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    重庆时时彩后2稳赚: 一种血必净中间体多指标成分的含量测定方法.pdf

    关 键 词:
    一种 血必净 中间体 指标 成分 含量 测定 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201611192215.3

    申请日:

    2016.12.21

    公开号:

    CN106770764A

    公开日:

    2017.05.31

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 著录事项变更 IPC(主分类):G01N 30/02变更事项:发明人变更前:胡小锋 童艳 刘方 石秀英 姜艳春变更后:胡小锋 童艳 刘方 时秀英 姜艳春|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 30/02申请日:20161221|||公开
    IPC分类号: G01N30/02 主分类号: G01N30/02
    申请人: 天津红日药业股份有限公司
    发明人: 胡小锋; 童艳; 刘方; 石秀英; 姜艳春
    地址: 301700 天津市武清区天津新技术产业园区武清开发区泉发路西
    优先权:
    专利代理机构: 北京华科联合专利事务所(普通合伙) 11130 代理人: 王为;孟旭
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201611192215.3

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2019.02.12|||2017.06.23|||2017.05.31

    法律状态类型:

    著录事项变更|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及一种血必净中间体多指标成分的含量测定方法。精密度良好、重现性良好、稳定性良好,可以用来检测血必净注射液中间体中羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸的含量,有助于提高产品质量,进而提升人民群众是生活质量。

    权利要求书

    1.一种血必净中间体有效成分的含量测定方法,其特征在于,步骤如下:
    步骤一:以芍药苷为内参物的相对校正因子的测定
    a、标准溶液的制备:
    分别精密称取羟基红花黄色素A对照品、芍药苷对照品、阿魏酸对照品、苯甲酸对照品
    适量,置容量瓶中,以50%甲醇水溶液为溶剂,溶解并定容至刻度,制得含羟基红花黄色素
    A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸一定浓度的对照品混标浓溶液;将混标浓溶液进行七步梯度稀
    释,使得各步稀释后的标准溶液中各成分浓度分别在供试品限度浓度的40%、60%、80%、
    100%、120%、140%、160%;
    b、各组分校正因子计算:
    采用两台不同高效液相色谱仪,取步骤a中制得的7个不同浓度的标准溶液按步骤权利
    要求1给定色谱条件进样,记录色谱图,分别以各成分相对应的浓度为横坐标,相应峰面积
    为纵坐标,按最小二乘法进行线性回归,绘制标准曲线,将羟基红花黄色素A、阿魏酸、苯甲
    酸标准曲线的斜率分别除以芍药苷标准曲线的斜率,即为各成分相对芍药苷的校正因子;
    步骤二:按校正因子法测定供试品中羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸含量:
    a、对照品工作溶液制备:精密称取芍药苷对照品适量,置容量瓶中,以50%甲醇水溶液
    为溶剂,制得含芍药苷浓度为CR的对照品工作溶液;
    b、供试品溶液制备:精密移取供试品,置容量瓶中,加50%甲醇水溶液稀释至刻度摇
    匀,作为供试品溶液;
    c、测定方法:分别精密量取对照品混标工作溶液、供试品溶液,分别注入液相色谱仪,
    按步骤(1)给定色谱条件进样,记录色谱图,根据步骤一中确定的校正因子,按下述公式计
    算羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸含量,
    <mrow> <mi>X</mi> <mo>=</mo> <mfrac> <msub> <mi>C</mi> <mi>R</mi> </msub> <msub> <mi>A</mi> <mi>R</mi> </msub> </mfrac> <mo>&times;</mo> <msub> <mi>A</mi> <mi>X</mi> </msub> <mo>&times;</mo> <mfrac> <mn>1</mn> <mi>F</mi> </mfrac> <mo>&times;</mo> <mn>20</mn> </mrow>
    式中:X——供试品中各成分的含量,mg/ml
    CR——对照品工作溶液中芍药苷浓度,mg/ml
    AR——对照品工作溶液中芍药苷峰面积
    AX——供试品溶液中各成分峰面积
    F——各成分相对芍药苷的校正因子
    其中,液相色谱条件如下:
    色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱,
    流动相:甲醇:醋酸水溶液,000ml水中加入36%冰醋酸水溶液5ml,体积比10:90-30:
    70,
    流速:0.8-1.2ml/min,
    柱温:30℃,
    检测波长:230nm,
    进样量:20μl,
    运行时间:60min;
    所述血必净中间体多指标成分为羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸。
    2.如权利要求1所述的含量测定方法,其特征在于,液相色谱条件如下:
    色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱,
    流动相:甲醇:醋酸水溶液,1000ml水中加入36%冰醋酸水溶液5ml,体积比:20:80
    流速:1.0ml/min,
    柱温:30℃,
    检测波长:230nm,
    进样量:20μl,
    运行时间:60min。
    3.如权利要求2所述的含量测定方法,其特征在于,液相色谱条件如下:
    色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱,
    流动相:甲醇:醋酸水溶液,1000ml水中加入36%冰醋酸水溶液5ml,10:90
    流速:0.8ml/min,
    柱温:30℃,
    检测波长:230nm,
    进样量:20μl,
    运行时间:60min。
    4.如权利要求2所述的含量测定方法,其特征在于,液相色谱条件如下:
    色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱,
    流动相:甲醇:醋酸水溶液,1000ml水中加入36%冰醋酸水溶液5ml,体积比:30:70,
    流速:1.2ml/min,
    柱温:30℃,
    检测波长:230nm,
    进样量:20μl,
    运行时间:60min。

    说明书

    一种血必净中间体多指标成分的含量测定方法

    技术领域

    本发明属于医药技术领域,具体涉及一种血必净中间体中羟基红花黄色素A、芍药
    苷、阿魏酸、苯甲酸含量的检测分析方法。

    背景技术

    血必净注射液为棕黄色至棕红色的澄明液体,主要成分为红花、川芎、丹参和当归
    等,功能主治为化瘀解毒,用于温热类疾病见发热、喘促、心悸、烦燥等瘀毒互结症。随着临
    床研究的不断深入,其应用范围也在不断拓宽,可用于肾脏、肺部、心血管、脓毒血症、弥漫
    性血管内凝血(DIC)、多器官功能障碍综合征(MDOS)、重症急性胰腺炎、糖尿病酮症酸中毒
    (DKA)等疾病。

    血必净注射液包含红花、赤芍、川芎、当归、丹参五味中药材成分,由各药材饮片经
    适当的工艺加工,制成红花提取物、川丹当提取物、赤芍提取物,提取物经混合工序,制得血
    必净中间体,再配以其他辅料,经多步生产工序,最终制成血必净注射液。

    血必净中间体作为制剂生产的中间环节,其质量监控一直是制剂生产的关键环
    节,而其中功效成分的监控既能表征工艺的稳定性,更是中间体质量优劣的直接反映。

    血必净中间体包含三种功效成分——羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸,目前三
    种成分分别采用三种不同的液相色谱条件进行定性定量检测,功效成分含量测定无法同步
    进行,试剂、耗材费用消耗大、人工占用时间长、检测周期长。

    本发明所建立的分析方法采用同一个液相色谱条件,通过相对校正因子的测定,
    以“一测多评”方法同时测定血必净中间体中所含羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲
    酸含量,经与原方法结果比对,准确度与精密度相当,但克服了原方法检测周期长、试剂耗
    材费用高等弊端,节约了试剂、耗材、人工成本,缩短了检测周期,能更为有效地控制产品质
    量。

    发明内容

    本发明的目的在于克服现有技术中的不足,提供一种快速、准确地测定血必净中
    间体多指标成分含量,且更加节省试剂耗材费用,节约人工成本的检测方法。

    本发明所述的血必净中间体功效成分含量检测方法,包括以下步骤:

    (1)以芍药苷为内参物的相对校正因子的测定

    a、标准溶液的制备:

    分别精密称取羟基红花黄色素A对照品、芍药苷对照品、阿魏酸对照品、苯甲酸对
    照品适量,置V1体积容量瓶中,以50%甲醇水溶液为溶剂,溶解并定容至刻度,制得含羟基
    红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸一定浓度的对照品混标浓溶液;将混标浓溶液进行七
    步梯度稀释,使得各步稀释后的标准溶液中各成分浓度分别在供试品限度浓度的40%、
    60%、80%、100%、120%、140%、160%。

    b、各组分校正因子计算:

    采用两台不同高效液相色谱仪,取步骤a中制得的7个不同浓度的标准溶液按步骤
    (1)给定色谱条件进样,记录色谱图。分别以各成分相对应的浓度为横坐标,相应峰面积为
    纵坐标,按最小二乘法进行线性回归,绘制标准曲线。将羟基红花黄色素A、阿魏酸、苯甲酸
    标准曲线的斜率分别除以芍药苷标准曲线的斜率,即为各成分相对芍药苷的校正因子。

    (2)按校正因子法(一测多评法)测定供试品中羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、
    苯甲酸含量:

    a、对照品工作溶液制备:精密称取芍药苷对照品适量,置V2体积容量瓶中,以50%
    甲醇水溶液为溶剂,制得含芍药苷CR的对照品工作溶液。

    b、供试品溶液制备:精密移取体积V3为供试品,置体积为V4的容量瓶中,加50%甲
    醇水溶液稀释至刻度,取体积为V5的此溶液,置体积为V6的容量瓶中,加50%甲醇水溶液稀
    释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。

    c、测定方法:分别精密量取体积为V7对照品混标工作溶液、供试品溶液,分别注入
    液相色谱仪,按步骤(1)给定色谱条件进样,记录色谱图。根据步骤(2)中确定的校正因子,
    按下述公式计算羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸含量。


    式中:X——供试品中各成分的含量,mg/ml

    CR——对照品工作溶液中芍药苷浓度,mg/ml

    AR——对照品工作溶液中芍药苷峰面积

    AX——供试品溶液中各成分峰面积

    F——各成分相对芍药苷的校正因子

    (3)液相色谱条件:照高效液液色谱法测定,

    色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱,

    流动相:以甲醇:醋酸水溶液(1000ml水中加入36%冰醋酸水溶液5ml)体积比:
    (10:90-30:70),

    流速:0.8-1.2ml/min,

    柱温:30℃,

    检测波长:230nm,

    进样量:20μl,

    运行时间:60min。

    本发明采用一个色谱条件,只需配制一个成分的对照品溶液,根据已确定的校正
    因子,即可测定出供试品中其他三种成分的准确含量,节省了其他对照品的使用以及液相
    检测过程中有机试剂的消耗,缩短了样品的检验周期,既提高了工作效率又节约了成本。

    本发明检测方法是经过筛选获得的,筛选过程如下:

    实验一:方法精密度实验

    精密称取芍药苷对照品适量,以50%甲醇水溶液为溶剂,制得含芍药苷0.4mg/ml
    的对照品工作溶液。精密移取供试品1ml,置10ml量瓶中,加50%甲醇水溶液稀释至刻度,取
    此溶液5ml,置10ml量瓶中,加50%甲醇水溶液稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液。按上述
    方法平行制备6份供试品溶液。精密量取对照品混标工作溶液、供试品溶液各20μl,分别注
    入液相色谱仪,按已确定的色谱条件进样,记录色谱图。根据已确定的各成分相对芍药苷的
    相对校正因子,按校正因子法计算羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸含量。6份供试
    品溶液羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸含量测定结果的相对标准偏差应小于
    5.0%。试验结果见下表:

    表1对照品溶液响应因子测试结果



    表2羟基红花黄色素A含量测定重复性试验结果(试验人员A)



    表3芍药苷含量测定重复性试验结果





    表4阿魏酸含量测定重复性试验结果



    表5苯甲酸含量测定重复性试验结果





    结论:由上表可知,6份供试品溶液羟基红花黄色素A测定结果的相对标准偏差为
    2.3%,芍药苷测定结果的相对标准偏差为1.8%、阿魏酸测定结果的相对标准偏差为
    1.0%,苯甲酸含量测定结果的相对标准标准偏差为2.0%,小于规定的5.0%,重复性符合
    验证要求。

    实验二:方法准确度实验

    回收率样品溶液1的制备:取已知羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸浓度
    的血必净中间体0.5ml,置10ml量瓶中,分别加入1.6mg/ml羟基红花黄色素A对照品溶液、
    8.0mg/ml芍药苷对照品溶液、0.16mg/ml阿魏酸对照品溶液、0.16mg/ml苯甲酸对照品溶液
    各0.5ml,加50%甲醇水溶液溶解并稀释至刻度,取此溶液5ml,置10ml量瓶中,加50%甲醇
    水溶液稀释至刻度,作为回收率样品溶液1,按上述方法平行制备3份。

    回收率样品溶液2的制备:取已知羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸浓度
    的血必净中间体0.5ml,置10ml量瓶中,分别加入2.0mg/ml羟基红花黄色素A对照品溶液、
    1.2mg/ml芍药苷对照品溶液、0.2mg/ml阿魏酸对照品溶液、0.2mg/ml苯甲酸对照品溶液各
    0.5ml,加50%甲醇水溶液溶解并稀释至刻度,取此溶液5ml,置10ml量瓶中,加50%甲醇水
    溶液稀释至刻度,作为回收率样品溶液2,按上述方法平行制备3份。

    回收率样品溶液3的制备:取已知羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸浓度
    的血必净中间体0.5ml,置10ml量瓶中,分别加入2.5mg/ml羟基红花黄色素A对照品溶液、
    1.3mg/ml芍药苷对照品溶液、0.25mg/ml阿魏酸对照品溶液、0.25mg/ml苯甲酸对照品溶液
    各0.5ml,加50%甲醇水溶液溶解并稀释至刻度,取此溶液5ml,置10ml量瓶中,加50%甲醇
    水溶液稀释至刻度,作为回收率样品溶液3,按上述方法平行制备3份。

    将这9份回收率样品溶液按精密度实验测定方法进行测定,计算测定结果的回收
    率和相对标准偏差。要求回收率应在90.0%-110.0%之间,结果的相对标准偏差应小于
    5.0%。计算公式如下:

    公式一:

    公式二:

    式中:CR——对照品溶液的浓度,μg/ml

    AR——对照品溶液中主成分峰面积

    AX——供试品溶液中各成分的峰面积

    F——各成分相对芍药苷的校正因子(羟基红花黄色素A1.28,阿魏酸2.46,苯甲酸
    4.03)

    CX——回收率样品溶液中各成分浓度,μg/ml

    C1——配制回收率样品溶液所用的相应对照品溶液浓度,μg/ml

    C2——血必净中间体中各成分的浓度,μg/ml

    试验结果见下表:

    表6对照品溶液响应因子试验结果



    表7羟基红花黄色素A含量测定准确度试验结果





    表8芍药苷含量测定准确度试验结果



    表9阿魏酸含量测定准确度试验结果





    表10苯甲酸含量测定准确度试验结果



    结论:由上表可知,9份样品的回收率均在90.0%-110.0%之间,羟基红花黄色素A
    测定结果的RSD为2.0%,芍药苷测定结果的RSD为3.0%,阿魏酸测定结果的RSD为3.5%,苯
    甲酸测定结果的RSD为2.7%,各成分结果的相对标准偏差均小于规定的5.0%,准确度测定
    结果符合验证要求。

    实验三:待测溶液稳定性实验

    按本发明已确定的含量测定方法制备对照品溶液及供试品溶液,将供试品溶液在
    室温下放置0天、2天、4天后取样,按给定色谱条件进样,以芍药苷为基准物按相对校正因子
    法计算各成分含量,各时间点羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸含量测定结果的相
    对标准偏差应小于5.0%。试验结果见下表:

    表11羟基红花黄色素A含量测定溶液稳定性试验结果



    表12芍药苷含量测定溶液稳定性试验结果



    表13阿魏酸含量测定溶液稳定性试验结果



    表14苯甲酸含量测定溶液稳定性试验结果



    结论:由上表可知,供试品溶液在室温下放置0天、2天、4天后,各成分含量测定结
    果的相对平均偏差分别为:羟基红花黄色素A为2.6%,芍药苷为1.6%,阿魏酸为2.6%,苯
    甲酸为3.0%,小于规定的5.0%,符合验证要求。

    附图说明

    附图1:对照品混合溶液典型图谱

    附图2:实施例1供试品溶液检测结果典型图谱,出峰顺序:羟基红花黄色素A、芍药
    苷、阿魏酸、苯甲酸

    附图3:实施例2供试品溶液检测结果典型图谱,出峰顺序:羟基红花黄色素A、芍药
    苷、阿魏酸、苯甲酸

    附图4:实施例3供试品溶液检测结果典型图谱,出峰顺序:羟基红花黄色素A、芍药
    苷、阿魏酸、苯甲酸

    具体实施方式

    下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明:

    实施例1

    本发明所述的血必净中间体功效成分含量检测方法,包括以下步骤:

    (1)液相色谱条件:

    照高效液液色谱法测定:

    色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶;

    流动相:甲醇:醋酸水溶液(1000ml水中加入36%冰醋酸水溶液5ml)(20:80);

    流速:1.0ml/min;

    柱温:30℃;

    检测波长:230nm;

    进样量:20μl;

    运行时间:60min,

    (2)以芍药苷为内参物的相对校正因子的测定:

    a、标准曲线溶液的制备:

    羟基红花黄色素A标准曲线溶液制备:取羟基红花黄色素A对照品约20mg、精密称
    定,置10ml量瓶中,加50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度,制得每毫升含羟基红花黄色素A
    约2.0mg的对照品贮备溶液;分别精密移取贮备溶液0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、
    0.7ml、0.8ml,分置10ml量瓶中,加50%甲醇水溶液稀释至刻度,制得分别含40μg/ml、60μg/
    ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml、140μg/ml、160μg/ml羟基红花黄色素A的标准曲线溶液;

    芍药苷标准曲线溶液制备:取芍药苷对照品约200mg、精密称定,置100ml量瓶中,
    加50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度,制得每毫升含芍药苷约2.0mg的对照品贮备溶液;分
    别精密移取贮备溶液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml,分置10ml量瓶中,加
    50%甲醇水溶液稀释至刻度,制得分别含200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/
    ml、700μg/ml、800μg/ml芍药苷的标准曲线溶液;

    阿魏酸标准曲线溶液制备:取阿魏酸对照品约10mg、精密称定,置100ml量瓶中,加
    50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度,制得每毫升含阿魏酸约0.1mg的对照品贮备溶液;分别
    精密移取贮备溶液0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml,分置10ml量瓶中,加
    50%甲醇水溶液稀释至刻度,制得分别含4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、14μg/
    ml、16μg/ml阿魏酸的标准曲线溶液;

    苯甲酸标准曲线溶液制备:取苯甲酸对照品约10mg、精密称定,置100ml量瓶中,加
    50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度,制得每毫升含苯甲酸约0.1mg的对照品贮备溶液;分别
    精密移取贮备溶液0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml,分置10ml量瓶中,加
    50%甲醇水溶液稀释至刻度,制得分别含4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、14μg/
    ml、16μg/ml苯甲酸的标准曲线溶液;

    b、采用两台不同高效液相色谱仪,取步骤a中制得的7个不同浓度的标准曲线溶液
    按步骤(1)给定色谱条件进样,记录色谱图。分别以各成分相对应的浓度为横坐标,相应峰
    面积为纵坐标,按最小二乘法进行线性回归,绘制标准曲线,结果见表15—表22;将羟基红
    花黄色素A、阿魏酸、苯甲酸标准曲线的斜率分别除以芍药苷标准曲线的斜率,即为各成分
    相对芍药苷的校正因子,结果见表23。

    表15羟基红花黄色素A标准曲线制备试验结果(仪器1)



    表16羟基红花黄色素A标准曲线制备试验结果(仪器2)





    表17芍药苷标准曲线制备试验结果(仪器1)



    表18芍药苷标准曲线制备试验结果(仪器2)





    表19阿魏酸标准曲线制备试验结果(仪器1)



    表20阿魏酸标准曲线制备试验结果(仪器2)



    表21苯甲酸标准曲线制备试验结果(仪器1)



    表22苯甲酸标准曲线制备试验结果(仪器2)



    表23各成分以芍药苷为内参物的校正因子测定结果汇总





    (3)按校正因子法(一测多评法)测定供试品中羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、
    苯甲酸含量:

    a、对照品工作溶液制备:精密称取芍药苷对照品适量,以50%甲醇水溶液为溶剂,
    制得含芍药苷0.4mg/ml的对照品工作溶液。

    b、供试品溶液制备:精密移取供试品1ml,置10ml量瓶中,加50%甲醇水溶液稀释
    至刻度,取此溶液5ml,置10ml量瓶中,加50%甲醇水溶液稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶
    液。

    c、测定方法:精密量取对照品混标工作溶液、供试品溶液各20μl,分别注入液相色
    谱仪,按步骤(1)给定色谱条件进样,记录色谱图。根据步骤(2)中确定的校正因子,按下述
    公式计算羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸含量。


    式中:X——供试品中各成分的含量,mg/ml

    CR——对照品工作溶液中芍药苷浓度,mg/ml

    AR——对照品工作溶液中芍药苷峰面积

    AX——供试品溶液中各成分峰面积

    F——各成分相对芍药苷的校正因子

    结论:

    1、校正因子确定后,进行血必净中间体羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸含量测
    定时,则无需采用三种不同的液相条件,分别配制对照品溶液,仅需配制一份供试品溶液,
    一份单一成分的对照品溶液,即可完成中间体中四种成分的含量测定,简化了试验步骤,克
    服了原方法的弊端。

    实施例2

    本发明所述的血必净中间体功效成分含量检测方法,包括以下步骤:

    (1)液相色谱条件:

    照高效液液色谱法测定:

    色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶;

    流动相:甲醇:醋酸水溶液(1000ml水中加入36%冰醋酸水溶液5ml)(10:90);

    流速:0.8ml/min;

    柱温:30℃;

    检测波长:230nm;

    进样量:20μl;

    运行时间:60min,

    (2)以芍药苷为内参物的相对校正因子的测定:

    a、标准曲线溶液的制备:

    羟基红花黄色素A标准曲线溶液制备:取羟基红花黄色素A对照品约20mg、精密称
    定,置10ml量瓶中,加50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度,制得每毫升含羟基红花黄色素A
    约2.0mg的对照品贮备溶液;分别精密移取贮备溶液0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、
    0.7ml、0.8ml,分置10ml量瓶中,加50%甲醇水溶液稀释至刻度,制得分别含40μg/ml、60μg/
    ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml、140μg/ml、160μg/ml羟基红花黄色素A的标准曲线溶液;

    芍药苷标准曲线溶液制备:取芍药苷对照品约200mg、精密称定,置100ml量瓶中,
    加50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度,制得每毫升含芍药苷约2.0mg的对照品贮备溶液;分
    别精密移取贮备溶液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml,分置10ml量瓶中,加
    50%甲醇水溶液稀释至刻度,制得分别含200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/
    ml、700μg/ml、800μg/ml芍药苷的标准曲线溶液;

    阿魏酸标准曲线溶液制备:取阿魏酸对照品约10mg、精密称定,置100ml量瓶中,加
    50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度,制得每毫升含阿魏酸约0.1mg的对照品贮备溶液;分别
    精密移取贮备溶液0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml,分置10ml量瓶中,加
    50%甲醇水溶液稀释至刻度,制得分别含4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、14μg/
    ml、16μg/ml阿魏酸的标准曲线溶液;

    苯甲酸标准曲线溶液制备:取苯甲酸对照品约10mg、精密称定,置100ml量瓶中,加
    50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度,制得每毫升含苯甲酸约0.1mg的对照品贮备溶液;分别
    精密移取贮备溶液0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml,分置10ml量瓶中,加
    50%甲醇水溶液稀释至刻度,制得分别含4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、14μg/
    ml、16μg/ml苯甲酸的标准曲线溶液;

    b、采用两台不同高效液相色谱仪,取步骤a中制得的7个不同浓度的标准曲线溶液
    按步骤(1)给定色谱条件进样,记录色谱图。分别以各成分相对应的浓度为横坐标,相应峰
    面积为纵坐标,按最小二乘法进行线性回归,绘制标准曲线;将羟基红花黄色素A、阿魏酸、
    苯甲酸标准曲线的斜率分别除以芍药苷标准曲线的斜率,即为各成分相对芍药苷的校正因
    子,结果见表24。

    表24各成分以芍药苷为内参物的校正因子测定结果汇总



    (3)按校正因子法(一测多评法)测定供试品中羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、
    苯甲酸含量:

    a、对照品工作溶液制备:精密称取芍药苷对照品适量,以50%甲醇水溶液为溶剂,
    制得含芍药苷0.4mg/ml的对照品工作溶液。

    b、供试品溶液制备:精密移取供试品1ml,置10ml量瓶中,加50%甲醇水溶液稀释
    至刻度,取此溶液5ml,置10ml量瓶中,加50%甲醇水溶液稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶
    液。

    c、测定方法:精密量取对照品混标工作溶液、供试品溶液各20μl,分别注入液相色
    谱仪,按步骤(1)给定色谱条件进样,记录色谱图。根据步骤(2)中确定的校正因子,按下述
    公式计算羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸含量。


    式中:X——供试品中各成分的含量,mg/ml

    CR——对照品工作溶液中芍药苷浓度,mg/ml

    AR——对照品工作溶液中芍药苷峰面积

    AX——供试品溶液中各成分峰面积

    F——各成分相对芍药苷的校正因子

    结论:

    1、校正因子确定后,进行血必净中间体羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸含量测
    定时,则无需采用三种不同的液相条件,分别配制对照品溶液,仅需配制一份供试品溶液,
    一份单一成分的对照品溶液,即可完成中间体中四种成分的含量测定,简化了试验步骤,克
    服了原方法的弊端。检测结果色谱图见:附图3

    实施例3

    本发明所述的血必净中间体功效成分含量检测方法,包括以下步骤:

    (1)液相色谱条件:

    照高效液液色谱法测定:

    色谱柱:十八烷基硅烷键合硅胶;

    流动相:甲醇:醋酸水溶液(1000ml水中加入36%冰醋酸水溶液5ml)(30:70);

    流速:1.2ml/min;

    柱温:30℃;

    检测波长:230nm;

    进样量:20μl;

    运行时间:60min,

    (2)以芍药苷为内参物的相对校正因子的测定:

    a、标准曲线溶液的制备:

    羟基红花黄色素A标准曲线溶液制备:取羟基红花黄色素A对照品约20mg、精密称
    定,置10ml量瓶中,加50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度,制得每毫升含羟基红花黄色素A
    约2.0mg的对照品贮备溶液;分别精密移取贮备溶液0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、
    0.7ml、0.8ml,分置10ml量瓶中,加50%甲醇水溶液稀释至刻度,制得分别含40μg/ml、60μg/
    ml、80μg/ml、100μg/ml、120μg/ml、140μg/ml、160μg/ml羟基红花黄色素A的标准曲线溶液;

    芍药苷标准曲线溶液制备:取芍药苷对照品约200mg、精密称定,置100ml量瓶中,
    加50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度,制得每毫升含芍药苷约2.0mg的对照品贮备溶液;分
    别精密移取贮备溶液1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml、3.5ml、4.0ml,分置10ml量瓶中,加
    50%甲醇水溶液稀释至刻度,制得分别含200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/
    ml、700μg/ml、800μg/ml芍药苷的标准曲线溶液;

    阿魏酸标准曲线溶液制备:取阿魏酸对照品约10mg、精密称定,置100ml量瓶中,加
    50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度,制得每毫升含阿魏酸约0.1mg的对照品贮备溶液;分别
    精密移取贮备溶液0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml,分置10ml量瓶中,加
    50%甲醇水溶液稀释至刻度,制得分别含4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、14μg/
    ml、16μg/ml阿魏酸的标准曲线溶液;

    苯甲酸标准曲线溶液制备:取苯甲酸对照品约10mg、精密称定,置100ml量瓶中,加
    50%甲醇水溶液溶解并定容至刻度,制得每毫升含苯甲酸约0.1mg的对照品贮备溶液;分别
    精密移取贮备溶液0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml、1.4ml、1.6ml,分置10ml量瓶中,加
    50%甲醇水溶液稀释至刻度,制得分别含4μg/ml、6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml、12μg/ml、14μg/
    ml、16μg/ml苯甲酸的标准曲线溶液;

    b、采用两台不同高效液相色谱仪,取步骤a中制得的7个不同浓度的标准曲线溶液
    按步骤(1)给定色谱条件进样,记录色谱图。分别以各成分相对应的浓度为横坐标,相应峰
    面积为纵坐标,按最小二乘法进行线性回归,绘制标准曲线;将羟基红花黄色素A、阿魏酸、
    苯甲酸标准曲线的斜率分别除以芍药苷标准曲线的斜率,即为各成分相对芍药苷的校正因
    子,结果见表25。

    表25各成分以芍药苷为内参物的校正因子测定结果汇总



    (3)按校正因子法(一测多评法)测定供试品中羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、
    苯甲酸含量:

    a、对照品工作溶液制备:精密称取芍药苷对照品适量,以50%甲醇水溶液为溶剂,
    制得含芍药苷0.4mg/ml的对照品工作溶液。

    b、供试品溶液制备:精密移取供试品1ml,置10ml量瓶中,加50%甲醇水溶液稀释
    至刻度,取此溶液5ml,置10ml量瓶中,加50%甲醇水溶液稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶
    液。

    c、测定方法:精密量取对照品混标工作溶液、供试品溶液各20μl,分别注入液相色
    谱仪,按步骤(1)给定色谱条件进样,记录色谱图。根据步骤(2)中确定的校正因子,按下述
    公式计算羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸、苯甲酸含量。


    式中:X——供试品中各成分的含量,mg/ml

    CR——对照品工作溶液中芍药苷浓度,mg/ml

    AR——对照品工作溶液中芍药苷峰面积

    AX——供试品溶液中各成分峰面积

    F——各成分相对芍药苷的校正因子

    结论:

    1、校正因子确定后,进行血必净中间体羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸含量测
    定时,则无需采用三种不同的液相条件,分别配制对照品溶液,仅需配制一份供试品溶液,
    一份单一成分的对照品溶液,即可完成中间体中四种成分的含量测定,简化了试验步骤,克
    服了原方法的弊端。检测结果色谱图见:附图4

    实施例4、实施例1-3校正因子法(一测多评法)与外标法、原标准方法结果比对:

    选取10份不同批号的血必净中间体,分别采用实施例1-3校正因子法(一测多评
    法),外标法(各成分分别制备对照品溶液)、原标准方法测定其中的羟基红花黄色素A、芍药
    苷、阿魏酸、苯甲酸含量,结果见表26-29。

    表26羟基红花黄色素A方法比对试验结果



    表27药苷方法比对试验结果





    表28阿魏酸方法比对试验结果



    表29苯甲酸方法比对试验结果





    从上表可以看出,采用本发明所确定的校正因子法(一测多评法)与现有质量标准
    中方法对同一样品中所含的羟基红花黄色素A、芍药苷、阿魏酸的测定结果的相对平均偏差
    均小于5.0%,即无明显偏差,校正因子法(一测多评法)法这一替代方案能实现对样品中多
    指标成分的准确定量。

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