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    老重庆时时彩龙虎和走势: 检测神经丝蛋白相关多肽的单克隆抗体的方法.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201610861434.X

    申请日:

    2016.09.29

    公开号:

    CN106519028A

    公开日:

    2017.03.22

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):C07K 16/18申请日:20160929|||公开
    IPC分类号: C07K16/18; C07K16/06; C12N5/20; G01N33/68 主分类号: C07K16/18
    申请人: 厦门两易生物科技有限公司
    发明人: 王磊
    地址: 361000 福建省厦门市集美区灌口中路996号物流中心A区
    优先权:
    专利代理机构: 北京君泊知识产权代理有限公司 11496 代理人: 王程远
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201610861434.X

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2017.04.19|||2017.03.22

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了检测神经丝蛋白相关多肽的单克隆抗体的方法,方法包括AD7c?NTP?230单克隆抗体的表达和AD7c?NTP?230单克隆抗体的纯化,通过合成高纯度AD7c?NTP相关多肽对6?8周龄的雌性BALB/c小鼠进行免疫,如果抗体滴度在1:10000以上时,可将免疫小鼠脾细胞的单细胞悬液与对数生长期的骨髓瘤细胞融合并筛选,得到AD7c?NTP?230的单克隆抗体的杂交瘤细胞;向6?8周龄的雌性BALB/c小鼠腹腔注射杂交瘤细胞,注射细胞后10天收集腹水,protein?A/G柱子纯化腹水,获得纯度较高的AD7c?NTP?230单克隆抗体,用于体外诊断阿尔茨海默病和确定疾病进展的阶段。

    权利要求书

    1.检测神经丝蛋白相关多肽的单克隆抗体的方法,其特征在于,所述方法包括AD7c-
    NTP-230单克隆抗体的表达和AD7c-NTP-230单克隆抗体的纯化。
    2.根据权利要求1所述的检测神经丝蛋白相关多肽的单克隆抗体的方法,其特征在于,
    所述AD7c-NTP-230的单克隆抗体的表达包括以下步骤:
    第一步, 将合成的高纯度AD7c-NTP-230多肽与载体蛋白BSA用SPDP连接法进行偶联:
    4.6mg SPDP溶解于740ulDMSO,终浓度为20mM,0.1008gBSA溶解于2ml PBS-EDTA溶液中,室
    温静置1h,HiTrapTM Deaslting column脱盐柱洗脱多余的SPDP,4mg多肽加入偶联好的
    BSA-SPDP体系中室温过夜;
    第二步,用BSA偶联的AD7c-NTP-230多肽进行动物免疫:选择6-8周龄的雌性BALB/c小
    鼠,按照每只100μg的量,与等体积的完全弗氏佐剂混合乳化,乳浊液皮下多点注射,免疫2-
    3周后加强免疫,抗原剂量同上,与弗氏不完全佐剂混合乳化,乳浊液皮下多点注射,免疫7-
    10天后小鼠尾静脉采血,收集血清,使用间接法ELISA测定血清中针对的抗体滴度,如果抗
    体滴度在1:10000以上,在融合前三天加强免疫,100微升的PBS溶解50μg抗原腹腔内注射,
    否则,继续进行每两走一次免疫,直到达到较高的抗体滴度;
    第三步,细胞融合和筛?。何瞬置诘牡タ寺】固宓脑咏涣鱿赴?,将对数生长期的
    骨髓瘤细胞与免疫小鼠脾细胞的单细胞悬液混合,然后在聚乙二醇(PEG)介导的条件下融
    合,脾细胞与骨髓瘤细胞在10:1的比例混合,将细胞的混合物用用无血清的DMEM培养基洗
    涤5次,在37℃水浴中,向细胞团中逐滴加入50%PEG,并轻轻摇动细胞沉淀,再经无血清的
    DMEM培养基洗涤1次,用含有HAT的完全培养基重悬融合后的细胞团,轻轻吹打至细胞团散
    开,并按200微升/空接种于96孔细胞培养板中,之后,每隔2-3天半量更换培养基,直到杂交
    瘤细胞克隆足够大可以筛选,使用间接法ELISA筛选分泌针对AD7c-NTP-230抗体阳性细胞
    孔,手册确定为阳性细胞孔,经过有限稀释法,至少亚克隆3次,保证阳性率在100%,获得可
    以稳定分泌AD7c-NTP-230抗体的杂交瘤细胞株;
    第四步,腹水制备:选择6-8周龄的BALB/c雌性小鼠,每只小鼠腹腔注射0.5ml石蜡油,
    7-10天后注射杂交瘤细胞。
    3.根据权利要求1所述的检测神经丝蛋白相关多肽的单克隆抗体的方法,其特征在于,
    所述AD7c-NTP-230的单克隆抗体的纯化包括以下步骤:
    第一步,注射细胞后10天左右收集腹水;
    第二步,protein A/G柱子纯化腹水,获得纯度较高的AD7c-NTP-230单克隆抗体。

    关 键 词:
    检测 神经 蛋白 相关 多肽 单克隆抗体 方法
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