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    重庆时时彩后二不倍投: 一种适用于家蚕微孢子虫免疫共沉淀的方法.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201611037489.5

    申请日:

    2016.11.23

    公开号:

    CN106526204A

    公开日:

    2017.03.22

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/68申请日:20161123|||公开
    IPC分类号: G01N33/68; G01N33/569 主分类号: G01N33/68
    申请人: 重庆三峡医药高等专科学校
    发明人: 马强; 党晓群; 刘方燕; 潘国庆
    地址: 404120 重庆市万州区五桥百安坝天星路366号
    优先权:
    专利代理机构: 北京同恒源知识产权代理有限公司 11275 代理人: 赵荣之
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201611037489.5

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.04.19|||2017.03.22

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种适用于家蚕微孢子虫免疫共沉淀的方法,其避免了现有技术中的以下三个技术问题,第一,用于免疫共沉淀实验的孢子总蛋白较难提取,由于家蚕微孢子虫自身的孢壁较厚,普通的蛋白提取液无法深入到孢子内部,也无法对蛋白进行充分提??;第二,用于免疫共沉淀的免疫球珠由于重力的缘故反应过程中会自然沉底,导致堆积的球珠不能充分和蛋白液及抗体结合,影响实验结果;第三,用于免疫共沉淀实验的抗体多为自制的多克隆抗体,抗体的特异性效果不佳,常?;岢鱿址翘匾焯醮?,此外,抗体本身重链和轻链也会影响目的蛋白的检测。本发明提高了家蚕微孢子虫免疫共沉淀的特异性,稳定性高,且重复性好。

    权利要求书

    1.一种适用于家蚕微孢子虫免疫共沉淀的方法,其特征在于,包括如下步骤:
    1)取家蚕微孢子虫孢子与PBS缓冲溶液混合,并加入直径为0.15~0.21mm的玻璃珠,在
    4℃的温度条件下于振荡器中剧烈振荡4h~6h,然后在12 000rpm条件下离心10min得上清
    液即为孢子细胞裂解蛋白;
    2)取鼠源抗体并用PBS缓冲溶液稀释,加入Protein A+G球珠悬液,4℃轻摇过夜;然后
    在2 500rpm条件下离心5min,将上清液除尽留下沉淀,向沉淀中加入步骤1)制取的孢子细
    胞裂解蛋白,重悬后横放埋于冰内4℃下缓慢摇动7~8h,期间注意更换新鲜冰块,并且轻摇
    重悬,以保证蛋白能与结合抗体的珠子充分接触,得混合液;
    3)将经步骤2)处理的混合液在4℃温度条件下,2 500rpm离心5min,吸出上清液并保证
    不吸出Protein A+G球珠,得沉淀;
    4)用IP裂解液或PBS缓冲溶液洗涤经步骤3)处理后得到的沉淀5次,洗涤时的离心条件
    和吸除上清的要求同步骤3),完成最后一次洗涤后,吸尽上清液,加入3×SDS-PAGE电泳上
    样缓冲液重悬沉淀,沸水浴处理3~5min,取出后瞬时高速离心把样品离心到管底;
    5)取样品用于SDS-PAGE电泳检测。
    2.根据权利要求1所述一种适用于家蚕微孢子虫免疫共沉淀的方法,其特征在于,所述
    PBS缓冲溶液的pH值为7.2。
    3.根据权利要求1所述一种适用于家蚕微孢子虫免疫共沉淀的方法,其特征在于,具体
    步骤如下:
    1)取1×109个家蚕微孢子虫孢子与0.01mol/L pH为7.2的PBS缓冲溶液混合,并加入0.4g
    直径为0.15~0.21mm的玻璃珠,在4℃的温度条件下于振荡器中剧烈振荡4h,然后在12
    000rpm条件下离心10min得上清液即为孢子细胞裂解蛋白;
    2)取2μL鼠源抗体并用pH为7.2的PBS缓冲溶液稀释至500μL,加入40μL Protein A+G球
    珠悬液,4℃轻摇过夜;然后在2 500rpm条件下离心5min,将上清液除尽留下沉淀,向沉淀中
    加入200μL步骤1)制取的孢子细胞裂解蛋白,重悬后横放埋于冰内4℃下缓慢摇动7~8h,期
    间注意更换新鲜冰块,并且轻摇重悬,以保证蛋白能与结合抗体的珠子充分接触,得混合
    液;
    3)将经步骤2)处理的混合液在4℃温度条件下,2 500rpm离心5min,吸出上清液并保证
    不吸出Protein A+G球珠,得沉淀;
    4)用IP裂解液或PBS缓冲溶液洗涤经步骤3)处理后得到的沉淀5次,裂解液或PBS的用
    量为0.5~1mL/次,洗涤时的离心条件和吸除上清的要求同步骤3),完成最后一次洗涤后,
    吸尽上清液,加入20~40μL 3×SDS-PAGE电泳上样缓冲液重悬沉淀,沸水浴处理3~5min,
    取出后瞬时高速离心把样品离心到管底;
    5)取样品用于SDS-PAGE电泳检测。

    关 键 词:
    一种 适用于 家蚕 孢子 免疫 共沉淀 方法
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