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    一种 布鲁氏菌 快速 测定 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201611069305.3

    申请日:

    2016.11.29

    公开号:

    CN106771141A

    公开日:

    2017.05.31

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/543申请日:20161129|||公开
    IPC分类号: G01N33/543; G01N33/68 主分类号: G01N33/543
    申请人: 百奥森(江苏)食品安全科技有限公司
    发明人: 周合; 张根义; 张进; 周朱晨; 杨敏; 胡彬; 吴念绮
    地址: 214070 江苏省无锡市滴翠路100号创意园三期A幢303
    优先权:
    专利代理机构: 代理人:
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201611069305.3

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.06.23|||2017.05.31

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种布鲁氏菌病的快速测定方法,包括如下步骤:将S2活菌疫苗在沸水域中煮沸30min??60min,之后取1μL??2μL作为PCR扩增目的基因表达片段的模板,利用引物LFGCGAACCGGCAATACCAG和LBGCCGCGTTGAGTACCGT作为前后引物对进行PCR反应,利用DNA胶回收试剂盒进行目的片段的纯化与回收,回收获得布鲁氏菌Omp19外膜蛋白基因表达片段溶解液。本发明能克服传统的检测方法存在的检测周期长、步骤繁琐、费时费力等缺点,使检测时间大大缩短,操作步骤和劳动强度也大为缩减,达到省时省力、快速灵敏的要求。

    权利要求书

    1.一种布鲁氏菌病的快速测定方法,其特征在于,包括如下步骤:1)表达片段克?。航?br />S2活菌疫苗在沸水域中煮沸30min-60min,之后取1μL-2μL作为PCR扩增目的基因表达片段
    的模板,利用引物LFGCGAACCGGCAATACCAG和LBGCCGCGTTGAGTACCGT作为前后引物对进行PCR
    反应,利用DNA胶回收试剂盒进行目的片段的纯化与回收,回收获得布鲁氏菌Omp19外膜蛋
    白基因表达片段溶解液;2)大肠杆菌原核表达载体的构建:取步骤(1)中的回收后的布鲁氏
    菌Omp19外膜蛋白基因表达片段溶解液和大肠杆菌pET-28a质粒载体溶解液分别进行内切
    酶EcoRΙ和XhoΙ双酶切处理,之后,在16℃金属浴中进行T4DNA连接酶连接10h-12h,获得连
    接产物;3)转化大肠杆菌DH5α克隆菌株:将步骤(2)中的连接产物转化大肠杆菌克隆菌株
    DH5α感受态细胞,采用“热激法”进行转化,得到固体LB培养基平板;4)阳性克隆子的筛?。?br />挑取步骤3)固体LB培养基表面的单个白色菌落,以前引物LFGCGAACCGGCAATACCAG和后引物
    LBGCCGCGTTGAGTACCGT进行阳性克隆子的筛选,PCR反应的程序为:94℃预变性5min,之后是
    35圈循环,每圈循环为94℃变性30s,59℃退火45s,72℃延伸45s,最后72℃后延伸10min,
    PCR反应产物进行质量体积比1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,并且将能够扩增出目的条带的
    阳性菌落进行菌种保存的同时,进行37℃过夜10h-12h液体摇菌处理,获得阳性菌株菌液;
    5)质粒提?。喝〔街瑁?)中的阳性菌株菌液1mL,利用质粒DNA小量提取试剂盒进行质粒提
    取,得到阳性重组质粒;6)转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株:将步骤(5)中提取到的阳性重
    组质粒,利用“热激法”转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞,得到固体LB培养基平
    板;7)阳性克隆子的筛?。捍稳?,用无菌牙签挑取步骤(6)中的固体LB培养基表面的单个白
    色菌落,以LFGCGAACCGGCAATACCAG和LBGCCGCGTTGAGTACCGT作为菌落PCR反应的一对引物,
    进行阳性表达菌株的筛选,PCR反应的程序为:94℃预变性5min,之后是35圈循环,每圈循环
    为94℃变性30s,59℃退火45s,72℃延伸45s,最后72℃后延伸10min,PCR反应产物进行质量
    体积比1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存
    的同时,利用3mL-5mL液体LB培养基进行过夜液体摇菌处理,液体摇瓶培养的条件为:37℃,
    180rpm-200rpm,培养12h-14h,获得表达菌株培养菌液;8)诱导表达与亲和纯化:将步骤(7)
    中液体摇瓶培养的表达菌株培养菌液作为诱导表达的母液,从中取0.5mL表达菌株培养菌
    液在无菌条件下转接到一瓶50mL新鲜的液体LB培养基中,卡那霉素的最终质量体积浓度为
    50μg/mL,在37℃、180rpm-200rpm条件培养3h-4h之后,在无菌条件下加入IPTG进行诱导表
    达,IPTG的最终物质的量浓度为0.1mmol/L-1.0mmol/L,诱导表达的条件为在37℃、180rpm-
    200rpm条件下诱导3h-4h;之后,5000rpm-6000rpm低速离心收集菌体,用20mL1×PBS缓冲液
    重新悬起菌体沉淀,在冰浴中进行菌体沉淀的超声波破碎40min-60min,结束后10000rpm-
    12000rpm高速离心收集上清液,取5mL上清液利用His-tag凝胶亲和纯化柱进行重组蛋白质
    的亲和纯化,收集获得纯化洗脱液;9)聚丙烯酰胺凝胶电泳:取步骤(8)的亲和纯化后的布
    鲁氏菌Omp19外膜蛋白的纯化洗脱液,对蒸馏水透析20h-24h,并且12h期间更换一次蒸馏
    水,利用PEG8000进行浓缩,取50μL浓缩液作为蛋白电泳的样品进行质量体积比为15%的聚
    丙烯酰胺凝胶电泳,同时,以常见的BSA蛋白作为对照进行试验,试验直到电泳指示剂刚刚
    全部跑出凝胶低端为止,获得蛋白质凝胶电泳胶片;10)“半干法”转膜:利用半干式印迹转
    膜仪,将布鲁氏菌Omp19外膜蛋白的15%聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白质胶片转移到醋酸纤维
    素薄膜上,转膜条件为:电压8v-10v,时间40min-50min,获得转膜后的醋酸纤维素薄膜;11)
    免疫印迹试验:将转膜后的醋酸纤维素薄膜用10mL质量体积比为1%的脱脂奶粉溶液孵育
    10-20min,再用10mL1×PBS缓冲液洗膜40min-60min,然后用家畜或者人的血清100μL-200μ
    L孵育醋酸纤维素薄膜10h-12h,次日,利用10mL1×PBS缓冲液洗膜40min-60min之后,用加
    有1μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗的10mL质量体积比为1%的脱脂奶粉溶液孵育
    2h-3h,然后,用10mL1×PBS缓冲液洗膜20-30min,最后在不见光的环境中利用由3%的4-氯-
    1-萘酚发色液1mL、30%双氧水10μL、1×PBS缓冲液9mL组成的混合液进行发色,发色时间为
    5min-10min,直到出现清晰可见的灰褐色条带。
    2.根据权利要求1所述的布鲁氏菌病的快速测定方法,其特征在于,将布鲁氏菌Omp19
    外膜蛋白的质量体积比为10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳胶片转到醋酸纤维素薄膜的孔径为
    0.2μm。

    说明书

    一种布鲁氏菌病的快速测定方法

    技术领域

    本发明涉及一种测定方法,具体是一种布鲁氏菌病的快速测定方法。

    背景技术

    布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的,是目前世界上流行最广、危害最大的人畜共患
    病之一,引起流产、不孕以及各种组织的局部病灶。布鲁氏菌可通过鼻、咽、口腔感染,主要
    是通过粘膜上皮组织浸入。目前,布鲁氏菌属已有10余个种的布鲁氏菌存在,不同种的布鲁
    氏菌具有明显的宿主危害倾向性,但大多具有不同宿主间的交叉感染能力,可引起严重的
    公共卫生问题。随着我国近年来,畜牧业的快速发展,布鲁氏菌病成为了限制我国畜牧业发
    展的严重病害之一。布鲁氏菌包括羊群布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌等种源。布
    鲁氏菌检测技术主要有虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)、乳环试验(MRT)、补
    体结合试验(CFT)、ELISA和PCR等方法。常规方法分离鉴定病原所需条件苛刻,且费力、费
    时、危险性高、成功率低。PBT和SAT特异性不高、敏感性低;CFT操作繁琐,实验条件和技术水
    平要求高,实践应用极为不便。PCR检测方法较前几种快速也准确许多,但需要复杂的仪器
    设备,成本高,不适合基层和现场检测。LAMP方法具有灵敏性高、特异性好、反应时间短、判
    定结果方便、不需要昂贵仪器等优势,目前多数建立的LAMP反应方法多采用琼脂糖凝胶电
    泳紫外线分析显像来判定结果,只能分析LAMP反应的最终结果,且存在气溶胶污染实验室
    的危险,由于缺乏对反应的实时监控很难排除这些干扰因素,不能对检测结果做出准确的
    判定。本发明使用的LAMP方法不仅敏感度高,特异性强,不造成环境污染,快速得出结果,并
    且可实时定量检测,而且操作简便,只需按建立的体系加样即可,为简便、快捷准确地检测
    布鲁氏菌带来便利。

    发明内容

    本发明的目的在于提供一种布鲁氏菌病的快速测定方法,以解决上述背景技术中
    提出的问题。

    为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:

    一种布鲁氏菌病的快速测定方法,包括如下步骤:1)表达片段克?。航玈2活菌疫苗在沸
    水域中煮沸30min-60min,之后取1μL-2μL作为PCR扩增目的基因表达片段的模板,利用引物
    LFGCGAACCGGCAATACCAG和LBGCCGCGTTGAGTACCGT作为前后引物对进行PCR反应,利用DNA胶
    回收试剂盒进行目的片段的纯化与回收,回收获得布鲁氏菌Omp19外膜蛋白基因表达片段
    溶解液;2)大肠杆菌原核表达载体的构建:取步骤(1)中的回收后的布鲁氏菌Omp19外膜蛋
    白基因表达片段溶解液和大肠杆菌pET-28a质粒载体溶解液分别进行内切酶EcoRΙ和XhoΙ
    双酶切处理,之后,在16℃金属浴中进行T4DNA连接酶连接10h-12h,获得连接产物;3)转化
    大肠杆菌DH5α克隆菌株:将步骤(2)中的连接产物转化大肠杆菌克隆菌株DH5α感受态细胞,
    采用“热激法”进行转化,得到固体LB培养基平板;4)阳性克隆子的筛?。禾羧〔街?)固体LB
    培养基表面的单个白色菌落,以前引物LFGCGAACCGGCAATACCAG和后引物
    LBGCCGCGTTGAGTACCGT进行阳性克隆子的筛选,PCR反应的程序为:94℃预变性5min,之后是
    35圈循环,每圈循环为94℃变性30s,59℃退火45s,72℃延伸45s,最后72℃后延伸10min,
    PCR反应产物进行质量体积比1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,并且将能够扩增出目的条带的
    阳性菌落进行菌种保存的同时,进行37℃过夜10h-12h液体摇菌处理,获得阳性菌株菌液;
    5)质粒提?。喝〔街瑁?)中的阳性菌株菌液1mL,利用质粒DNA小量提取试剂盒进行质粒提
    取,得到阳性重组质粒;6)转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株:将步骤(5)中提取到的阳性重
    组质粒,利用“热激法”转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞,得到固体LB培养基平
    板;7)阳性克隆子的筛?。捍稳?,用无菌牙签挑取步骤(6)中的固体LB培养基表面的单个白
    色菌落,以LFGCGAACCGGCAATACCAG和LBGCCGCGTTGAGTACCGT作为菌落PCR反应的一对引物,
    进行阳性表达菌株的筛选,PCR反应的程序为:94℃预变性5min,之后是35圈循环,每圈循环
    为94℃变性30s,59℃退火45s,72℃延伸45s,最后72℃后延伸10min,PCR反应产物进行质量
    体积比1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存
    的同时,利用3mL-5mL液体LB培养基进行过夜液体摇菌处理,液体摇瓶培养的条件为:37℃,
    180rpm-200rpm,培养12h-14h,获得表达菌株培养菌液;8)诱导表达与亲和纯化:将步骤(7)
    中液体摇瓶培养的表达菌株培养菌液作为诱导表达的母液,从中取0.5mL表达菌株培养菌
    液在无菌条件下转接到一瓶50mL新鲜的液体LB培养基中,卡那霉素的最终质量体积浓度为
    50μg/mL,在37℃、180rpm-200rpm条件培养3h-4h之后,在无菌条件下加入IPTG进行诱导表
    达,IPTG的最终物质的量浓度为0.1mmol/L-1.0mmol/L,诱导表达的条件为在37℃、180rpm-
    200rpm条件下诱导3h-4h。之后,5000rpm-6000rpm低速离心收集菌体,用20mL1×PBS缓冲液
    重新悬起菌体沉淀,在冰浴中进行菌体沉淀的超声波破碎40min-60min,结束后10000rpm-
    12000rpm高速离心收集上清液,取5mL上清液利用His-tag凝胶亲和纯化柱进行重组蛋白质
    的亲和纯化,收集获得纯化洗脱液;9)聚丙烯酰胺凝胶电泳:取步骤(8)的亲和纯化后的布
    鲁氏菌Omp19外膜蛋白的纯化洗脱液,对蒸馏水透析20h-24h,并且12h期间更换一次蒸馏
    水,利用PEG8000进行浓缩,取50μL浓缩液作为蛋白电泳的样品进行质量体积比为15%的聚
    丙烯酰胺凝胶电泳,同时,以常见的BSA蛋白作为对照进行试验,试验直到电泳指示剂刚刚
    全部跑出凝胶低端为止,获得蛋白质凝胶电泳胶片;10)“半干法”转膜:利用半干式印迹转
    膜仪,将布鲁氏菌Omp19外膜蛋白的15%聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白质胶片转移到醋酸纤维
    素薄膜上,转膜条件为:电压8v-10v,时间40min-50min,获得转膜后的醋酸纤维素薄膜;11)
    免疫印迹试验:将转膜后的醋酸纤维素薄膜用10mL质量体积比为1%的脱脂奶粉溶液孵育
    10-20min,再用10mL1×PBS缓冲液洗膜40min-60min,然后用家畜或者人的血清100μL-200μ
    L孵育醋酸纤维素薄膜10h-12h,次日,利用10mL1×PBS缓冲液洗膜40min-60min之后,用加
    有1μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗的10mL质量体积比为1%的脱脂奶粉溶液孵育
    2h-3h,然后,用10mL1×PBS缓冲液洗膜20-30min,最后在不见光的环境中利用由3%的4-氯-
    1-萘酚发色液1mL、30%双氧水10μL、1×PBS缓冲液9mL组成的混合液进行发色,发色时间为
    5min-10min,直到出现清晰可见的灰褐色条带。

    作为本发明再进一步的方案:将布鲁氏菌Omp19外膜蛋白的质量体积比为10%的聚
    丙烯酰胺凝胶电泳胶片转到醋酸纤维素薄膜的孔径为0.2μm。

    与现有技术相比,本发明的有益效果是:本发明能克服传统的检测方法存在的检
    测周期长、步骤繁琐、费时费力等缺点,使检测时间大大缩短,操作步骤和劳动强度也大为
    缩减,达到省时省力、快速灵敏的要求。

    具体实施方式

    下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

    本发明实施例中,一种布鲁氏菌病的快速测定方法,包括如下步骤:1)表达片段克
    ?。航玈2活菌疫苗在沸水域中煮沸30min-60min,之后取1μL-2μL作为PCR扩增目的基因表达
    片段的模板,利用引物LFGCGAACCGGCAATACCAG和LBGCCGCGTTGAGTACCGT作为前后引物对进
    行PCR反应,利用DNA胶回收试剂盒进行目的片段的纯化与回收,回收获得布鲁氏菌Omp19外
    膜蛋白基因表达片段溶解液;2)大肠杆菌原核表达载体的构建:取步骤(1)中的回收后的布
    鲁氏菌Omp19外膜蛋白基因表达片段溶解液和大肠杆菌pET-28a质粒载体溶解液分别进行
    内切酶EcoRΙ和XhoΙ双酶切处理,之后,在16℃金属浴中进行T4DNA连接酶连接10h-12h,获
    得连接产物;3)转化大肠杆菌DH5α克隆菌株:将步骤(2)中的连接产物转化大肠杆菌克隆菌
    株DH5α感受态细胞,采用“热激法”进行转化,得到固体LB培养基平板;4)阳性克隆子的筛
    ?。禾羧〔街?)固体LB培养基表面的单个白色菌落,以前引物LFGCGAACCGGCAATACCAG和后
    引物LBGCCGCGTTGAGTACCGT进行阳性克隆子的筛选,PCR反应的程序为:94℃预变性5min,之
    后是35圈循环,每圈循环为94℃变性30s,59℃退火45s,72℃延伸45s,最后72℃后延伸
    10min,PCR反应产物进行质量体积比1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,并且将能够扩增出目的
    条带的阳性菌落进行菌种保存的同时,进行37℃过夜10h-12h液体摇菌处理,获得阳性菌株
    菌液;5)质粒提?。喝〔街瑁?)中的阳性菌株菌液1mL,利用质粒DNA小量提取试剂盒进行质
    粒提取,得到阳性重组质粒;6)转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株:将步骤(5)中提取到的阳
    性重组质粒,利用“热激法”转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞,得到固体LB培养
    基平板;7)阳性克隆子的筛?。捍稳?,用无菌牙签挑取步骤(6)中的固体LB培养基表面的单
    个白色菌落,以LFGCGAACCGGCAATACCAG和LBGCCGCGTTGAGTACCGT作为菌落PCR反应的一对引
    物,进行阳性表达菌株的筛选,PCR反应的程序为:94℃预变性5min,之后是35圈循环,每圈
    循环为94℃变性30s,59℃退火45s,72℃延伸45s,最后72℃后延伸10min,PCR反应产物进行
    质量体积比1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种
    保存的同时,利用3mL-5mL液体LB培养基进行过夜液体摇菌处理,液体摇瓶培养的条件为:
    37℃,180rpm-200rpm,培养12h-14h,获得表达菌株培养菌液;8)诱导表达与亲和纯化:将步
    骤(7)中液体摇瓶培养的表达菌株培养菌液作为诱导表达的母液,从中取0.5mL表达菌株培
    养菌液在无菌条件下转接到一瓶50mL新鲜的液体LB培养基中,卡那霉素的最终质量体积浓
    度为50μg/mL,在37℃、180rpm-200rpm条件培养3h-4h之后,在无菌条件下加入IPTG进行诱
    导表达,IPTG的最终物质的量浓度为0.1mmol/L-1.0mmol/L,诱导表达的条件为在37℃、
    180rpm-200rpm条件下诱导3h-4h。之后,5000rpm-6000rpm低速离心收集菌体,用20mL1×
    PBS缓冲液重新悬起菌体沉淀,在冰浴中进行菌体沉淀的超声波破碎40min-60min,结束后
    10000rpm-12000rpm高速离心收集上清液,取5mL上清液利用His-tag凝胶亲和纯化柱进行
    重组蛋白质的亲和纯化,收集获得纯化洗脱液;9)聚丙烯酰胺凝胶电泳:取步骤(8)的亲和
    纯化后的布鲁氏菌Omp19外膜蛋白的纯化洗脱液,对蒸馏水透析20h-24h,并且12h期间更换
    一次蒸馏水,利用PEG8000进行浓缩,取50μL浓缩液作为蛋白电泳的样品进行质量体积比为
    15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳,同时,以常见的BSA蛋白作为对照进行试验,试验直到电泳指示
    剂刚刚全部跑出凝胶低端为止,获得蛋白质凝胶电泳胶片;10)“半干法”转膜:利用半干式
    印迹转膜仪,将布鲁氏菌Omp19外膜蛋白的15%聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白质胶片转移到醋
    酸纤维素薄膜上,转膜条件为:电压8v-10v,时间40min-50min,获得转膜后的醋酸纤维素薄
    膜;11)免疫印迹试验:将转膜后的醋酸纤维素薄膜用10mL质量体积比为1%的脱脂奶粉溶液
    孵育10-20min,再用10mL1×PBS缓冲液洗膜40min-60min,然后用家畜或者人的血清100μL-
    200μL孵育醋酸纤维素薄膜10h-12h,次日,利用10mL1×PBS缓冲液洗膜40min-60min之后,
    用加有1μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗的10mL质量体积比为1%的脱脂奶粉溶液孵
    育2h-3h,然后,用10mL1×PBS缓冲液洗膜20-30min,最后在不见光的环境中利用由3%的4-
    氯-1-萘酚发色液1mL、30%双氧水10μL、1×PBS缓冲液9mL组成的混合液进行发色,发色时间
    为5min-10min,直到出现清晰可见的灰褐色条带。将布鲁氏菌Omp19外膜蛋白的质量体积比
    为10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳胶片转到醋酸纤维素薄膜的孔径为0.2μm。

    实施例1:

    本发明布鲁氏菌病的快速测定方法,包括如下步骤:1)表达片段克?。航玈2活菌疫苗在
    沸水域中煮沸30min,之后取1μL-2μL作为PCR扩增目的基因表达片段的模板,利用引物
    LFGCGAACCGGCAATACCAG和LBGCCGCGTTGAGTACCGT作为前后引物对进行PCR反应,利用DNA胶
    回收试剂盒进行目的片段的纯化与回收,回收获得布鲁氏菌Omp19外膜蛋白基因表达片段
    溶解液;2)大肠杆菌原核表达载体的构建:取步骤(1)中的回收后的布鲁氏菌Omp19外膜蛋
    白基因表达片段溶解液和大肠杆菌pET-28a质粒载体溶解液分别进行内切酶EcoRΙ和XhoΙ
    双酶切处理,之后,在16℃金属浴中进行T4DNA连接酶连接12h,获得连接产物;3)转化大肠
    杆菌DH5α克隆菌株:将步骤(2)中的连接产物转化大肠杆菌克隆菌株DH5α感受态细胞,采用
    “热激法”进行转化,得到固体LB培养基平板;4)阳性克隆子的筛?。禾羧〔街?)固体LB培养
    基表面的单个白色菌落,以前引物LFGCGAACCGGCAATACCAG和后引物LBGCCGCGTTGAGTACCGT
    进行阳性克隆子的筛选,PCR反应的程序为:94℃预变性5min,之后是35圈循环,每圈循环为
    94℃变性30s,59℃退火45s,72℃延伸45s,最后72℃后延伸10min,PCR反应产物进行质量体
    积比1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测,并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的
    同时,进行37℃过夜10h-12h液体摇菌处理,获得阳性菌株菌液;5)质粒提?。喝〔街瑁?)中
    的阳性菌株菌液1mL,利用质粒DNA小量提取试剂盒进行质粒提取,得到阳性重组质粒;6)转
    化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株:将步骤(5)中提取到的阳性重组质粒,利用“热激法”转化
    大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)感受态细胞,得到固体LB培养基平板;7)阳性克隆子的筛?。?br />次日,用无菌牙签挑取步骤(6)中的固体LB培养基表面的单个白色菌落,以
    LFGCGAACCGGCAATACCAG和LBGCCGCGTTGAGTACCGT作为菌落PCR反应的一对引物,进行阳性表
    达菌株的筛选,PCR反应的程序为:94℃预变性5min,之后是35圈循环,每圈循环为94℃变性
    30s,59℃退火45s,72℃延伸45s,最后72℃后延伸10min,PCR反应产物进行质量体积比1.0%
    的琼脂糖凝胶电泳检测,并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时,利
    用3mL-5mL液体LB培养基进行过夜液体摇菌处理,液体摇瓶培养的条件为:37℃,180rpm,培
    养12h,获得表达菌株培养菌液;8)诱导表达与亲和纯化:将步骤(7)中液体摇瓶培养的表达
    菌株培养菌液作为诱导表达的母液,从中取0.5mL表达菌株培养菌液在无菌条件下转接到
    一瓶50mL新鲜的液体LB培养基中,卡那霉素的最终质量体积浓度为50μg/mL,在37℃、
    180rpm条件培养3h-4h之后,在无菌条件下加入IPTG进行诱导表达,IPTG的最终物质的量浓
    度为0.1mmol/L-1.0mmol/L,诱导表达的条件为在37℃、180rpm条件下诱导3h-4h。之后,
    5000rpm低速离心收集菌体,用20mL1×PBS缓冲液重新悬起菌体沉淀,在冰浴中进行菌体沉
    淀的超声波破碎40min,结束后10000rpm高速离心收集上清液,取5mL上清液利用His-tag凝
    胶亲和纯化柱进行重组蛋白质的亲和纯化,收集获得纯化洗脱液;9)聚丙烯酰胺凝胶电泳:
    取步骤(8)的亲和纯化后的布鲁氏菌Omp19外膜蛋白的纯化洗脱液,对蒸馏水透析20h,并且
    12h期间更换一次蒸馏水,利用PEG8000进行浓缩,取50μL浓缩液作为蛋白电泳的样品进行
    质量体积比为15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳,同时,以常见的BSA蛋白作为对照进行试验,试验
    直到电泳指示剂刚刚全部跑出凝胶低端为止,获得蛋白质凝胶电泳胶片;10)“半干法”转
    膜:利用半干式印迹转膜仪,将布鲁氏菌Omp19外膜蛋白的15%聚丙烯酰胺凝胶电泳的蛋白
    质胶片转移到醋酸纤维素薄膜上,转膜条件为:电压8v,时间40min,获得转膜后的醋酸纤维
    素薄膜;11)免疫印迹试验:将转膜后的醋酸纤维素薄膜用10mL质量体积比为1%的脱脂奶粉
    溶液孵育10min,再用10mL1×PBS缓冲液洗膜40min,然后用家畜或者人的血清100μL孵育醋
    酸纤维素薄膜10h-12h,次日,利用10mL1×PBS缓冲液洗膜40min之后,用加有1μL辣根过氧
    化物酶标记的山羊抗兔二抗的10mL质量体积比为1%的脱脂奶粉溶液孵育2h-3h,然后,用
    10mL1×PBS缓冲液洗膜20-30min,最后在不见光的环境中利用由3%的4-氯-1-萘酚发色液
    1mL、30%双氧水10μL、1×PBS缓冲液9mL组成的混合液进行发色,发色时间为5min-10min,直
    到出现清晰可见的灰褐色条带。将布鲁氏菌Omp19外膜蛋白的质量体积比为10%的聚丙烯酰
    胺凝胶电泳胶片转到醋酸纤维素薄膜的孔径为0.2μm。

    对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在
    不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论
    从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权
    利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有
    变化囊括在本发明内。此外,应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个
    实施方式仅包含一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域
    技术人员应当将说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经适当组合,形成本
    领域技术人员可以理解的其他实施方式。

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