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    网上的重庆时时彩正规吗: 肽段同位素稀释质谱法定量重组肌钙蛋白I含量的方法.pdf

    关 键 词:
    同位素 稀释 法定 重组 肌钙蛋白 含量 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201611144062.5

    申请日:

    2016.12.13

    公开号:

    CN106770821A

    公开日:

    2017.05.31

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 30/06申请日:20161213|||公开
    IPC分类号: G01N30/06; G01N30/88 主分类号: G01N30/06
    申请人: 南通大学附属医院
    发明人: 王建新; 沈培; 王旭东; 鞠少卿; 王惠民; 季伙燕; 沈蕾
    地址: 226000 江苏省南通市崇川区西寺路20号
    优先权:
    专利代理机构: 代理人:
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201611144062.5

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.08.18|||2017.05.31

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    肽段同位素稀释质谱法定量重组肌钙蛋白I含量的方法,它涉及一种准确定量重组肌钙蛋白I含量的方法;包括以下步骤:特征肽段设计;特征肽段质谱分析离子对的确定;LC??MRM条件研究;样本分析前处理:主要步骤有:重组蛋白变性、还原烷基化、酶解、纯化样品、浓缩样品;数据分析:cTnI特异性肽段浓度,cTnI蛋白肽出峰时间4.20min;回收率及精密度:回收率及精密度符合规定要求,对重组cTnI特异性肽段液相质谱条件进行研究和改进,所建方法准确度好,速度快,出峰时间为4.20min。

    权利要求书

    1.肽段同位素稀释质谱法定量重组肌钙蛋白I含量的方法,其特征在于,包括以下步
    骤:
    (1)特征肽段设计:在Pubmed蛋白质数据库搜索人源Troponin I氨基酸序列,
    Accession:NP_000354.4,然后在线分析质谱肽段,网址:http://web.expasy.org/
    peptide_mass/,结合实验室质谱仪器特点选择目的肽段,然后将目肽段在pubmed蛋白质数
    据库进行blast同源检索,确定为特异肽段;
    (2)特征肽段质谱分析离子对的确定:用skyline软件分析研究特异肽段的母离子和子
    离子,调节碰撞能量选择信号强的三对离子进行研究,信号最强的为定量离子对,其他为定
    性离子对;
    (3)LC-MRM条件研究:超高压液相色谱参数液相色谱仪:岛津效液相色谱输液泵和自动
    进样器;色谱柱:CSH130C18;柱温40℃,流动相A:0.1%甲酸水溶液,流动相B:0.1%甲酸乙
    腈溶液,流速0.3mL/min,流动相B2min5%,8min50%,9min90%,14min5%;质谱分离条件,
    仪器AB5500,离子喷射电压5500V;温度550℃;气帘气体为25L/min,碰撞气体8L/min;正离
    子方式检测;扫描方式为多反应监测;
    (4)样本分析前处理:主要步骤有:重组蛋白变性、还原烷基化、酶解、纯化样品、浓缩样
    品;
    (5)数据分析:用软件Analyst1.2.1分析标准肽/同位素内标肽峰面积并制作标准曲
    线,;根据标准曲线计算cTnI肽段浓度;重组蛋白cTnI浓度ng/mL为cTnI特异性肽段浓度乘
    以19.28;19.28由cTnI分子量24016Da除以cTnI特征肽分子量1245.41Da;
    (6)回收率及精密度:配制cTnI含量为62.1ng/mL、621ng/mL水溶液,按样本分析前处理
    和测定,测量值与理论值之比为方法回收率;同时,低、高两个浓度蛋白样品分别于1d内连
    续测定5次,连续测5天,计算批内和批间精密度。
    2.根据权利要求1所述的肽段同位素稀释质谱法定量重组肌钙蛋白I含量的方法,其特
    征在于,所述的步骤(1)的具体操作方法为:根据人源cTnI蛋白质氨基酸序列,用Peptide
    mass软件设计同位素稀释质谱法测cTnI特异性肽段NITEIADLTQK,经BLAST检索该肽段为特
    异性肽段,理论分子量为1245.7Da;合成肽分子量为1245.41Da,在溶液中主要为二价电荷,
    分子量为623.3Da;在特异性肽段L氨基酸位点标记同位素13C615N,标记同位素分子量为7Da,
    同位素标记肽段分子量为1252.6Da,在溶液中主要为二价电荷,分子量为626.8Da;仪器
    AB5500三重四级杆质谱仪鉴定特异性肽段离子对为623.3/1018.6、623.3/675.1、623.3/
    788.6;同位素标记肽段离子对为626.8/1025.6、626.8/682.2、626.8/795.5,其中623.3/
    1018.6与626.8/1025.6为绝对定量离子对。
    3.根据权利要求1所述的肽段同位素稀释质谱法定量重组肌钙蛋白I含量的方法,其特
    征在于,所述的步骤(4)中,样本分析前处理的具体步骤为:
    I)变性,25μL蛋白液样品加入1ng/mL同位素标记肽7.5μL,再加217.5μL25mmol/L碳酸
    氢铵混匀,加尿素96mg使其终浓度为6M,混匀,静置5min;
    II)还原烷基化,加250μL25mmol/L碳酸氢铵,加100mM二硫苏糖醇50μL,60℃水浴
    30min;烷基化,加550mM碘乙酰胺50μL;室温避光20min;加200mM DTT50μL,室温20min;加
    25mmol/L碳酸氢铵1000μL,使尿素浓度小于1M;
    III)酶解,加入胰酶,胰酶与样品质量比为1∶10,37℃水浴4h,加0.1%三氟乙酸30μL终
    止反应;
    IV)纯化样品,加3.0mL甲醇活化OASIS MAX固相萃取柱3cc/60μm,待甲醇流尽后加
    3.0mL去离子平衡柱子,加酶解产物于柱中,先后用2.0mL10%氨水、2.0mL甲醇洗涤,最后用
    2.0mL2%甲酸甲醇洗脱;
    V)浓缩样品,在氮吹仪上浓缩洗脱液,气体流量5mL/min,温度45℃,待有机溶剂挥发
    后,用0.1mL0.1%FA溶解,上机进行液相质谱检测,进样量5μL。
    4.根据权利要求1所述的肽段同位素稀释质谱法定量重组肌钙蛋白I含量的方法,其特
    征在于,所述的步骤(5)中,数据分析的具体方法为:
    cTnI特异性肽段浓度,cTnI蛋白肽出峰时间4.20min,用软件Analyst1.2.1分析标准
    肽/同位素内标肽峰面积并制作标准曲线,权重线性回归方程(″1/x″weighting):y=
    0.208x-0.072(r=0.9988),根据标准曲线计算cTnI肽段浓度;cTnI肽标准曲线制备:标准
    肽用氨基酸同位素稀释质谱法溯源SI单位,将其用质谱级水配制不同浓度1ng/mL、2.5ng/
    mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL,分别加入1ng/mL同位素标记肽7.5μL混匀,检测前
    处理过程与步骤(1)-步骤(4)相同。
    5.根据权利要求1所述的肽段同位素稀释质谱法定量重组肌钙蛋白I含量的方法,其特
    征在于,所述的步骤(6)中,含量为62.1ng/mL水溶液相当肽浓度3.22ng/mL、621ng/mL水溶
    液相当肽浓度32.2ng/mL;低、高cTnI蛋白回收率分别为94.65%和103.15%;cTnI低、高样
    品批间精密度分别为7.04%、5.69%,批内精密度分别为6.15%、4.76%;回收率及精密度
    符合规定要求。

    说明书

    肽段同位素稀释质谱法定量重组肌钙蛋白I含量的方法

    技术领域

    本发明涉及一种准确定量重组肌钙蛋白I含量的方法,具体涉及一种肽段同位素
    稀释质谱法定量重组肌钙蛋白I含量的方法。

    背景技术

    肌钙蛋白(cTnI)是检测心肌损伤最敏感的生物学指标之一。然而,cTnI检测仍存
    在一些问题,主要是检测方法尚未标准化,不同方法间存在一定的差异,检测结果常常不具
    有跨时空的可比性。

    同位素液相色谱-串联质谱法(Liquid chromatography-tandem mass
    spectrometry,LC/MS/MS)的优点是高灵敏度、高精确性、高度特异性,其测量结果标准化可
    直接溯源至国际基本单位制。国内学者[1]建立氨基酸同位素稀释质谱法定量重组cTnI,该
    法需高温水解氨基酸,存在安全隐患。

    国内有关肽段同位素稀释质谱法定量蛋白含量的研究报道较少,主要与蛋白样品
    成分复杂、其离子化程度容易受到其他杂质离子的影响,实验条件较为复杂。

    参考文献:

    [1]孙雪晴.重要生物标志物-甲胎蛋白、瘦素及肌钙蛋白I的绝对定量方法[D].北
    京化工大学,2014。

    [2]Kuhn E,Addona T,Keshishian H,et al.Developing multiplexed assays
    for troponin I and interleukin-33in plasma by peptide immunoaffinity
    enrichment and targeted mass spectrometry.Clin Chem[J].2009,55(6):1108-17。

    [3]Keshishian H,Addona T,Burgess M,et al..Quantification of
    cardiovascular biomarkers in patient plasma by targeted mass spectrometry and
    stable isotope dilution.Mol Cell Proteomics[J].2009,8(10):2339-49。

    [4]Huillet C,Adrait A,Lebert D,et al.Accurate quantification of
    cardiovascular biomarkers in serum using Protein Standard Absolute
    Quantification(PSAQTM)and selected reaction monitoring[J].Molecular&Cellular
    Proteomics Mcp,2012,11(2):8681-8696。

    [5]Zhao C,Trudeau B,Xie H,et al.Epitope mapping and targeted
    quantitation of the cardiac biomarker troponin by SID-MRM mass
    spectrometry.Proteomics[J].2014,14(11):1311-21。

    发明内容

    本发明的目的是提供一种对重组cTnI特异性肽段液相质谱条件进行研究和改进,
    所建方法准确度好,速度快,出峰时间为4.20min的肽段同位素稀释质谱法定量重组肌钙蛋
    白I含量的方法。

    为了解决背景技术所存在的问题,本发明是采用以下技术方案:一种肽段同位素
    稀释质谱法定量重组肌钙蛋白I含量的方法,包括以下步骤:

    (1)特征肽段设计:在Pubmed蛋白质数据库搜索人源Troponin I氨基酸序列,
    Accession:NP_000354.4,然后在线分析质谱肽段,网址:http://web.expasy.org/
    peptide_mass/,结合实验室质谱仪器特点选择目的肽段,然后将目肽段在pubmed蛋白质数
    据库进行blast同源检索,确定为特异肽段。

    (2)特征肽段质谱分析离子对的确定:用skyline软件分析研究特异肽段的母离子
    和子离子,调节碰撞能量选择信号强的三对离子进行研究,信号最强的为定量离子对,其他
    为定性离子对。

    (3)LC-MRM条件研究:超高压液相色谱(UPLC LC-30A)参数液相色谱仪:岛津效液
    相色谱输液泵和自动进样器;色谱柱:CSH 130C18;柱温40℃,流动相A:0.1%甲酸水溶液,
    流动相B:0.1%甲酸乙腈溶液,流速0.3mL/min,流动相B 2min 5%,8min 50%,9min 90%,
    14min 5%。质谱分离条件,仪器AB 5500,离子喷射电压5500V;温度550℃;气帘气体(CUR)
    为25L/min,碰撞气体(CAD)8L/min;正离子方式检测;扫描方式为多反应监测(MRM)。

    (4)样本分析前处理:主要步骤有:重组蛋白变性、还原烷基化、酶解、纯化样品、浓
    缩样品。

    (5)数据分析:用软件Analystl.2.1分析标准肽(离子对623.3/1018.6)/同位素内
    标肽(离子对626.8/1025.6)峰面积并制作标准曲线。根据标准曲线计算cTnI肽段浓度。重
    组蛋白cTnI浓度(ng/mL)为cTnI特异性肽段浓度乘以19.28;19.28由cTnI分子量(24016Da)
    除以cTnI特征肽分子量(1245.41Da)。

    (6)回收率及精密度:配制cTnI含量为62.1ng/mL、621ng/mL水溶液,按样本分析前
    处理和测定,测量值与理论值之比为方法回收率。同时,低、高两个浓度蛋白样品分别于1d
    内连续测定5次,连续测5天,计算批内和批间精密度。

    作为本发明的进一步改进;所述的步骤(1)的具体操作方法为:根据人源cTnI蛋白
    质氨基酸序列,用Peptide mass软件设计同位素稀释质谱法测cTnI特异性肽段
    NITEIADLTQK,经BLAST检索该肽段为特异性肽段,理论分子量为1245.7Da;合成肽分子量为
    1245.41Da,在溶液中主要为二价电荷,分子量为623.3Da;在特异性肽段L氨基酸位点标记
    同位素(13C615N),标记同位素分子量为7Da,同位素标记肽段分子量为1252.6Da,在溶液中主
    要为二价电荷,分子量为626.8Da;仪器AB 5500三重四级杆质谱仪鉴定特异性肽段离子对
    为623.3/1018.6、623.3/675.1、623.3/788.6;同位素标记肽段离子对为626.8/1025.6、
    626.8/682.1、626.8/795.5,其中623.3/1018.6与626.8/1025.6为绝对定量离子对。

    作为本发明的进一步改进;所述的步骤(4)中,样本分析前处理的具体步骤为:

    I)变性,25μL蛋白液样品加入1ng/mL同位素标记肽7.5μL,再加217.5μL 25mmol/L
    碳酸氢铵混匀,加尿素96mg使其终浓度为6M,混匀,静置5min;

    II)还原烷基化,加250μL 25mmol/L碳酸氢铵,加100mM二硫苏糖醇(DTT)50μL,60
    ℃水浴30min。烷基化,加550mM碘乙酰胺(IAA)50μL。室温避光20min。加200mM DTT 50μL,室
    温20min。加25mmol/L碳酸氢铵1000μL,使尿素浓度小于1M;

    III)酶解,加入胰酶,胰酶与样品质量比为1∶10,37℃水浴4h,加0.1%三氟乙酸
    (TFA)30μL终止反应;

    IV)纯化样品,加3.0mL甲醇活化OASIS MAX固相萃取柱(3cc/60μm),待甲醇流尽后
    加3.0mL去离子平衡柱子,加酶解产物于柱中,先后用2.0mL10%氨水、2.0mL甲醇洗涤,最后
    用2.0mL 2%甲酸甲醇洗脱;

    V)浓缩样品,在氮吹仪上浓缩洗脱液,气体流量5mL/min,温度45℃,待有机溶剂挥
    发后,用0.1mL 0.1%FA溶解。上机进行液相质谱检测,进样量5μL。

    作为本发明的进一步改进;所述的步骤(5)中,数据分析的具体方法为:

    cTnI特异性肽段浓度,cTnI蛋白肽出峰时间4.20min,用软件Analyst1.2.1分析标
    准肽(离子对623.3/1018.6)/同位素内标肽(离子对626.8/1025.6)峰面积并制作标准曲
    线,权重线性回归方程(″1/x″weighting):y=0.208x-0.072(r=0.9988),根据标准曲线计
    算cTnI肽段浓度;cTnI肽标准曲线制备:标准肽用氨基酸同位素稀释质谱法溯源SI单位,将
    其用质谱级水配制不同浓度1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL,分别
    加入1ng/mL同位素标记肽7.5μL混匀,检测前处理过程与步骤(1)一步骤(4)相同。

    作为本发明的进一步改进;所述的步骤(6)中,含量为62.1ng/mL水溶液相当肽浓
    度3.22ng/mL、621ng/mL水溶液相当肽浓度32.2ng/mL;低、高cTnI蛋白回收率分别为
    94.65%和103.15%。cTnI低、高样品批间精密度(CV)分别为7.04%、5.69%,批内精密度
    (CV)分别为6.15%、4.76%?;厥章始熬芏确瞎娑ㄒ?。

    采用上述技术方案后,本发明具有以下有益效果:

    根据Pubmed数据库筛选出cTnI特异性肽段,建立肽段同位素稀释质谱法定量重组
    cTnI的方法。本方法在标准品、同位素内标等方面明显不同与氨基酸同位素稀释质谱法定
    量重组肌钙蛋白I。本法检测结果同样可溯源至SI。为研究血清cTnI标准物质的研究奠定基
    础。

    附图说明

    图1为本发明所提供的实施例的生物信息学分析特异性肽段的选择图;

    在http://web.expasy.org/peptide_mass/数据库进行cTnI胰酶酶切位点分析,
    图1为cTnI胰酶酶切位点单价和二价预测结果,结合质谱仪器特点,方框为最终选择结果;

    图2为本发明所提供的实施例的特异性肽段离子质谱二级扫描图;

    图3为本发明所提供的实施例的同位素标记的肽段离子质谱二级扫描图;

    图4为本发明所提供的实施例的cTnI LC-MS/MS图。

    具体实施方式

    为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合具体实施方式,对
    本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施方式仅用以解释本发明,并
    不用于限定本发明。

    本具体实施方式采用以下技术方案:一种肽段同位素稀释质谱法定量重组肌钙蛋
    白I含量的方法,包括以下步骤:

    (1)肽段设计:

    根据人源cTnI蛋白质氨基酸序列,用Peptide mass软件设计同位素稀释质谱法测
    cTnI特异性肽段NITEIADLTQK,见图1,经BLAST检索该肽段为特异性肽段,理论分子量为
    1245.7Da。合成肽分子量为1245.41Da,在溶液中主要为二价电荷,分子量为623.3Da。我们
    在特异性肽段L氨基酸位点标记同位素(13C615N),标记同位素分子量为7Da,同位素标记肽段
    分子量为1252.6Da,在溶液中主要为二价电荷,分子量为626.8Da。本具体实施方式标记肽
    段与国外报道不同,具体见表1:

    表1cTnI特异肽和同位素标记肽比较



    仪器AB 5500三重四级杆质谱仪鉴定特异性肽段离子对为623.3/1018.6、623.3/
    675.1、623.3/788.6。同位素标记肽段离子对为626.8/1025.6、626.8/682.1、626.8/795.5。
    结果见图2、图3,其中623.3/1018.6与626.8/1025.6为绝对定量离子对。

    (2)液相分离条件:

    超高压液相色谱(UPLC LC-30A)参数液相色谱仪:岛津效液相色谱输液泵和自动
    进样器(日本公司);色谱柱:Water公司CSH 130C18(150mm×2.1,3.5μm,美国Waters公司);
    柱温40℃,流动相A:0.1%甲酸水溶液,流动相B:0.1%甲酸乙腈溶液,流速0.3mL/min,流动
    相B:2min 5%,8min 50%,9min 90%,14min 5%。

    (3)质谱分离条件:

    仪器AB 5500,离子喷射电压5500V;温度550℃;气帘气体(CUR)为25L/min,碰撞气
    体(CAD)8L/min;正离子方式检测;扫描方式为多反应监测(MRM)。具体参数见表2:

    表2质谱优化条件



    (4)样本分析前处理:

    主要步骤有:重组蛋白变性、还原烷基化、酶解、纯化样品、浓缩样品。

    a)变性,25μL蛋白液样品加入1ng/mL同位素标记肽7.5μL,再加217.5μL 25mmol/L
    碳酸氢铵混匀,加尿素96mg使其终浓度为6M,混匀,静置5min。

    b)还原烷基化,加250μL 25mmol/L碳酸氢铵,加100mM二硫苏糖醇(DTT)50μL,60℃
    水浴30min。烷基化,加550mM碘乙酰胺(IAA)50μL。室温避光20min。加200mM DTT 50μL,室温
    20min。加25mmol/L碳酸氢铵1000μL,使尿素浓度小于1M。

    c)酶解,加入胰酶,胰酶与样品质量比为1∶10,37℃水浴4h,加0.1%三氟乙酸
    (TFA)30μL终止反应。

    d)纯化样品,加3.0mL甲醇活化OASIS MAX固相萃取柱(3cc/60μm),待甲醇流尽后
    加3.0mL去离子平衡柱子,加酶解产物于柱中,先后用2.0mL10%氨水、2.0mL甲醇洗涤,最后
    用2.0mL 2%甲酸甲醇洗脱。

    e)浓缩样品,在氮吹仪上浓缩洗脱液,气体流量5mL/min,温度45℃,待有机溶剂挥
    发后,用0.1mL 0.1%FA溶解。上机进行液相质谱检测,进样量5μL。

    (5)cTnI肽标准曲线制备:标准肽用氨基酸同位素稀释质谱法溯源SI单位。将其用
    质谱级水配制不同浓度1ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL,分别加入
    1ng/mL同位素标记肽7.5μL混匀。检测前处理过程与步骤1-4相同。

    (6)数据分析:

    a)cTnI特异性肽段浓度,cTnI蛋白肽出峰时间4.20min,见图4。用软件
    Analystl.2.1分析标准肽(离子对623.3/1018.6)/同位素内标肽(离子对626.8/1025.6)峰
    面积并制作标准曲线。权重线性回归方程(″1/x″weighting):y=0.208x-0.072(r=
    0.9988)。根据标准曲线计算cTnI肽段浓度。

    b)重组蛋白cTnI浓度(ng/mL)等于cTnI特异性肽段浓度乘以19.28。注:19.28由
    cTnI分子量(24016Da)除以cTnI特征肽分子量(1245.41Da)。

    (7)回收率及精密度

    配制cTnI含量为62.1ng/mL(相当肽浓度3.22ng/mL)、621ng/mL(相当肽浓度
    32.2ng/mL)水溶液,按样本分析前处理和测定,测量值与理论值之比为方法回收率。同时,
    低、高两个浓度蛋白样品分别于1d内连续测定5次,连续测5d,计算批内和批间精密度。低、
    高cTnI蛋白回收率分别为94.65%和103.15%。cTnI低、高样品批间精密度(CV)分别为
    7.04%、5.69%,批内精密度(CV)分别为6.15%、4.76%?;厥章始熬芏确瞎娑ㄒ?。

    本具体实施方式与现有技术的不同点在于:

    1、选择的肽段具有代表性,是cTnI特异性肽。应用生物信息学技术最终确定目的
    肽段NITEIADLTQK。与国外学者报道一致[2-4]。使用UPLC-MS法检测多肽时,多肽的响应信
    号增加或抑制与仪器和反应的化学试剂的有关。Kuhn E等[2]和Keshishian H[3]合成了同
    位素特异肽NITEIAD[(13C6),L]TQK,比标准肽多6Da。Huillet C[4]合成了同位素特异肽
    NITEIADLTQ[(13C615N2)K],比标准肽多8Da。结合氨基酸特点合成了同位素特异肽NITEIAD
    [(13C615N)L]TQK,比标准肽NITEIADLTQK多7Da(见表1)。该同位素特异肽的理化性质与目标
    多肽完全一致,所表现出来的色谱质谱行为也一致,能校正由基质效应所带来的检测响应
    值波动。

    2.LC-MS/MS结果,检测系统为AB Triple quad 5500LC/MS/MS,该系统分辨率好,
    灵敏高,质谱优化条件见表2。Kuhn E用AB 4000Q TRAP LC/MS/MS检测系统,检测条件与本
    具体实施方式中基本一致,Huillet C用API5500Q-Trap检测系统,文献没有提供质谱优化
    条件。Kuhn E报道离子对623.3/1018.5信号最强,20min出峰。Huillet C报道离子对623.3/
    675.4信号最强,623.3/1018.5次之,出峰时间36.2min,本具体实施方式的离子对623.3/
    1018.6信号最强,出峰时间4.20min。Zhao C等[5]建立cTnI另一种特异性肽段溶液标准曲
    线,标准曲线下限4ng/mL,本具体实施方式建立的肽溶液标准曲线下限为1ng/mL。

    对于本领域技术人员而言,显然本发明不限于上述示范性实施例的细节,而且在
    不背离本发明的精神或基本特征的情况下,能够以其他的具体形式实现本发明。因此,无论
    从哪一点来看,均应将实施例看作是示范性的,而且是非限制性的,本发明的范围由所附权
    利要求而不是上述说明限定,因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有
    变化囊括在本发明内。

    此外,应当理解,虽然本说明书按照实施方式加以描述,但并非每个实施方式仅包
    含一个独立的技术方案,说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见,本领域技术人员应当
    将说明书作为一个整体,各实施例中的技术方案也可以经适当组合,形成本领域技术人员
    可以理解的其他实施方式。

    关于本文
    本文标题:肽段同位素稀释质谱法定量重组肌钙蛋白I含量的方法.pdf
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