧菌首先将fusion pVIII固定于96孔板中,BSA封闭1h,PBS缓冲
    液洗涤后副溶血弧菌静置孵育,然后加入上述多功能二氧化锰纳米探针孵育,孵育条件为
    37℃静置孵育1h,用PBS缓冲液洗涤后加入显色液反应;其中,fusion pVIII在96孔板中的
    固定量和固定浓度为100μl、40μg/ml。所述显色体系为140μl乙酸-乙酸钠缓冲液(10mM,pH
    4)、20μl 10mM H2O2和20μl 6mM四甲基联苯胺(TMB)。

    本发明的有益效果为:

    本发明采用生物淘选技术从噬菌体文库中淘选得到可特异性识别和结合副溶血
    弧菌的噬菌体多肽配体;并采用具有较高仿过氧化物酶活力的二氧化锰纳米材料,因其可
    催化过氧化物酶底物产生明显的显色反应而实现信号放大。本发明将噬菌体多肽配体组装
    在二氧化锰纳米材料的表面构建得到既可特异性识别和结合副溶血弧菌,又可实现信号放
    大的多功能纳米探针,实现了副溶血弧菌的灵敏特异检测,具有十分重要的现实意义。具体
    是:

    1、本发明采用生物淘选技术从噬菌体文库中淘选得到副溶血弧菌的高亲和性和
    高特异性的噬菌体九肽配体VQTVQIGSD。该多肽配体稳定性高、分子量小、特异性高、易合
    成。

    2、本发明采用BOC?;?、EDC/NHS活化将副溶血弧菌特异性结合噬菌体fusion
    pVIII组装在MnO2 NSs的表面,构建得到一种新颖多功能纳米探针。该探针不仅可以特异性
    识别靶标微生物副溶血弧菌,又可因其仿过氧化酶活性实现信号放大。

    3、本发明方法副溶血弧菌的检出限为15cfu/mL,低于迄今报道的其他方法的检出
    限。所提出的方法具有检测范围宽、选择性好、价格低廉,适用于真正的海洋样品测量的优
    势,在环境化学,生物技术,生物技术,催化工业和生物评价领域开辟了一条有前景的检测
    方法。

    附图说明

    图1为本发明实施例提供的检测副溶血弧菌示意图,包括多功能纳米探针的构筑
    过程:fusion-pVIII的BOC?;?A),EDC/NHS活化fusion-pVIII的C端、与MnO2 NSs组装、
    fusion-pVIII的N端去BOC?;?B),检测副溶血弧菌流程图(C)。

    图2为本发明实施例提供的三轮生物淘选的回复率。

    图3为本发明实施例提供的挑选的三种噬菌体单克隆特异性测试结果。

    图4为本发明实施例提供的检测副溶血弧菌工作曲线。

    图5为本发明实施例提供的检测副溶血弧菌特异性测试结果。

    具体实施方式

    下面通过实施例详述本发明涉及的检测方法,但不构成对本发明的限制。

    本发明采用生物淘选技术从风景噬菌体文库中筛选出与副溶血弧菌特异性结合
    的噬菌体单克隆,并分离纯化展示有特异性多肽的噬菌体主要衣壳蛋白pVIII(fusion
    pVIII)。通过酰胺键将fusion pVIII的C端与具有优良仿过氧化物酶的二氧化锰材料表面
    的N端相互作用从而构建一种多功能生物纳米探针。

    实施例1

    1)噬菌体表面展示多肽配体的制备

    以食源性致病菌副溶血弧菌为靶标,利用生物淘选技术从风景噬菌体f8/9文库进
    行淘选,并通过特异性测试,成功获得能够特异性识别副溶血弧菌的噬菌体单克隆。进一步
    大量扩增噬菌体并通过饱和酚分离纯化展示有特异性多肽的噬菌体fusion pVIII。

    首先,将副溶血弧菌接种到96孔板中,过夜使其干燥。取10μl的f8/9风景噬菌体文
    库(约1013个/ml)与45μl的文库封闭液混匀,室温静置1h,然后吸除孵育后不能与靶标细胞
    结合的噬菌体文库。向副溶血弧菌细胞中添加100μl的洗涤缓冲液(含有0.5%BSA、0.1%
    Tween-20)并室温孵育10min,弃去缓冲液,然后再次洗涤,如此反复洗涤6-8次,以除去细胞
    表面结合不牢固的噬菌体。吸除洗涤缓冲液,向副溶血弧菌细胞中加入洗脱缓冲液(含有
    1mg/ml BSA、0.1mg/ml酚红、0.2M甘氨酸),室温条件下静置10min,洗脱结合于副溶血弧菌
    细胞表面的噬菌体。将洗脱液转移至含有19μl中和液(含有1M Tris,pH 9.1)的1.5ml离心
    管中,振荡使其混匀,溶液的颜色由黄色迅速变为酒红色,测定所得噬菌体的滴度,标记为
    副溶血弧菌细胞第一轮淘选输出的噬菌体总量。

    然后扩增第一轮得到的噬菌体,纯化后测定滴度,用于下一轮噬菌体淘选。利用噬
    菌体回复率监控每一轮淘选过程,回复率的计算方法为:回复率=输入的噬菌体总量/输出
    的噬菌体总量×100%。三轮淘选回复率如图2所示。

    由图2可知,经过三轮生物淘选后,能够与副溶血弧菌细胞结合的噬菌体得到有效
    的富集,当第三轮噬菌体淘选结束后,输出的噬菌体不再需要扩增,从测定滴度的平板上随
    机挑取单克隆,进行PCR鉴定,根据鉴定结果将PCR扩增片段送至公司测序并对测序结果进
    行分析,结果如表1所示。根据分析结果,将对应的展示有完整外源随机九肽的大肠杆菌菌
    落进行活化、扩增并从中纯化相应的噬菌体,测定纯化后噬菌体浓度,保存于4℃冰箱中备
    用。

    最后进行特异性测试。分别向96孔板的不同小孔内接种实验组副溶血弧菌和对照
    组爱德华氏菌、大肠杆菌Trans 5α、普通变形杆菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和鳗弧
    菌,过夜干燥。次日,向每个孔中加入50μl噬菌体(107TU),室温静置孵育1h。然后利用同生
    物淘选过程相似的方法,通过洗涤、洗脱、裂解和滴度测定等步骤,得到每种细胞的细胞表
    面噬菌体和细胞内噬菌体数量,对每种细胞对应的噬菌体回复率进行计算,根据回复率的
    高低确定噬菌体对靶标细胞的结合特异性,结果如图3所示。

    由图3可知,副溶血弧菌噬菌体表面展示多肽配体序列为VQTVQIGSD,其能够高亲
    和性和高特异性结合副溶血弧菌。

    表1为本发明实施例提供的挑选的噬菌体单克隆展示的多肽序列。


    而后,将上述记载的靶标采用其它病原菌进行替换,再利用生物淘选技术从风景
    噬菌体f8/9文库进行淘选,并通过特异性测试,即可获得能够特异性识别相应靶标的噬菌
    体单克隆。进一步大量扩增噬菌体并通过饱和酚分离纯化展示有特异性多肽的噬菌体相应
    位点的蛋白。

    2)上述二氧化锰仿酶纳米片(含蛋白残基)的制备可参考文献(Han,L.,Shao,C.,
    Liang,B.,Liu,A.,2016.Genetically Engineered Phage-Templated MnO2 Nanowires:
    Synthesis and Their Application in Electrochemical Glucose Biosensor Operated
    at Neutral pH Condition.ACS Appl.Mater.Inter.8(22),13768-13776.),将文献中报道
    的M13噬菌体替换为M13噬菌体外壳蛋白,即可合成二氧化锰仿酶纳米片(MnO2NSs),具体方
    法如下:

    将1mg M13噬菌体主要衣壳蛋白(pVIII)加入10ml MnAc2水溶液(1mM)中,室温搅
    拌1h。然后用NaOH溶液调节pH值到10。继续在室温下搅拌6h。最后将反应体系通过0.22μm滤
    膜过滤以除去未反应的MnAc2和NaOH,即可得到MnO2 NSs。

    3)探针构建:

    首先利用BOC?;usion pVIII中具有与副溶血弧菌结合特性的N端,然后将其C
    端用EDC/NHS进行活化,按照fusion pVIII/MnO2 NSs=1000(摩尔比)进行组装(4℃静置过
    夜),此时fusion pVIII通过酰胺键组装在MnO2 NSs(含蛋白残基)的表面。然后通过加入三
    氟乙酸将fusion pVIII去BOC?;?,使得其N端恢复与副溶血弧菌特异性结合的活性,从而
    可得到MnO2 [email protected]功能纳米探针。如图1C所示。

    实施例2

    检测副溶血弧菌:

    利用上述获得的MnO2 NSs的仿过氧化物酶活性及fusion pVIII对副溶血弧菌的
    特异性结合的性能,构建基于特异噬菌体pVIII融合蛋白的无标记仿酶纳米探针检测副溶
    血弧菌的方法。

    检测:将100μl 40μg/ml的fusion pVIII加入96孔板中,4℃过夜静置固定。PBS缓
    冲液(10mM,pH 7.4)洗涤3次除去未被固定的fusion pVIII。用10mg/ml BSA溶液封闭1h,
    PBS缓冲液(10mM,pH 7.4)洗涤两次,添加靶标微生物副溶血弧菌,37℃静置孵育2h,然后加
    入100μl 0.5mg/ml上述获得的多功能纳米探针并在37℃下静置孵育1h,用PBS缓冲液
    (10mM,pH 7.4)洗涤三次,依次加入140μl乙酸-乙酸纳缓冲液(10mM,pH 4)、20μl 10mM H2O2
    和20μl 6mM TMB,室温反应30min。最后测定650nm处的吸光度值。

    依据本发明建立的方法可实现副溶血弧菌的灵敏特异检测,如图4所示,其检测范
    围为0-104cfu/ml,检出限为15cfu/mL,低于迄今报道的其他方法的检出限。同时经过特异
    性测试,发现该检测方法可以实现对副溶血弧菌的选择性检测,如图5所示。

    综上所述,本发明通过生物淘选技术获得副溶血弧菌的特异性噬菌体多肽配体,
    并将其组装在具有良好仿过氧化物酶活性的二氧化锰纳米材料的表面,得到一种新颖多功
    能纳米探针。利用该探针开发了检测副溶血弧菌的免疫比色方法,检出限低至15cfu/mL,低
    于迄今报道的其他方法的检出限。所提出的方法具有检测范围宽、选择性好、价格低廉,适
    用于真正的海洋样品检测的优势,在环境化学,生物技术,生物技术,催化工业和生物评价
    领域开辟了一种有前景的检测方法。

    上述记载是结合附图给出的本发明优选的具体实施方式和实施例作出的详细说
    明,但是本发明并不限于上述实施方式和实施例,也不限于纳米仿酶,任何生物酶(如辣根
    过氧化物酶等)和其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组
    合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的?;し段е?。

    SEQUENCE LISTING

    <110> 青岛大学

    <120> 一种检测病原微生物的方法

    <130>

    <160> 1

    <170> PatentIn version 3.1

    <210> 1

    <211> 9

    <212> PRT

    <213> 副溶血弧菌

    <220>

    <221> PROPEP

    <222> (1)..(9)

    <223>

    <400> 1

    Val Gln Thr Val Gln Ile Gly Ser Asp

    1 5

    关于本文
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