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    重庆时时彩后三4胆: 生物纳米容器的制备及其在癌症治疗中的应用.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201410329275.X

    申请日:

    2014.07.11

    公开号:

    CN104764876A

    公开日:

    2015.07.08

    当前法律状态:

    撤回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):G01N 33/52申请公布日:20150708|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/52申请日:20140711|||公开
    IPC分类号: G01N33/52 主分类号: G01N33/52
    申请人: 青岛科技大学
    发明人: 丁彩凤; 张伟; 李小倩; 陈瑶瑶; 王威; 张书圣
    地址: 266000山东省青岛市崂山区松岭路99号
    优先权:
    专利代理机构: 代理人:
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201410329275.X

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2017.03.29|||2015.09.16|||2015.07.08

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的视为撤回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本文发明了一种利用高灵敏度的Si纳米结构释放荧光素分子检测ATP的生物纳米容器,并在癌症治疗中应用。金纳米粒子通过Au-S键与ATP分子的适体结合;在醛基修饰的纳米容器(Si-MP-CHO)表面通过共价结合作用,将适体的互补链结合到纳米容器的表面。通过DNA杂交,金纳米粒子将荧光素分子封闭在纳米容器内部。加入ATP,适体与ATP分子特异性结合,使封闭在纳米容器中的金纳米粒子离开其表面,释放出荧光素分子。通过检测荧光信号,来实现对ATP的定量分析。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  生物纳米容器的制备及其在癌症治疗中的应用。步骤包括:
    (a)修饰有ATP适体的金纳米粒子的合成:首先制备还原性的金胶粒子,将ATP适体DNA2加入到金胶缓冲溶液中混合均匀,在室温条件下摇床避光12h,再静置12h。
    (b)Si-MP的合成:将3.5ml2mol/L的NaOH加入到500mlCTAB(1g)的水溶液中,搅拌15min后,在室温下加入5mlTEOS,恒温80℃下大力搅拌2h。反应结束后将白色固体滤出,用甲醇洗净,在真空环境下干燥24h。
    (c)Si-MP-NH2的合成:Si-MP溶于适量甲苯溶液中,混合均匀后,加入8ml3-氨丙基三甲氧基硅烷,恒温80℃搅拌2h。反应结束后滤出固体产品,用乙醇洗净,在烘箱中烘干。
    (d)Si-MP-CHO的合成:取0.2gSi-MP-NH2均匀地溶于5%戊二醛溶液300mL中,常温下搅拌1h。反应结束后将固体颗粒离心分离后再用去离子水洗涤三次,得到产品后在烘箱中将产品干燥。
    (e)Si-MP-CHO与荧光素的结合:取0.02gSi-MP-CHO均匀地溶于1mlPBS缓冲溶液中,取500μL所得溶液,加入200μL浓度为10-4mol/L的荧光素混合均匀,在室温下,置于暗处24h。
    (f)Si-MP-CHO与DNA1的结合:取100μL的浓度为10-7mol/L的DNA1溶液与步骤e中溶液混合,在室温条件下摇床12h,之后再在暗处静置12h。
    (g)将a和f两步骤当中所得到的两种溶液混合,室温下静置2h。离心,去除上清液,得到固体产品。用PBS洗涤多次得固体产品。
    (h)采用逐级稀释法配制不同浓度的ATP溶液,向ATP溶液加入一份固体,另一份加入无ATP的PBS缓冲溶液以此作为空白对照,于37℃水浴恒温1h。
    (i)将所得产品离心,取出上清液,测荧光,得到数据。
    (j)材料在细胞中的检测,样品封堵之后取一定量的MCF-7癌细胞与其混合,在荡床中放置1.5h,用激光共聚焦测试样品。

    2.  根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(a)中还原性金纳米粒子的制备还原剂可采用柠檬酸三钠等。

    3.  根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(b)中所得固体用甲醇清洗。

    4.  根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(c)中在制备Si-MP-NH2时,加入3-氨丙基三甲氧基硅烷。

    5.  根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(c)中在制备Si-MP-NH2时,加入3-氨丙基三甲氧基硅烷后要在80℃恒温下反应2h。

    6.  根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(d)中在制备Si-MP-CHO时,加入戊二醛后反应1h。

    7.  根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(g)中利用金胶和DNA来封闭硅基介孔材料。

    8.  根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(h)中,ATP的作用是打开DNA双链。

    9.  根据权利要求1所述的方法,其特征在于:步骤(j)中,使用荧光共聚焦看样品成像。

    说明书

    说明书生物纳米容器的制备及其在癌症治疗中的应用
    技术领域
    介孔材料Si-MP是一种以药物释放的需求为特色的新型的纳米材料。它具有较高的热稳定性,良好的机械性能,无生物活性、无毒性,易于修饰的内表面以及较高的比表面积的特点,实现药物选择性地作用于病变部位,并按需精确控释或缓释,延长药物作用时间,应用于吸附分离领域、催化领域、生物和医药领域、新材料加工及合成领域等多个领域。
    背景技术
    介孔材料具有较大的孔容、高的比表面积、有序且可调的孔道结构,其孔道表面可进行物理吸附或新的化学修饰,通过固定一些功能分子而形成新的功能材料。特别是硅基介孔材料的孔道表面具有许多Si-OH基团,可作为活性点与一些功能有机分子反应,从而将其以化学键的方式固定在孔道上,这样形成的组装材料具有较强的稳定性。
    硅基介孔材料合成方法主要有水热合成,微波辐射合成,溶胶一凝胶法、相转变法、溶剂挥发法和室温合成等。由于硅基介孔材料骨架网络中晶格缺陷少,缺乏质子酸和Lewise酸性中心,因而其本身的催化及反应活性不高,如何利用其所具有的规则大孔道,为某些较大烃类分子进行烷基化、异构化等催化反应提供理想场所,需要进一步改性来完善其性能。因此,寻找新的合成方法开发新的介孔材料、如何保证孔结构的稳定孔隙率和比表面积较高的介孔材料仍然是未来研究的热点。
    发明内容
    本发明结合了前人工作的基础上提出了一种基于高灵敏度的纳米容器释放荧光素分子检测ATP分子的荧光分析检测方法。金纳米粒子通过Au-S键与ATP分子的适体结合;在醛基修饰的纳米容器(Si-MP-CHO)表面通过共价结合作用,将适体的互补链结合到纳米容器的表面。通过DNA杂交,金纳米粒子将荧光素分子封闭在纳米容器里面。加入ATP以后,适体与ATP分子特异性结合,使得封闭纳米容器的金纳米粒子离开其表面,释放出荧光素分子。通过检测荧光信号,可实现对ATP的定量分析。该方法对ATP分子可检测到4.0×10-6M,不仅具有较高的灵敏度,且方法简便,可广泛用于其它生物样品中ATP的实际检测。
    本发明所提供的方法包括以下步骤:
    (1)制备修饰有ATP适体的还原性金纳米粒子。
    首先制备还原性的金胶粒子,将ATP适体DNA2加入到金胶缓冲溶液中混合均匀,在室温条件下摇床12h,再静置12h。
    所述的方法,其所述的还原剂为柠檬酸三纳。
    (2)合成Si-MP:将3.5mL2mol/L的NaOH加入到500mlCTAB(1g)的水溶液中,搅拌15min后,在室温下加入5mlTEOS,恒温80℃下大力搅拌2h。反应结束后将白色固体滤出,用甲醇洗净,在真空的环境下干燥24h。
    所述的方法,其所述的所得固体需用甲醇清洗。
    (3)合成Si-MP-NH2:Si-MP溶于适量甲苯溶液中,混合均匀后,加入8ml3-氨丙基三甲氧基硅烷,恒温80℃搅拌2h。反应结束后滤出固体产品,用乙醇洗净,在烘箱中烘干。
    所述的方法,其所述的在制备过程中需加入3-氨丙基三甲氧基硅烷。
    所述的方法,其所述的在制备过程中加入3-氨丙基三甲氧基硅烷后的反应时间为80℃恒温下2h。
    (4)合成Si-MP-CHO:取0.2gSi-MP-NH2均匀地溶于5%戊二醛溶液300mL中,常温下搅拌1h。反应结束后将固体颗粒离心分离后再用去离子水洗涤三次,得到产品后在烘箱中干燥1h。
    所述的方法,其所述的制备Si-MP-CHO时,加入戊二醛后反应1h。
    (5)Si-MP-CHO与荧光素的结合:取0.02gSi-MP-CHO均匀地溶于1mlPBS缓冲溶液中,取500μL所得溶液,加入200μL浓度为10-4mol/L的荧光素混合均匀,室温下置于暗处24h。
    (6)Si-MP-CHO与DNA1的结合:取100μL的浓度为10-7mol/L的DNA1溶液与步骤e中溶液混合,在室温条件下摇床12h,之后再在暗处静置12h。
    (7)将a和f两步骤当中所得到的两种溶液混合,室温下静置2h。离心去除上清液,得到固体产品。用PBS洗涤多次得固体产品。
    所述的方法,其所述的是利用金胶和DNA来封闭硅基介孔材料。
    (8)采用逐级稀释法配制不同浓度的ATP溶液,向ATP溶液加入一份固体,另一份加入无ATP的PBS缓冲溶液以此作为空白对照,于37℃水浴恒温1h。
    所述的方法,其所述的ATP的作用是打开DNA双链。
    (9)将所得产品离心,取出上清液,测荧光,得到数据。
    (10)材料在细胞中的检测,样品封堵之后取一定量的MCF-7癌细胞与其混合,在荡床中放置1.5h,用激光共聚焦测试样品。
    所述的方法,其所述的使用荧光共聚焦看样品成像,即可以得到所需的数据,也可以得到图像。
    附图说明
    附图1为发明设计过程原理图。1、修饰有ATP适体的金纳米粒子的合成;2、Si-MP的合成; 3、Si-MP-NH2的合成;4、Si-MP-CHO的合成;5、Si-MP-CHO与荧光素的结合;6、Si-MP-CHO与DNA1的结合;7、金胶与介孔材料结合;8、ATP溶液与介孔材料结合,荧光检测;9、活体细胞检测。
    附图2为介孔材料的电镜图
    附图3为ATP曲线图(左图为浓度梯度曲线图;右图为工作曲线图)
    附图4为溶液pH最佳曲线图
    附图5为荧光素释放时间图(从上到下曲线依次代表含有ATP的样品、不含有ATP的空白试样)
    附图6为温度最佳曲线图
    具体实施方式
    以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。
    实施例1
    生物纳米容器的制备及其在癌症治疗中的应用(见图1)
    一、金纳米粒子-ATP适体的制备。
    (1)金纳米粒子的制备
    纳米金粒子的合成是通过柠檬酸三钠还原四氯金酸制备而成。具体制备方法如下:首先安装回流冷凝装置,然后取100ml质量分数为0.01%的四氯金酸溶液加入至圆底烧瓶中,搅拌。加热,直至沸腾。取2.5ml10g/L(质量分数约为1%)的柠檬酸三钠溶液快速加入至沸腾的四氯金酸溶液当中,此时溶液慢慢变为桃红色。继续加入煮沸,保持沸腾状态5-10min。而后停止加热,冷却直至室温,最后停止搅拌。所得到的金胶放于棕色广口瓶中4摄氏度保存。
    (2)金纳米粒子-ATP适体的制备
    取所制金胶500μL。取100μL浓度为10-7mol/L的DNA2溶液加入至所取的金胶缓冲溶液当中,混合均匀。在室温条件下摇床避光12h,之后再静置12h。
    二、硅基介孔材料的制备
    (1)Si-MP的制备
    将3.5ml2mol/L的NaOH加入到500mlCTAB(1g)的水溶液中,搅拌15min后,在室温下加入5mlTEOS,恒温80℃下大力搅拌2h。反应结束后将白色固体滤出,用甲醇洗净,在真空环境下干燥24h。
    (2)Si-MP-NH2的制备
    Si-MP溶于适量甲苯溶液中,混合均匀后,加入8ml3-氨丙基三甲氧基硅烷,在80℃恒温下搅拌2h。反应结束后滤出固体产品,用甲醇洗净,在烘箱中烘干。
    (3)Si-MP-CHO的制备
    取0.2gSi-MP-NH2均匀地溶于5%戊二醛溶液300mL中,常温下搅拌1h。反应结束后将固体颗粒离心分离后再用去离子水洗涤三次,得到产品后在烘箱中将产品干燥。
    三、材料性能的检测
    (1)Si-MP-CHO与荧光素的结合
    取0.02gSi-MP-CHO均匀地溶于1mlPBS缓冲溶液当中,取500μL所得溶液,加入200μL浓度为10-4mol/L的荧光素,混合均匀,在室温下,置于暗处24h。
    (2)Si-MP-CHO与DNA1的结合
    取100μL的浓度为10-7mol/L的DNA1溶液与(1)中溶液混合,在室温条件下摇床12h,之后再在暗处静置12h。
    (3)介孔材料与金胶结合
    将两种溶液混合均匀,室温下静置2h。离心,去除上清液,得到固体产品。用PBS缓冲溶液多次洗涤得到固体产物。
    四、荧光检测
    采用逐级稀释法配制不同浓度的ATP溶液,向ATP溶液加入一份固体,另一份加入无ATP的PBS缓冲溶液以此作为空白对照,于37℃水浴恒温1h。将所得产品离心,取出上清液,测荧光,得到数据。
    五、在细胞中活体检测
    样品封堵之后取一定量的MCF-7癌细胞与其混合,在荡床中放置1.5h,用激光共聚焦测试样品。

    关 键 词:
    生物 纳米 容器 制备 及其 癌症 治疗 中的 应用
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