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    重庆时时彩作弊图片: 先兆子痫检测和治疗的方法和组合物.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201410748445.8

    申请日:

    2009.11.02

    公开号:

    CN104777308A

    公开日:

    2015.07.15

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 专利实施许可合同备案的生效IPC(主分类):G01N 33/68合同备案号:2018990000099让与人:耶鲁大学、加利福尼亚大学董事会受让人:浙江数问生物技术有限公司发明名称:先兆子痫检测和治疗的方法和组合物申请日:20091102申请公布日:20150715授权公告日:20170412许可种类:独占许可备案日期:20180417|||专利权的转移IPC(主分类):G01N 33/68登记生效日:20171219变更事项:专利权人变更前权利人:耶鲁大学变更后权利人:耶鲁大学变更事项:地址变更前权利人:美国康涅狄克州变更后权利人:美国康涅狄克州变更事项:共同专利权人变更前权利人:加利福尼亚大学欧文分校 加利福尼亚大学董事会变更后权利人:加利福尼亚大学董事会|||授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/68申请日:20091102|||公开
    IPC分类号: G01N33/68 主分类号: G01N33/68
    申请人: 耶鲁大学; 加利福尼亚大学欧文分校; 加利福尼亚大学董事会
    发明人: C·S·布希姆斯基; I·布希姆斯基; C·G·格莱柏
    地址: 美国康涅狄克州
    优先权: 61/197,914 2008.10.31 US; 61/206,534 2009.01.29 US
    专利代理机构: 北京万慧达知识产权代理有限公司11111 代理人: 戈晓美; 杨颖
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201410748445.8

    授权公告号:

    ||||||||||||

    法律状态公告日:

    2018.05.11|||2018.01.05|||2017.04.12|||2015.08.12|||2015.07.15

    法律状态类型:

    专利实施许可合同备案的生效、变更及注销|||专利申请权、专利权的转移|||授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    先兆子痫(PE)是一种妇女妊娠20周开始出现,以血压升高和蛋白尿本为特征的,严重时可致命的疾病。目前还没有能够预测、诊断先兆子痫或预计病情发展程度的临床检测。先兆子痫已被专利申请人证明是一种以蛋白质错误折叠为特点的疾病,可以通过识别蛋白质错误折叠来诊断先兆子痫。因此,本发明公开了一种用于诊断先兆子痫或者预测先兆子痫风险的体外诊断的方法和组合物:通过利用错误折叠蛋白聚合物的标记试剂及对蛋白质具有亲和性的支持表面组成体外诊断试剂盒,在与孕妇尿液相互混合后,能够诊断受检孕妇是否患有先兆子痫或者患先兆子痫的风险。本发明适合妊娠早期进行疾病筛查及预防。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  错误折叠蛋白质聚集物的标记试剂在制备用于诊断先兆子痫或者预测先兆子痫风险的 体外诊断试剂中的应用。

    2.  一种用于体外诊断先兆子痫或者预测先兆子痫风险的试剂盒,包括:
    错误折叠蛋白质聚集物的标记试剂;以及
    对蛋白质具有亲和性的支持表面。

    3.  权利要求2中所述试剂盒,还包括用来去除未结合错误折叠蛋白聚集物的所述标记试剂 的洗涤液。

    4.  一种组合物包括孕妇尿液样本,以及与所述尿液样本相互混合的错误折叠蛋白质聚集物 的标记试剂。

    5.  权利要求4的组合物,其中所述孕妇尿液样本包含错误折叠蛋白聚集物。

    6.  权利要求4的组合物,其中所述尿液样本与所述错误折叠蛋白质聚集物的标记试剂的混 合物置于一个支持表面上。

    7.  一种制备权利要求4-6任一项所述组合物的方法,包括将所述尿液标本与一种错误折叠 蛋白质聚集物的标记试剂相互混合。

    说明书

    说明书先兆子痫检测和治疗的方法和组合物
    本申请是申请号为200980153533.0、申请日为2009年11月2日、发明名称为“先兆子 痫检测和治疗的方法和组合物”的中国发明专利申请的分案申请,原申请为国际申请号为 PCT/US2009/005957的国家阶段申请,该国际申请要求申请日分别为2008年10月31日、 2009年1月29日,申请号分别为61/197,914、61/206,534的美国临时申请的优先权。
    相关专利
    这个专利申请要求以下两个优先权:2008年10月31日递交的题为“先兆子痫是一种以 错误折叠蛋白质的特定超分子聚合为特征的疾病”的美国临时专利号61/197,914;2009年 1月29日递交的题为“先兆子痫是一种以错误折叠蛋白质的特定超分子聚合为特征的疾病, 可以利用识别特定蛋白质低聚物构象的抗体进行检测”的美国临时专利号61/206,534,两者 的全部内容通过引用的方式结合到本文中。
    发明背景
    在美国,有6-8%的孕妇被先兆子痫困扰着(Hauth,J.C.et al.,Obstet Gynecol. 95(1):24-8,2000),发病率为每1000个分娩中有23.6例(Samadi,A.R.et al.,Obstet Gynecol. 87(4):557-63,1996.)。先兆子痫被认为应当为20%的孕妇相关女性死亡负责(MacKay,A.P.et al.,Paediatr Perinat Epidemiol.19(3):206-14,2005),是治疗性早产(medically indicated  preterm delivery)(MIPTD)的主要原因(Fronterhouse,W.et al.,J Matern Fetal Med. 10(3):162-5,2001.),应当为所有早产的10%负责(Fronterhouse,W.et al.,J Matern Fetal Med. 10(3):162-5,2001.)。先兆子痫(PE)是以怀孕后20周开始出现血压升高和蛋白尿为特征 的(ACOG Committee on Practice Bulletins.Obstet Gynecol.99(1):159-67,2002.)。如果血压 和蛋白尿持续增加或者出现末端器官损坏(包括胎儿生长限制)的症状,就会被认为是严 重先兆子痫(sPE)。严重先兆子痫的过程伴随着女性身体状况的渐行性恶化,医源性分娩 依然是唯一明确的治疗方法?;だ硪绞刹扇〉拇胧┌ㄈê舛晕闯墒焯ザ⒓捶置涞姆?险和母子都受到先兆子痫困扰的风险。对此,现在的手段是紧密监控母亲和胎儿的状态, 并且以人工生产作为最终的处理方法。(Zamorski,M.A.&Green,L.A.Am Fam Physician 64:263-70,216,2001.)
    现今,还没有能够预测或者诊断先兆子痫或者预计一个特定病人体内会发展到怎样严 重程度的临床检测。早期症状包括持续头痛、视线模糊或者对光的敏感性以及腹部疼痛。 然而,先兆子痫通常在直到发现血压升高和尿液中的蛋白质(蛋白尿)之前不会被诊断出 来,而这些一般是在怀孕二十周后的常规护理检查中发现的(Roberts JM,Cooper DW. Pathogenesis and genetics of pre-eclampsia.Lancet.2001;357(9249):53-56)。在这种诊断后先 兆子痫的严重症状包括癫痫、大脑出血、消耗性血管内凝血和肾衰竭可能很快就会出现。 这些方法是不准确的,而且对大部分严重症状发展的可能性只提供了很少的信息。而且, 目前的诊断方法需要医生的监督和有损伤性的方法,进一步拖延早期和快速的诊断,并使 之复杂化。因此急需开发一个更早期更准确的不需要医师进行监督的检测和诊断先兆子痫 及伴随着的蛋白尿高血压紊乱的方法。
    发明摘要
    如以下所述,专利申请人证明了先兆子痫(PE)是一个以蛋白质错误折叠(形成异常 或者错误折叠的蛋白质聚集物)为特点的局限于孕妇的病症。此外,他们还证明了颇具特 征的异常蛋白质聚集物(我们也称之为错误折叠蛋白质聚集物或中间体)在尿液中出现并 积累于得了先兆子痫的孕妇(病人)的胎盘中并且是嗜刚果红的。这些异常蛋白质聚集物 是伴随着先兆子痫的出现,并且他们在尿液和/或胎盘组织中的出现也表明先兆子痫的存 在。在本说明书中,“错误折叠蛋白质的超分子聚集物”(supramolecular aggregates of  misfolded proteins)一词(简称为“超分子聚集物”)的意思包含可溶蛋白质聚集物和不可溶 蛋白质聚集物。这里所描述的伴随着先兆子痫出现的错误折叠蛋白质的超分子聚集物可用 于判断孕妇先兆子痫的出现,也可以判断一个孕妇患先兆子痫的可能性或者风险。
    最近蛋白质组学的发现使得寻找生物标记分子和将先兆子痫看做是一种错误折叠紊乱 的新视角成为可能。正如这里所述的,申请人已经确定了PE中的蛋白质错误折叠的出现 以及性质和水平。他们已经证明PE是以错误折叠蛋白的排泄量增加为特征的,这个现象 可以使用错误折叠蛋白聚集物对于特定染料例如自组装偶氮染料刚果红(self-assembling  azo dye Congo Red(CR))的亲和力而被检测到。
    蛋白质构象紊乱疾病如老年痴呆症、轻链淀粉样变性和阮病毒疾病是通过由于细胞内 蛋白质的防御性折叠为异常3D结构而造成的含淀粉纤维的形成和聚集形成的。专利申请 人发现可溶性前淀粉蛋白低聚物(soluble pre-amyloid oligomers)(纤维组装中的中间体,也 就是错误折叠的蛋白质中间体)有可以导致内皮损伤和氧化性压力的蛋白质毒性作用,而 这些正是在严重先兆子痫(sPE)中起到致病性作用的过程。申请人发现检测到可溶性前 淀粉蛋白低聚物的出现可以显示或者预示严重PE(severe PE)和前严重PE(pre-severe PE) (前先兆子痫,也就是可以发展成为临床显性的sPE之前的亚临床状态)。
    所以,申请人发现和鉴定了这种孕妇特有的病症中尿里的可溶性前淀粉蛋白低聚物的 性质。他们的成果是在世界上最先发现PE是以蛋白质的类淀粉蛋白组装为特征的构象紊 乱疾病。
    这里描述的使用可以识别具有独特的折叠构象的蛋白质和蛋白质低聚物的抗体进行的 进一步工作支持了错误折叠的蛋白质中间体倾向于组装为可能在临床性疾病的表现上发 挥作用的孔状结构(淀粉蛋白通道)的发现。已经被诊断PE或者注定会得PE的病人的尿 液和/或胎盘中积累着异常和/或过度错误折叠蛋白质聚集物,显示着这些异常蛋白质聚集 物是这个疾病病理中的致病性因素。这项新发现为新的治疗(部分或全部降低疾病的发作 或者发展、逆转)先兆子痫的诊断和治疗策略提供了基础。例如,使用免疫学或者药理学 手段阻止这样结构的形成、逆转(干扰、拆散)已经存在的超分子聚集物提供了治疗先兆 子痫的治疗性干涉的新途径。
    这样的异常蛋白聚集物(蛋白质的超分子类淀粉蛋白组装)除了对刚果红的亲和力之 外的特征也在这里叙述了。在先兆子痫病人的尿液和胎盘组织中发现的超分子聚集物的一 个组分是SerpinA1(alpha-1抗胰蛋白酶)或SerpinA1的多肽片段。所以,先兆子痫与其 他疾病(如alpha-1抗胰蛋白酶缺乏症)有一个相似的特征:在alpha-1抗胰蛋白酶缺乏 症里,错误折叠的alpha-1抗胰蛋白酶的积累导致了肝细胞的损伤和肝硬化(n.Engl.1ed. 346:45-53(2002);J.Clin.Inv.110:1585-1590(2002))。此外,血浆铜蓝蛋白(ceruloplasmin)、 重链IgG(heavy-chain IgG)和轻链IgG(light-chain IgG)、干扰素诱导蛋白 6-16(interferon-inducible protein 6-16)(IFI6-16,G1P3)及他们的片段在PE的嗜刚果红性 蛋白尿中都被鉴定为错误折叠蛋白质聚集物的组分。这里描述的以及在后面描述的特定实 施方案中,是伴随着先兆子痫出现并出现在尿液和胎盘组织中的分离出的异常蛋白聚集 物,这些分离出的异常蛋白质聚集物中至少含有以下成份中的一个(一个或者更多): SerpinA1、血浆铜蓝蛋白、重链IgG、轻链IgG、干扰素诱导蛋白6-16以及每个的片段。
    这里描述的本发明的实施方案之一是一个非创性的尿液诊断和预后的检测或者检验, 它是基于在妊娠过程中检测伴随着先兆子痫的上述对刚果红显现亲和性(嗜刚果红性)的 异常蛋白聚集物的出现与否(定性)或其数量(定量),并且是对蛋白错误折叠的一个整 体性的衡量。利用刚果红保留率(Congo Red Retention)(CRR)来评估整体蛋白错误折叠负 荷(global protein misfolding load)是诊断PE和有指征分娩(indicated delivery)(IND)(有指 征分娩是早产的一大因素)的一种简单的诊断测试。这里描述了诊断和预后检验,在一些 实施方案中,具体地说,根据评估或分析从一个孕妇处获得的样品(例如尿液或者胎盘组 织)以检测样品中是否含有与先兆子痫相关的嗜刚果红性的异常蛋白聚集物。然而,应该 读者要明白:这种诊断或预后检验可以使用多种多样的能够检测或者分析出一个样品中是 否含有与先兆子痫相关的异常蛋白聚集物或者其含量的试剂,嗜刚果红性只是错误折叠蛋 白聚集物的一个描述性特征之一。其他特征包括:例如异常蛋白聚集物的组成和构象,它 反过来定义了错误折叠蛋白聚集物的其他性质,如他们的大小、与其他染料的相互作用、 以及与抗体的结合,这些都可以用于上述的诊断和预后方法中。
    这里描述的是一种通过在孕妇尿液或者胎盘组织中检测伴随着先兆子痫出现的一个 (一个或更多)错误折叠蛋白质的超分子聚集物(异常蛋白聚集物、错误折叠蛋白聚集物、 错误折叠蛋白中间体、蛋白质的超分子类淀粉蛋白组装)来诊断或者辅助诊断孕妇体内先 兆子痫的方法。应当理解的是这里描述的检测试验可以在妊娠过程中的任何时间进行。在 一些特定的实施方案中,这里描述的诊断测试可以对计划要怀孕的女性进行。
    这样的超分子聚集物可以利用利用本领域内所知的一系列的现有技术和方法在尿液或 胎盘组织中来检测出来。一种合适的技术就是当尿液或胎盘组织中的异常蛋白聚集物达到 和先兆子痫相关的水平就能检测到。这样的技术可以利用染料、小分子、荧光化合物或者 其它与异常蛋白聚集物结合或者相互作用的试剂(如一种抗体、抗体片段、抗体拟肽), 来标记、显示或者改变聚集物使其能被检测得到。在这里和其他实施方案中,一个结果就 是超分子聚集物/异常蛋白聚集物以及尿液或胎盘组织样品与最初获得的尿液或胎盘组织 及其组分有所不同(也就是样品被修饰过了,如加入分析它们中要用的试剂、改变温度或 者稀释度或浓度;异常蛋白聚集物被标记、显示了或改变,这样他们就能被检测到了)。 应当理解的是当使用一种染料的时候,可用于检测这里所描述的超分子聚集的染料可能具 有以下特征中的一个或多个:一种自组装染料、一种非自组装染料、一种杂芳香族染料、 一种偶氮染料、一种纤维特异性染料和/或其它染料。这些染料可以包括但不仅限于:刚果 红、姜黄素类似物;X-34(1,4-二(3-羧基-4-羟基苯基乙烯基)苯)(1,4-bis(3- carboxy-4-hydroxyphenylethenyl)-benzene);硫磺素S(Thioflavin S);硫磺素T(Thioflavin  T);尼罗红(Nile Red);吖啶橙(acridine orange);氨基-8-磺酸萘(ANS);Bis-ANS;4- (二氰基乙烯基)久洛尼定(4-(dicyanovinyl)-julolidine)(DCVJ);AO1987(恶嗪染料); 荧光苯乙烯基染料(fluorescent styryl dyes);BF-168:(6-2-氟乙氧基)-2-[2-(4-甲氨基苯 酚)乙烯基]苯并嗯唑((6-2-Fluoroethoxy)-2-[2-(4-methylaminophenil)ethenyl]benzoxazole); BSB:(反,反)-1-溴-2,5-二-(3-羟基羰基-4-羟基)苯乙烯基苯((trans,trans)-l- bromo-2,5-bis-(3-hydroxycarbonyl-4-hydroxy)styrylbenzene);喹啉腙(quinilinehydrazone) 化合物(如,4-甲基-7-甲氧基-2-(4-喹啉基亚甲基联氨)喹啉)(即 4-methyl-7-methoxy-2-(4-quinolylmethylenehydrazino)quinoline),金黄胺G(即 Chrysamine-G);利福平(rifampicin);褪黑素;黄芩素(baicalein);鲨肌醇(scyllitol)(如: 青蟹肌醇(Cocositol),Quercinitol,1,3,5/2,4,6-六羟基环己烷)及其衍生物;成像探针, 如[11C]-PIB:N-甲基[11C]2-(4’-甲基氨基苯酚-6-羟基苯并三唑)(N-methyl[11C] 2-(4'-methylaminophenyl-6-hydroxybenzathiazole));均二苯乙烯基苯并三唑 (stilbenylbenzothiazole)和其衍生物。
    自组装染料包括例如,刚果红、伊文思蓝(Evans Blue),bis-azo ANS,非自组装染料 包括例如ANS和锥虫蓝(Trypan Blue)。
    如这里所描述的,这些异常蛋白聚集物显示了对自组装偶氮染料刚果红的亲和力,所 以,它们在尿液或胎盘组织中的出现可通过检测来自于有待检测(试验)先兆子痫的孕妇 的尿液或胎盘组织中的嗜刚果红性来确定(定性和/或定量)。这里所描述的是一种诊断或 者辅助诊断一个孕妇体内先兆子痫的方法,检测出尿液的嗜刚果红性,比如通过斑点印迹 附着和光谱位移分析,显示着一个孕妇患有先兆子痫(显示着这个孕妇患有先兆子痫)或 者将会患先兆子痫(如果需要的话可以使用已知的方法进行进一步的检测以确定)。如这 里所描述的,虽然我们称这些异常蛋白质是嗜刚果红性的,这只是一个描述性术语,读者 应该明白这些异常蛋白质可以通过许多其它的手段检测,包括其它试剂,例如其它染料(如 其他自组装染料),硫磺素(硫磺素S,硫磺素T)和抗体(例如多克隆,如A11抗体, Officer抗体,OC抗体,和单克隆,如M118,M204,M205,M89(如M89-17)和M09) 或通过利用例如极化光显微镜、荧光显微镜或电子显微镜观察聚集物。
    通过检测嗜刚果红性检测的异常蛋白质聚集物或片段就是这里描述的异常蛋白聚集 物,他们含有以下成分中的至少一种(一种或更多)SerpinA1、血浆铜蓝蛋白、重链IgG、 轻链IgG、干扰素诱导蛋白6-16以及每个的片段。
    不难理解,这里所有描述的例子中,各种抗体(多克隆或者单克隆)可以被使用。在 特定例子中,可以使用至少一个(一个或多个)下面的抗体或者其等价物(几乎以相同的 方式识别(结合)的抗体),如对相同的表位或构象:A11抗体,Officer抗体,OC抗体, M118抗体,M204抗体,M205抗体,M89抗体(如M89-17)和M09抗体。
    在某些具体实施方案中,诊断或辅助诊断孕妇患先兆子痫的方法包括:(a)从孕妇处 获得尿液样本或者胎盘组织样本;(b)将(a)中获得的样本与一种可以与PE相关的异常 蛋白聚集物或其中组分结合或者标记伴随着PE出现的异常蛋白聚集物或其组分的试剂(例 如一种染料,如刚果红,或者一种抗体)在能够让这种试剂与异常蛋白聚集物结合或发生 相互作用的条件下混合(接触),从而产生可以检测得到的(被标记的)异常蛋白聚集物 或其组分(如可检测的serpina-2或者其他组分)并且(c)确定(a)中是否发生结合或者 其他相互作用,如通过确定可检测的异常蛋白聚集物或组分是否存在于样品中,结合即显 示女性患有先兆子痫,可以将这名女性诊断为患有或者即将患先兆子痫。她的状态(是否 患有先兆子痫)可以通过已知手段(如这里所述的方法)进行进一步检验以确认现在方法 得到的结果。结合或者显示或者标记异常蛋白的试剂可以有多种种类,如一种染料(如刚 果红,硫磺素S,硫磺素T,伊文思蓝,锥虫蓝,ANS,bis-azo ANS),一种放射性追踪物 (如(11)C匹兹堡化合物B(PIB))或者一种抗(结合)异常蛋白聚集物得抗体,如与 异常蛋白聚集物的一个特征区域或者构象特征结合的抗体,或与其中一个或多个组分(一 个或多个SerpinA1、血浆铜蓝蛋白、重链IgG、轻链IgG、干扰素诱导蛋白6-16或者每个 的片段)的一个特征区域或者特征结合的抗体。
    在一个具体的实施方案中,诊断或辅助诊断孕妇患先兆子痫的方法包括:(a)从怀孕 女性处获得尿液样本或者胎盘组织样本;(b)将(a)中获得的样本与一种可以将至少一种 出现在异常蛋白聚集物中的蛋白质或者蛋白质片段染色的染料(如刚果红)混合,在染料 将样本中的蛋白质染色的条件下进行,这样就产生了一个含有染料的尿液样本或者胎盘组 织样本;并且(c)分析(b)中获得的尿液样本或者胎盘组织样本以确定(确认样本是否 含有)伴随着先兆子痫出现的超分子聚集物(异常蛋白质聚集物)的存在和被染料染色, 如果样本含有被染料染色的伴随着先兆子痫产生的超分子聚集物,这个染色显示着女性患 有先兆子痫,这名女性就被诊断为患有或者很可能患先兆子痫。如果样本含有这样被染色 的错误折叠蛋白聚集物,那么她比如果样本中不含有伴随着先兆子痫出现的被染料染色的 异常蛋白聚集物更可能患有先兆子痫。伴随着先兆子痫出现的被染料染色的异常蛋白聚集 物的出现预示着这位女性已经患有或者很可能患有先兆子痫。她的状态(是否患有先兆子 痫)可以通过已知手段(如这里所述的方法)进行进一步检验以确认现在方法得到的结果。 检测到的异常蛋白聚集物就是这里叙述的异常蛋白聚集物,它们至少含有以下成分中的一 个或多个SerpinA1、血浆铜蓝蛋白、重链IgG、轻链IgG、干扰素诱导蛋白6-16以及每个 的片段。染色的异常蛋白聚集物的检测可以通过已知的方法实现,如斑点印迹分析或者仅 仅肉眼观察一个经过染色的支持表面(如滤纸)上的一个区域,此经过染色的支持表面包 含尿液样品(或者胎盘组织样本)和染料混合后的组合物(例如尿液样品和刚果红的混合 物)。
    一个用这里描述的实施方案确定已患、可能患有或者有患先兆子痫风险的孕妇可以通 过进行一项附加检验,如之前描述的方法或为领域里面的人所熟知的一种或多种方法(也 就是,血压测量、水肿评估、腹部疼痛、头痛的发生及视觉问题)进一步评估这种情况或 者确认先兆子痫的出现/风险。
    这里描述的检测尿液中嗜刚果红性异常蛋白聚集物不仅可用于诊断已经存在的先兆子 痫,而且可以预测孕妇将来发生先兆子痫的情况,也可被看做是预测一个孕妇将会患先兆 子痫几率增加。在一个实施方案中,预测或者辅助预测一个孕妇将会患(将发展为)先兆 子痫的方法包括从孕妇处获得一个尿液或者胎盘组织样本及分析尿液或者胎盘组织样本 中与先兆子痫相关的异常蛋白聚集物的存在(确认样本中是否含有),此女性样本含有伴 随先兆子痫出现的异常蛋白聚集物比不含有的更可能得(得的可能性比正常人高)先兆子 痫。读者应该明白:这里描述的PE的发生和/或发生风险的方法包括检测伴随先兆子痫出 现的异常蛋白聚集物的存在/缺乏的方法(对于快速定性分析)和量化样本中检测到的超分 子聚集物的数量和/或其准确性质(也就是,鉴定聚集物中的蛋白质,鉴定聚集物的构象等) 的方法。
    检测到的异常蛋白聚集物可以是这里描述的一种(一种或多种)超分子聚集物,它含 有以下成分中的至少一种(一个或多个):SerpinA1、血浆铜蓝蛋白、重链IgG、轻链IgG、 干扰素诱导蛋白6-16或者这些蛋白每个的片段。预测孕妇是否会发展出先兆子痫的方法可 以通过以下实现,例如(a)从孕妇处获得一个尿液样本或者胎盘组织样本;(b)将尿液样 本或胎盘组织样本与一种可以与伴随着先兆子痫出现的错误折叠蛋白聚集物结合或者相 互作用的试剂在能够让这种试剂与这样的错误折叠蛋白聚集物或其组分结合或者相互作 用的条件下混合,这样产生了含有可以检测得到的(带标记的)异常蛋白聚集物的组合物 或其组分(如可检测到的SerpinA1或其它组分);及(c)确定(b)中的结合或其它相互 作用是否发生,如可以通过确定是否有可以检测到的错误折叠蛋白聚集物或其组分在样本 中存在,如果存在的话,这名孕妇比样本中不存在可检测蛋白聚集物的个体在妊娠过程中 更可能发展成先兆子痫(将要得先兆子痫的可能性更高)。结合或显示或标记异常蛋白的 试剂可以是以下几种类型之一,如一种染料(如刚果红、硫磺素S、硫磺素T、伊文思蓝、 锥虫蓝、ANS、bis-azo ANS),一种放射性示踪剂(如(11)C匹兹堡复合物B(PIB)) 或者一种抗(结合)异常蛋白聚集物的抗体,如可以结合一个特征区域或者特定构象或者 一个或多个聚集物组分的抗体,如一个或多个SerpinA1、血浆铜蓝蛋白、重链IgG、轻链 IgG、干扰素诱导蛋白6-16以及这些蛋白的一个或多个片段。
    在一个具体实施方案中,预测或辅助预测一个孕妇将会患(将会发展)先兆子痫的可 能性的方法包括:(a)从孕妇处获得尿液样本或者胎盘组织样本;(b)将样本与一种可以 把伴随着先兆子痫出现的超分子聚集物中的蛋白质或者蛋白质片段染色的染料(如刚果 红)在能够让染料将样本中的蛋白质染色的条件下混合,从而产生了一个含有染料的样本; 并且(c)分析(b)中获得的尿液样本或者胎盘组织样本以确定(确认样本是否含有)伴 随着先兆子痫出现的被染料染色的超分子聚集物的存在,如果样本含有伴随着先兆子痫产 生的被染料染色的超分子聚集物,那么她比如果样本中不含有伴随着先兆子痫出现的被染 料染色的异常蛋白聚集物更可能发展先兆子痫(将会得的可能性更高)。被染色的聚集物 的检测可以通过使用已知的方法,如斑点印迹分析或者仅仅肉眼观察一个经过染色的支持 表面(如滤纸)上的一个区域,此经过染色的支持表面包含尿液样品(或者胎盘组织样本) 和染料混合后的组合物(例如尿液样品和刚果红的混合物)。
    相似的,一个孕妇将会发展为先兆子痫的风险可通过这里描述的方法进行评估。在一 个实施方案中,确定一个孕妇会患有(将会发展为)先兆子痫的风险的方法包括从孕妇处 获得一个尿液或者胎盘组织样本及分析尿液或者胎盘组织样本中伴随先兆子痫出现的错 误折叠蛋白聚集物的存在(确认样本中是否含有),如果样本含有随先兆子痫出现的错误 折叠蛋白聚集物,此女性比样本中不含随先兆子痫出现的错误折叠蛋白聚集物有更大的风 险。在一个具体的实施方案中,评估和确定一个孕妇将会发展为先兆子痫的风险的方法包 括(a)从孕妇处获得一个尿液样本或者胎盘组织样本;(b)将尿液样本或胎盘组织样本与 一种可以与伴随着先兆子痫出现的错误折叠蛋白聚集物结合或者相互作用的试剂在可以 让试剂与这样的错误折叠蛋白聚集物或其组分结合或者相互作用的条件下混合,这样产生 了可以检测到的(标记的)蛋白聚集物或其组分(如可检测到的Serpin-2或其它组分);及 (c)确定(b)中的结合或其它相互作用是否发生,如可以通过确定是否有可以检测到的 错误折叠蛋白聚集物或其组分在样本中存在,如果存在的话,这名孕妇比样本中不存在可 检测蛋白聚集物的个体有更大的风险会发展为先兆子痫。结合或显示或标记异常蛋白的试 剂可以是以下几种类型之一,如一种染料(如刚果红、硫磺素S、硫磺素T、伊文思蓝、 锥虫蓝、ANS、bis-azo ANS),一种放射性示踪剂(如(11)C匹兹堡复合物B(PIB)) 或者一种抗(结合)异常蛋白聚集物的抗体,如可以结合一个特征区域或者特定构象或者 一个或多个聚集物组分的抗体,如一个或多个SerpinA1、血浆铜蓝蛋白、重链IgG、轻链 IgG、干扰素诱导蛋白6-16以及这些蛋白的一个或多个片段。
    在一个具体的实施方案中,评估或估计一个孕妇将会患有(将会发展为)先兆子痫的 方法包括:(a)从孕妇处获得尿液样本或者胎盘组织样本;(b)将样本与一种可以使随先 兆子痫出现的错误折叠蛋白聚集物中的至少一种蛋白质或者蛋白质片段染色的染料(如刚 果红)在可以让染料将样本中的蛋白质染色的条件下混合,这样就产生了一个含有染料的 样本;并且(c)分析(b)中获得的尿液样本或者胎盘组织样本以确定(确认样本是否含 有)伴随着先兆子痫出现的被染料染色的错误折叠蛋白质聚集物的存在,如果样本含有伴 随着先兆子痫产生的被染料染色的错误折叠蛋白质聚集物,那么这名孕妇比如果样本中不 含有伴随着先兆子痫出现的被染料染色的错误折叠蛋白聚集物有更大的风险发展为先兆 子痫(发展的可能性更高)。被染色的聚集物的检测可以通过使用已知的方法,如斑点印 迹分析或仅仅观察含有与染料结合的尿液或者胎盘组织样本(如尿液与刚果红混合液)的 染色表面的区域(在表面上,如滤纸)实现。
    用刚果红染色的胎盘组织样本也显示了这样的蛋白质聚集物和可检测的染色(如刚果 红染色)的特征性质。胎盘中超分子聚集物的其他标记也可用于诊断或辅助诊断孕妇体内 的先兆子痫;预测或辅助预测一个孕妇将会患有(将会发展为)先兆子痫的可能性;评估 和估计一个孕妇将会患有(将会发展为)先兆子痫的风险。
    在另一个实施方案中,这项方法是诊断或辅助诊断孕妇体内的先兆子痫的方法,也就 是对从孕妇处获得的尿液或胎盘组织中的伴随先兆子痫出现的超分子聚集物的检测(确定 存在与否),这个检测是通过使用可以识别(结合)这里描述的随着先兆子痫已经形成了 独特折叠构象的蛋白质和蛋白质低聚物的抗体或者可以识别(结合)随着先兆子痫出现的 超分子聚集物和/或这样聚集物的一个蛋白质或多肽组分(作为这样的一个聚集物的组分) 的抗体而实现的。这样超分子聚集物的存在预示着(预示着这个孕妇患有)先兆子痫。
    这里也描述了一种诊断受试者(一个孕妇)是否患先兆子痫或预测将来是否可能得先 兆子痫的体外方法,包括检测一个来自于受试者的尿液或胎盘样本中异常/错误折叠蛋白聚 集物(超分子聚集物)的步骤。在一个实施方案中,在一个尿液样本中检测到了超分子聚 集物(异常/错误折叠蛋白聚集物)。在另一个实施方案中,在一个胎盘样本中检测到了异 常/错误折叠蛋白聚集物。在上述任何一个实施方案中,可以通过刚果红染色检测异常蛋白 聚集物,如通过斑点印迹附着和/或光谱位移分析,或者通过硫磺素S染色。在任何一个实 施方案中,异常/错误折叠蛋白聚集物可以含有SerpinA1(alpha-1抗胰蛋白酶)和/或多肽 片段和/或血浆铜蓝蛋白片段和/或重链IgG和/或轻链IgG。
    这里还描述了一种用于治疗和/或防止孕妇患先兆子痫的方法的蛋白质聚合抑制剂。用 于治疗和/或防止孕妇患先兆子痫的方法的蛋白质聚合抑制剂包括1)抑制超分子聚集物重 新形成的蛋白质聚集抑制剂;2)逆转之前就存在的超分子聚集物的蛋白质抑制剂;3)抑 制超分子蛋白聚集物的重新形成并逆转或者拆散之前就存在的超分子蛋白聚集物的蛋白 抑制剂;4)稳定蛋白质原有构象的蛋白聚集物抑制剂,这样也就降低了异常折叠和后续 聚合的速率;5)1)到4)的蛋白聚集抑制剂中可以抑制SerpinA1(alpha-1抗胰蛋白酶) 和/或多肽片段的聚集的;1)到4)中任何一种的蛋白聚集抑制剂,可以抑制SerpinA1(alpha-1 抗胰蛋白酶)和/或多肽片段的聚集,并从以下选出:(a)三甲胺N-氧化物(trimethylamine  N-oxide);(b)三甲胺N-氧化物相关化合物;(c)FLEAIG肽;以及(d)与FLEAIG肽相 关的多肽和衍生物;6)1)到5)中任何一种的多肽抑制剂,并从以下选出:(a)三甲胺 N-氧化物;(b)三甲胺N-氧化物相关化合物;(c)FLEAIG肽;以及(d)与FLEAIG肽相 关的多肽和衍生物;7)1)到5)中任何一种的多肽抑制剂,并且是一种反-β淀粉蛋白试剂; 8)一种7)的多肽抑制剂,而且反-β淀粉蛋白试剂是从以下选取的:p-氨基苯酚,2-氨基-4- 氯苯酚五肽iAβ5(LPFFD)(2-Amino-4-Chlorophenol pentapeptide iAP5)(LPFFD)(Axonyx 公司);Aβ聚集抑制剂PPI-1019(Praecis);氨基多糖(GAG)拟肽NC-531(Neurochem); 抗生素氯碘羟喹(Clioquinol)(Prana生物科技有限公司),小分子环糊精,来自银杏提取 液EGb761的天然产物((Dr.Willman Schwabe GmbH&Co);聚苯酚;SP-233,一种22R- 羟基胆固醇衍生物(Samaritan药业),阿扑吗啡(Apomorphine),和Aβ免疫(Elan制药公 司,Acumen’s ADDL科技)。参见Drug Discovery Today:Therapeutic Strategies 2004Elsevier  Ltd 1(1):7-12。
    这里描述的是一种研究和测试可用于治疗先兆子痫的疗法(即药物)的方法。例如, 药物,包括那些已知的或后续发现的可以降低其他错误折叠紊乱的严重性,都可以被检测。 例如,那些已经评估过对治疗如老年痴呆症、轻链淀粉样变性和阮病毒疾病有效性的药物 可用于评估治疗先兆子痫时的有效性,包括阻止其开始、降低先兆子痫发生的程度或者逆 转已经存在的先兆子痫(即通过阻断、降解或打断随着先兆子痫出现的错误折叠的蛋白聚 集物,降低已经存在的错误折叠蛋白聚集物的负担)。对这些试剂以及那些还没被评估他 们在治疗异常蛋白聚集物类疾病时作用的试剂可以进行检测,以确定其在治疗先兆子痫时 的作用。
    这里还描述了治疗患先兆子痫的孕妇的方法。一种治疗先兆子痫的方法是给予一个孕 妇治疗有效量的药物,例如,可以抑制(部分地或全部地)蛋白聚集物重新形成的药物; 可以逆转(部分地或全部地)已经存在的蛋白聚集物的压力或存在的药物;可以稳定这些 蛋白质原始构象进而降低异常折叠和后续聚集速率的药物;或者药物的组合(多于一种药 物,相同类型的行为,如两种抑制蛋白质聚集物重新形成的药物;多于一种药物,不是相 同类型的行为,如一种抑制蛋白聚集物重新形成的药物和一种降低已经存在的蛋白聚集物 压力的药物)。
    根据进一步的描述,申请人要求以下权利要求:
    1.对怀孕女性是否患有先兆子痫的诊断以及辅助诊断的方法包括:
    (a)从一名女性身上得到样本;并且
    (b)检测样品中存在随着先兆子痫产生(在病理学上是发病因素)的错误折叠蛋白质 超分子聚集物,超分子聚集物出现在样品里的女性患先兆子痫或者将患先兆子痫的几率比 样品中没有出现这种超分子聚集物的女性更高。
    2.对怀孕女性是否患有先兆子痫的诊断以及辅助诊断的方法包括:
    (a)从一名女性身上得到样本;
    (b)将样品与可以标记错误折叠蛋白质超分子聚集物的试剂在合适的标记超分子聚集 物可以发生的条件下混合,这种蛋白质(i)含有serpina-1(alpha-1抗胰蛋白酶)或一个 serpina-1的片段并且(ii)伴随着先兆子痫出现(在病理学上是其发病因素);并且
    (c)确定样品中是否含有超分子聚集物,如果它存在,这名女性患先兆子痫或者将患 先兆子痫的几率比样品中没有出现这种超分子聚集物更高。
    3.权利要求1的方法中超分子聚集物含有serpina-1(alpha-1抗胰蛋白酶)或者一个 serpina-1的片段。
    4.权利要求2或权利要求3的方法中超分子聚集物进一步含有至少以下蛋白之一:血 浆铜蓝蛋白,IgG的重链,IgG的轻链和干扰素诱导蛋白6-16(IFI6)。
    5.权利要求1、3或者4中任意一个的方法中超分子聚集物的存在是通过混合样本和一 种可以以可检测的方式标记超分子聚集物的试剂进行检测的。
    6.权利要求1-5的方法中的样本是尿液样本或者胎盘组织样本。
    7.权利要求1-6中的任何一个方法中的试剂是一种染料、一种抗体或者一种荧光剂标 签。
    8.权利要求7的方法中的染料是一种杂芳香环染料。
    9.权利要求8的方法中的染料是刚果红或者一种硫磺素。
    10.权利要求7-9中任何一个的方法中的超分子聚集物被染料染色而且超分子聚集物 的染色是通过斑点印迹修正和/或光谱位移分析检测的。
    11.孕妇是否患有先兆子痫的诊断性检测中的检测就是确定女性是否存在嗜刚果红性 蛋白尿以及一种含有serpina-1(alpha-1抗胰蛋白酶)或一个serpina-1的片段的嗜刚果红 性蛋白聚集物能否在从孕妇处获得的尿液样本中检测到。
    12.权利要求7的方法中的抗体是一种构象依赖型而氨基酸序列非依赖型抗体。
    13.权利要求12的方法中的构象依赖型抗体识别一个或多个错误折叠蛋白的超分子聚 集物上的一个或多个表位,这些错误蛋白是从下面分子群中选出的:前纤维低聚物、纤维 低聚物、原纤维和淀粉蛋白纤维。
    14.权利要求13的方法中的构象依赖型抗体识别纤维低聚物和/或淀粉蛋白纤维上的一 个或多个表位。
    15.权利要求13的方法中的构象依赖型抗体结合一种原纤维(圆形的)上面的一个或多 个表位。
    16.权利要求13的方法中的构象依赖型抗体结合一种前纤维低聚物上面的一个或多个 表位。
    17.权利要求14的方法中的构象特异性抗体是OC抗体。
    18.权利要求15的方法中的构象特异性抗体是Officer抗体。
    19.权利要求16的方法中的构象特异性抗体是A11抗体。
    20.权利要求15或18的方法中如果原纤维特异性抗体与样本是有免疫反应性的,那么 这名女性已经患有或者即将患细胞溶血症。
    21.一种诊断或者辅助诊断孕妇是否患有先兆子痫的方法包含:
    (a)从孕妇处获得一个尿液样本或者一个胎盘组织样本;
    (b)将样本接触一种可以结合伴随先兆子痫出现的错误折叠蛋白质的超分子聚集物的 构象依赖型抗体,如果抗体结合样本中的一个组分,女性已患先兆子痫或者很可能患先兆 子痫的可能性比如果抗体不结合样本组分的情况要高。
    22.权利要求21的方法中样本的组分是以下几种高分子聚集物之一:一种前纤维低聚 物、一种纤维低聚物、一种原纤维或者一种淀粉蛋白纤维。
    23.权利要求22的方法中的构象依赖型抗体识别纤维低聚物和/或淀粉蛋白纤维上的一 个或多个表位。
    24.权利要求22的方法中的构象依赖型抗体识别原纤维(圆形的)上的一个或多个表 位。
    25.权利要求22的方法中的构象依赖型抗体识别前纤维低聚物上的一个或多个表位。
    26.权利要求23的方法中的构象特异性抗体是OC抗体。
    27.权利要求24的方法中的构象特异性抗体是Officer抗体。
    28.权利要求25的方法中的构象特异性抗体是A11抗体。
    29.权利要求24或27的方法中如果原纤维特异性抗体对样本是有免疫反应性的,那 么这名女性已经患有或者即将患细胞溶血症。
    30.一种确定一个孕妇是否有患先兆子痫风险的方法包含:
    (a)从女性处获得一个样本;
    (b)检测样本中是否存在伴随先兆子痫(病理学上来说是其致病因素)出现的错误折 叠蛋白质的超分子聚集物,如果超分子聚集物存在于样本中,那么这名女性相对于样本中 没有蛋白质聚集物存在有更大的风险会患先兆子痫。
    31.一种确定一个孕妇是否有患先兆子痫风险的方法包含:
    (a)从女性处获得一个样本;
    (b)将样本与一种可以标记错误折叠蛋白质超分子聚集物的试剂在适合标记超分子聚 集物的条件下混合,这种聚集物(i)含有serpina-1(alpha-1抗胰蛋白酶)或一个serpina-1 的片段并且(ii)伴随着先兆子痫出现(在病理学上是其发病因素);并且
    (c)确定样品中是否含有超分子聚集物,如果它存在,这名女性将患先兆子痫的风险 比样品中没有出现蛋白聚集物更高。
    32.权利要求30的方法中的超分子聚集物含有serpina-1(alpha-1抗胰蛋白酶)或者 serpina-1的一段片段。
    33.权利要求31或权利要求32的方法中超分子聚集物进一步含有至少以下蛋白之一: 血浆铜蓝蛋白,IgG的重链,IgG的轻链和干扰素诱导蛋白6-16(IFI6)。
    34.权利要求30、32或者33中任意一个的方法中超分子聚集物的存在是通过混合样本 和一种可以以可检测的方式标记超分子聚集物的试剂进行检测的。
    35.权利要求30-34的方法中的样本是尿液样本或者胎盘组织样本。
    36.权利要求34或35中的任何一个方法中的试剂是一种染料、一种抗体或者一种荧光 剂标签。
    37.权利要求36的方法中的染料是刚果红或者一种硫磺素。
    38.权利要求35-37中任何一个的方法中的超分子聚集物被刚果红染色而且超分子聚 集物的染色是通过斑点印迹固定和/或光谱位移分析检测的。
    39.一种降低孕妇发生先兆子痫程度的方法包括给予女性治疗用有效剂量的对女性体内 发生[形成]蛋白聚集物的一种抑制剂,这种聚集物含有serpina-1(alpha-1抗胰蛋白酶)或 serpina-1的一个片断并伴随着先兆子痫(是其的一个致病因素)出现的,这里的治疗用有 效剂量就是足以抑制(部分地或者全部地)超分子聚集物的形成、打散(部分地或者全部 地)已存在的超分子聚集物或者二者兼有的剂量。
    40.权利要求39的方法中的抑制剂稳定了超分子聚集物至少一个组分的原有构象,从而 降低了异常折叠发生的程度,这样女性体内超分子聚集物形成的程度比抑制剂不存在时降 低了。
    41.权利要求39或40的方法中的抑制剂是一种可以结合蛋白质聚集物的一个组分的抗 体或抗体片段、一种三甲胺N-氧化物、一种抗-beta淀粉蛋白试剂(即p-氨基苯酚,2-氨基 -4-氯苯酚及其衍生物)、一个纤维形成的小分子抑制剂、原纤维形成或低聚物形成;或一 种纤维形成、原纤维形成或低聚物形成的多肽抑制剂。
    42.一种诊断先兆子痫或者预测受试者先兆子痫的未来发展的体外方法包含检测取自所 说的受试者的尿液或胎盘样本中异常蛋白聚集物(错误折叠蛋白质的超分子聚集物)。
    43.权利要求1的方法中的异常蛋白聚集物是在一份尿液样本中检测到的。
    44.权利要求42的方法中的异常蛋白聚集物是在一份胎盘样本中检测到的。
    45.权利要求42-44任何一个的方法中的异常蛋白聚集物都是通过刚果红染色检测的。
    46.权利要求45的方法中的刚果红染色包括斑点印迹固定和光谱位移分析。
    47.权利要求42-44任何一个的方法中的异常蛋白聚集物都是通过硫磺素S或者硫磺素 T染色检测的。
    48.权利要求42-47任何一个的方法中的异常蛋白聚集物包括serpina-1(alpha-1抗胰蛋 白酶)和/或其多肽片段。
    49.权利要求42-48任何一个的方法中的异常蛋白聚集物包括血浆铜蓝蛋白片段和IgG 的重链和轻链。
    50.一种蛋白聚集抑制剂用于治疗和/或预防先兆子痫。
    51.权利要求50的抑制剂可抑制蛋白聚集物的重新形成。
    52.权利要求50或51的抑制剂可以逆转或者拆散已经存在的蛋白聚集物的形成。
    53.权利要求50的抑制剂可以稳定蛋白质原有的构象,从而降低异常折叠和后续聚合的 速率。
    54.权利要求50-53任何一个的抑制剂可抑制serpina-1(alpha-1抗胰蛋白酶)和/或其多 肽碎片的聚合,是从以下选出的:(a)三甲胺N-氧化物;(b)三甲胺N-氧化物相关复合 物;(c)FLEAIG多肽;以及(d)与FLEAIG多肽相关的多肽及其衍生物。
    55.权利要求50-54任何一个的抑制剂,是从以下选出的:(a)三甲胺N-氧化物;(b) 三甲胺N-氧化物相关复合物;(c)FLEAIG多肽;以及(d)与FLEAIG多肽相关的多肽 及其衍生物。
    56.权利要求50-54任何一个的抑制剂都是抗-beta淀粉蛋白试剂。
    57.权利要求56的抑制剂中,抗-beta淀粉蛋白是从p-氨基苯酚和2-氨基-4-氯苯酚中选 出的。
    58.权利要求7的方法中的抗体至少是以下之一(一个或多个):A11抗体、OC抗体、 Officer抗体、M118抗体、M204抗体、M205抗体、M89抗体(即89-17)及M09抗体。
    附图简述
    图1展示了对尿液样品(5μL/点加到硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane)上)进行刚 果红点测试后一个硝酸纤维素膜在洗之前(左边)和洗之后(右边)的情况的一张照片。
    图2展示对一组横向比较的尿液样品(33μL/点加到硝酸纤维素膜上)进行了刚果红点 测试后洗之前和洗之后的情况的一张照片。被方框圈住数字的样本来自于患明显严重先兆 子痫的女性。
    图3对一组纵向比较的尿液样品(33μL/点加到硝酸纤维素膜上)进行了刚果红点测试 后洗之前和洗之后的情况的一张照片。在整个妊娠过程中全程跟踪了六个孕妇,多次抽取 尿液进行分析。被方框圈住的样本来自于临床显示发病时期。对应于样本U348i和U348j 的方框是在由于先兆子痫而进行有医学指征分娩(紧急剖腹产)后取得的样品。
    图4展示刚果红保留率(CRR)的柱状图,根据患有严重先兆子痫(sPE)、慢性高血 压(cHTN)和正?;吃卸哉?CRL)的女性的蛋白总量标准化。
    图5展示了刚果红保留率(CRR)和刚果红整合(CRI)分别与(A)诊断先兆子痫和 (B)预测因先兆子痫而进行强制性分娩的协同系数的ROC曲线(来自于114个不同孕妇 的233个尿液样本)。
    图6展示了尿蛋白的刚果红保留率(CRR)和根据异常蛋白质组学资料(UPSr)确定 的先兆子痫的存在和严重性的相关性图表。
    图7展示了尿蛋白的刚果红保留率(CRR)和比率指标uFP:log[sFlt-1/PIGF×100]相关 性的图表。
    图8展示了通过(A)斑点印迹检测的刚果红亲和性,(B)凝胶过滤或(C)离心来分 离先兆子痫中错误折叠的尿蛋白的方法??蜃〉难纠醋曰加辛俅蚕孕匝现叵日鬃羽?(sPE)的女性。
    图9展示的图表说明了(A)招募的不同病状组(CRL:对照;cHTN:慢性高血压; gHTN:妊娠期高血压;mPE:温和先兆子痫;sPE:严重先兆子痫;spPE:重叠先兆子痫) 的尿蛋白的%刚果红保留率(CRR);(B)不同分娩组的尿蛋白的%刚果红保留(CRR) (IND:有指征分娩);(C)一个准确性图谱,对比(1)尿蛋白的%刚果红保留率(CRR)、 (2)尿液中sFLT/PIGF的比值及(3)P/C比例即尿蛋白/肌酸比例的预测准确性(敏感性 /100-特异性)。
    图10展示了一张用尿液样本(如图所示:尿液、血液、脑脊髓液(CSF)和胎盘裂解 液;PE:先兆子痫;CRL:对照组)点在硝酸纤维素膜上进行蛋白质免疫印迹实验的照片, 用三种多克隆抗体A11、OC和Officer探测。
    图11展示了一张用尿液样本(PE:先兆子痫;CRL:对照组;cHTN:慢性高血压) 点在硝酸纤维素膜上进行蛋白质免疫印迹实验的照片,用多克隆抗体A11进行探测。红色 箭头标出了样品点在膜上的不同行的位置。薄膜与样本格子状列阵及每个被黑圈圈出的样 本位置进行对比。
    图12展示了一张用尿液样本(PE:先兆子痫;CRL:对照组)点在硝酸纤维素膜上进 行蛋白质免疫印迹实验的照片,用多克隆抗体A11(A11,列1)进行探测,在阴性对照(neg., 列2)中舍去了一级A11抗体,以观察是否有二级抗体非特异性结合。
    图13展示了一张用尿液样本(PE:先兆子痫;CRL:对照组)点在硝酸纤维素膜上进 行蛋白质免疫印迹实验的照片,用单克隆抗体(M204,M205,M118,M89-17,M09, M55)和多克隆抗体A11(A11)进行探测,在阴性对照(neg.,列2)中舍去了一级A11 抗体,以观察是否有二级抗体非特异性结合。
    图14展示了一张图,显示在纵向跟踪的一组病人中预测由于先兆子痫导致有指征分娩。
    图15A展示了来自三位女性的胎盘切片,其中两个因为严重先兆子痫进行早产(A-F), 另一个是原发性早产(对照,G-H),切片都用刚果红染色并用白光(A,D,G)或者极化光 (B,C,E,F,H和I)在显微镜下观察。图C和F是图B&E中方框区域的放大(640x)。图I: 使用刚果红以相同条件染色的来自于一个患老年痴呆症病人的大脑切片的极化光图像。
    图15B展示了先兆子痫患者尿液中刚果红阳性沉淀物质的图像。
    图16显示了来自两个患严重先兆子痫女性的尿液样本的双重还原性SDS PAGE电泳。 左图显示了使用考马斯亮兰将所有蛋白染色后的凝胶(列1-4)。右图显示了转移至硝酸纤 维素膜上的蛋白质的SerpinA1的免疫反应性。分子量标签(MW)呈现在每幅图中。
    图17显示了对于抗-APF单克隆抗体09和89的二级筛选结果。
    图18显示了对抗alpha溶血素和ABeta的单克隆抗体09和89分析的结果。
    发明详述
    先兆子痫在妊娠的后半期产生,与大量孕妇和胎儿患病或死亡相关。目前尚无有效的 筛选方法,来诊断或者评估患此病以及与之相连的高血压的风险。因此,怀孕女性无法得 到有效的监控或者治疗,直到疾病引起其他并发症,包括血压升高、尿液出现蛋白等等。 另外,没有患此类疾病风险的女性又要在怀孕全程做不必要的症状检查,因为没有有效的 方法使她们在怀孕早期就从有风险群体中被区分出来。而且,目前的测试方法需要医生的 监督。
    此处描述的方法和组合物用于检测和/或监测先兆子痫相关的嗜刚果红性以及与先兆 子痫相关或引起先兆子痫的错误折叠蛋白聚集物的特异性构型,这对于诊断和治疗先兆子 痫有很大的作用。同时,此处还描述了可以独立用于诊断、治疗先兆子痫的额外生物标记, 与此处描述的方法和用品相关联,这些标记还可以用于进一步确认和评估孕妇先兆子痫的 状态。例如,通过检测错误折叠蛋白聚集物,一名女性被上述方法评判为患有先兆子痫或 可能有高患病风险,她可以通过以先兆子痫相关(有指示作用)的额外生物标记或指示物 为基础的方法被进一步评估。这包括,例如,在孕妇尿液中检测某一特定先兆子痫相关(有 指示作用)生物标记的存在或缺失(例如,丝氨酸蛋白酶抑制剂A1(SerpinA1)和白蛋白), 和/或在尿液中测量某一特定先兆子痫相关(有指示作用)生物标记的比例(如sFlt和PIGF)。 对这些生物标记的评估可以确认或者辅助确认(推翻或辅助推翻)上述方法的评估结果, 即一名怀孕女性是否患有先兆子痫或有患病风险??梢越写死嗥拦赖姆椒ㄔ诖舜τ兴?述,并且参考了如下专利内容(例如,美国专利申请号12/084004;PCT/US2006/042585和 美国专利申请公开号:US-2006-0183175;PCT/US2005/047010,它们的全部内容通过引用的 方式结合到本文中)。
    上面提到的方法可以用于诊断或辅助诊断孕妇是否患有、或有高风险患有下列高血压 异常症:先兆子痫、子痫、轻度先兆子痫、慢性高血压、EPH妊娠中毒症、妊娠高血压、 叠加型先兆子痫(包括与慢性高血压、慢性肾病或狼疮叠加的先兆子痫)、HELLP综合征 (溶血、肝脏酶升高、血小板含量下降)和肾病。
    此处所述方法同样可以用于评判孕妇患有一个特定的高血压并发症的风险,包括先兆 子痫。这些并发症可能包括剖腹产、血浆尿酸升高、收缩压和舒张压升高、验尿棒有蛋白 反应、怀孕次数、生产时胎儿体重异常、胎盘破裂、IUGR、溶血、血小板减少症、肝脏酶 升高和HELLP综合征(溶血、肝脏酶升高、血小板含量下降)。
    1、刚果红测试/嗜刚果红性以诊断先兆子痫
    蛋白质的不稳定、错误折叠和聚集成对自组装染料刚果红具有亲和性(嗜刚果红性) 的超分子结构,这是数目正在增加的一系列逐步发展的人类疾病的共同特征,比如阿尔茨 海默病、帕金森症和阮病毒病。对偶氮染料刚果红(CR)的亲和性被用于检测这类蛋白错 误折叠引起的疾病中异常类淀粉蛋白聚集。申请人做出了新的出人意料的发现:先兆子痫 是与蛋白错误折叠和蛋白聚集相关的孕妇特有的疾病。他们证明,先兆子痫带有超分子类 淀粉蛋白聚集和嗜刚果红性尿蛋白的特征,说明错误折叠蛋白的分泌增加。申请人推测, 尿液中先兆子痫相关的嗜刚果红性提供了一种先兆子痫的诊断和/或预后诊断测试,其方法 为测量中球蛋白错误折叠的程度。
    与先兆子痫相关的错误折叠蛋白可以在“超分子错误折叠蛋白聚集物”中发现。在本文 中,“超分子错误折叠蛋白聚集物”这一术语(此处也指“超分子聚集物”、“异常蛋白聚集物”、 “超分子类淀粉蛋白聚集”和“刚果红蛋白聚集物”)指可溶的蛋白聚集物和不可溶的蛋白聚 集物。这些包括:(1)纤维前体寡聚物(同时只“类淀粉蛋白前体寡聚物”和“非纤维错误折 叠蛋白聚集物”),可溶并且具有“淀粉样”性质;(2)原纤维;(3)纤维寡聚物,可溶;以 及(4)类淀粉蛋白纤维,不可溶。
    从先兆子痫患者、可能患有先兆子痫的患者和有患先兆子痫风险的孕妇处获得的样本, 例如尿样,可能含有相对少量或没有不可溶类淀粉纤维,但是可能含有一种或几种可溶超 分子蛋白聚集物的混合物,例如纤维前体寡聚物、纤维寡聚物,和/或原纤维。
    在一些实施方案中,用于诊断先兆子痫的方法包括检测样本中的超分子蛋白聚集物。 超分子聚集物可以利用,例如,杂芳香环和/或纤维特异性染料来检测。在一些实施方案中, 检测样本中(例如尿样中)超分子聚集物,可以通过利用这些超分子聚集物与普通蛋白相 比,能够增加/增强芳香杂环染料的荧光(或导致光谱移动)的性质来检测,这些染料包括 例如硫磺素(thioflavin)(硫磺素T,ThT或硫磺素S,ThS)和刚果红(CR)。在一些实 施方案中,诊断先兆子痫的方法包括检测可溶超分子聚集物,例如使用杂芳香环和/或纤维 特异性染料检测样本中纤维前体寡聚物。我们不希望被某一种特定理论限制,但是我们认 为在向可溶超分子聚集物加入杂芳香环和/或纤维特异性染料可以促进不可溶超分子聚集 物的形成和沉淀,例如纤维前体聚集物和/或纤维聚集物,使得这些聚集物变得容易检测得 到。
    这里提供的是诊断或辅助诊断先兆子痫的方法。在一些实施方案中,检测尿液嗜刚果 红性(如利用斑点印迹固定法或者光谱移动分析)对于孕妇是否患先兆子痫有指示作用。 在一些实施方案中,用上述方法检测出尿液中的嗜刚果红性蛋白聚集物,不只是对已经患 有的先兆子痫的诊断证据,同时也可以预测孕妇未来是否可能得先兆子痫。在一些实施方 案中,胎盘组织中被刚果红染色的嗜刚果红性蛋白聚集物可以用于诊断先兆子痫。需要明 白的是,蛋白聚集物可以用很多种其他方法和试剂检测。这些都是普通技术范畴之内,并 且需要过度的实验,这些是本发明的一部分,并且包含在此。
    除了诸如刚果红和硫磺素等染料以外,其它试剂(包括刚果红和硫磺素的衍生物)也可以 用于检测此处描述的超分子蛋白聚集物。这些检测试剂包括,但不局限于:姜黄素类似物 (J.Am.Chem Soc.131:15257(2009);X-34 (1,4-bis(3-carboxy-4-hydroxyphenylethenyl)-benzene),一种高荧光的刚果红(Ikonomovic等 人,Methods in Enzymology 412(2006),“Amyloid,Prions and other protein aggregates”,Part B  pp:123-144)和J.Histochem and Cytochem 48:1223(2000);硫磺素S;硫磺素T;尼罗红; 吖啶橙;氨基-8-萘磺酸盐(ANS)和Bis-ANS;4-二氰乙烯久洛尼定(DCVJ)(Biophysical  Journal 94(12):4867-4879,2008);AO1987(恶嗪染料)(Nature Biotechnology 23(5)577 (2005));荧光苯乙烯染料(Angewandte Chemie,Internnational Edition 43(46)6331-6335 (2004));BF-168:(6-2-氟乙氧基)-2-[2-(4-甲基氨基苯酚)乙烯基]苯并恶唑(J.Neuroscience 24(10),2535(2004));BSB:(反,反)-1-溴-2,5-二-(3-羟基羰基-4-羟基)苯乙烯基苯(Lab. Investigation 83(12)1751(2003));喹啉腙化合物(如,4-甲基-7-甲氧基-2-(4-喹啉基亚甲 基联氨)喹啉)(WO2002/024652,Thomas Raub et.al.,Chrisamin G et al.Chrysamine-G,a  lipophilic analogue of Congo red,inhibits A beta-induced toxicity in PC12cells.Life Sci. 1998;63(20):1807-14);利福平(Tomiyama T et al.J Biol Chem.1996;271:6839-6844);褪黑 素(Pappolla Met al.J Biol Chem.1998;273:7185-7188);黄芩素(Zhu M et al.The flavoid  baicalein inhibits fibrillation of alpha-synuclein and disaggregates existing fibrils.J Biol Chem. 2004Jun 25;279(26):26846-57);鲨肌醇(青蟹肌醇,1,3,5/2,4,6-六羟基环己烷(Cocositol, Quercinitol,1,3,5/2,4,6-Hexahydroxycyclohexane))及其衍生物(Sun et al.Synthesis of  scyllo-inositol derivatives and their effects on amyloid beta peptide aggregation.Bioorg Med  Chem.2008Aug 1;16(15):7177-84);成像探针,如[11C]-PIB:N-甲基[11C]2-(4’-甲基氨基 苯酚-6-羟基苯并三唑)(Brain 130:2607(2007));均二苯乙烯基苯并三唑和其衍生物 (Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18:1534(2008))以及其它例如FEBS letters 583:2593(2009)中描述的例子的试剂。
    在一些实施方案中,提供了非侵入性和快速尿液诊断方法。在一些实施方案中,这些 诊断方法以刚果红亲和性为基础。在一些实施方案中,先兆子痫患者蛋白错误折叠总程度 可以通过简单的诊断测试判断(尿液刚果红保留值(CRR))。CRR测试也可以被用于预测 IND,一个重要的早产原因。
    此处描述的方法和组合物使得人们可以通过检测和/或监控嗜刚果红性来评判和/或监 控孕妇患有高血压症的风险,例如刚果红保留值。需要明白的是,其他可以与蛋白聚集物 反应/结合的染料,以及/或具有刚果红类似化学性质的染料也可以被用于上述方法。本发 明不局限于使用刚果红。
    在一些实施方案中,诊断方法包括从怀孕女性处得到蛋白样本,并且测试蛋白样本的 嗜刚果红性。在一些实施方案中,嗜刚果红性的检测是通过将尿样与刚果红染料接触充足 的时间,使刚果红结合(CRI),随后使用洗涤溶液洗涤样本。洗涤后,样本刚果红保留值 (CRR)显示该孕妇是否患有先兆子痫或有患先兆子痫的风险。作为刚果红结合值的参考, 可以引入阳性和阴性对照,例如,从已经确诊先兆子痫患者处获得的样本,和正常血压人 群处获得的样本。结合步骤和/或洗涤步骤可以通过加入阳性和阴性对照得到对比。阳性样 本在洗涤后仍保留刚果红染色(CRR阳性)则说明染色充分,阴性样本在洗涤后不含刚果 红表明洗涤充分(CRR阴性)。在一些实施方案中,CRR可以不用可视仪器即可观察,例 如,通过诸如刚果红亲和斑点印迹、凝胶过滤、和离心以及水洗沉淀了的结合刚果红的蛋 白等分离方法(见图8)。在一些实施方案中,分离步骤可以在一个容器或试管中进行,例 如FalconTM或EppendorfTM管,染料结合和洗涤可以在这个容器或试管中进行,随后进行 离心以将结合了蛋白的染料和未结合蛋白染料分离(例如,沉淀),随后可以选做额外的 洗涤步骤。在一些实施方案中,样本可以被点在具有蛋白亲和性的膜上,例如硝酸纤维素 膜,染色和洗涤步骤可以在膜上进行(例如,斑点印迹)。此类测试只需要有限或者不需 要经过训练的医生的监督,例如由训练过的技术员,或者在一些情况下由病人完成,不需 要指导和/或实验仪器(例如使用一个含有必要试剂和说明书的试剂盒)。
    申请人发现,尽管一组怀孕女性尿样里的蛋白浓度相差很远,尿液中蛋白水平通常足 以测量嗜好刚果红性,而不需要将样本浓缩。这使得人们可以设计对实验室仪器没有特殊 要求、或只要求基本仪器的简单分析检测。
    在一些实施方案中,刚果红结合值百分比(%CRI)可以通过比如使用光密度测量(OD, 光密度测量仪),与阴性对照相比较,再乘以100,来测定。洗涤后的刚果红保留值百分 比(%CRR)也可以使用光密度测量(OD),将结果与阴性对照相比较,再乘以100。样 本的CRR值即可通过与相应阴性对照值相比得到。洗涤充分的标志是阴性对照中没有可 见的残余刚果红,OD的平均值应该为0(如果使用了多个对照)。
    在一些实施方案中,刚果红保留值(CRR)和刚果红结合值(CRI)系数可以被计算出 来,CRR>20%的样本可以被“称作”红斑点试验阳性,而CRR<15%者为阴性。
    在一些实施方案中,使用此处所述的诊断方法在尿液中检测出嗜刚果红性尿蛋白,可 以在临床表征出现前8至10周检测出孕妇患有重度先兆子痫。在一些实施方案中,尿嗜 刚果红性的鉴定(通过斑点杂交固定和/或光谱漂移实验)对于患者是否患有先兆子痫有指 示作用,并且提供了一种先兆子痫的诊断方法。在一些实施方案中,由上述方法检测到的 尿液嗜刚果红性蛋白聚集物不只可以用于诊断现存的先兆子痫症,还可以预测未来发展为 先兆子痫症的可能性。
    在一些实施方案中,尿样在收集后(例如,在斑点印迹、验尿棒上或者其他类似物品 上)可以立即被分析,或等待一段时间。例如,尿样可以在-70摄氏度下冰冻,和/或收集 在管中或容器中,干燥后在-20摄氏度或者4摄氏度保存。样本的干燥可以使用真空离心 (例如,SpeedVac),干燥后的样本可以储存更久,并且降低0摄氏度以上分析时变质的风 险(例如,蛋白变性)。需要注意的是,通过干燥来浓缩样本通常是不必要的,但是样本 可以由于上述或其他原因被干燥。
    2.用构象特异性的蛋白质聚集物抗体诊断先兆子痫
    申请人意外地发现先兆子痫是一种蛋白质构象疾病,这种疾病与蛋白质错误折叠和聚 集有关,它的一个很重要的特点是淀粉样蛋白的聚集。
    这里我们详细列出诊断先兆子痫的一些方法,这些方法利用特异性的抗体,识别怀孕 期女性尿液中某种先兆子痫特征性的蛋白质聚集物,从而诊断出这种疾病。
    这里描述的方法是用多克隆或单克隆抗体检测与蛋白质聚集类疾病如先兆子痫有关的 蛋白质构象,其中主要有:(i)检测一种前纤维状的可溶性寡聚体构象,例如本专利用到的 “A11”抗体等;(ii)检测一种环状的原纤维构象,例如本专利用到的“Officer”抗体等;(iii) 检测一种细纤维状构象,例如本专利用到的“OC”抗体等。
    在本说明书中,“错误折叠蛋白质超分子聚集物”(也被称为“超分子聚集物”、“异常蛋 白质聚集物”、“超分子淀粉样聚集物”或者“亲刚果红蛋白质聚集物”)指的是可溶性的和非 可溶性的蛋白质聚集物。这些聚集物包括:(1)前纤维状寡聚体(也称为“前淀粉样寡聚体” 或者“非纤维错误蛋白聚集物”),这种聚集物可溶并且具有“淀粉样”的特征;(2)原纤维状 聚集物;(3)纤维状寡聚体,这种聚集物也是可溶的;(4)淀粉样纤维,这种聚集物不可 溶。
    这些超分子聚集物中,每一种都能够被特异性的抗体识别,例如本说明书中提到的构 象依赖性-序列非依赖性抗体。
    本说明书中提到的具有“淀粉样”特征的蛋白质聚集物具有某些共同的化学、物理、生 物学特征,都含有淀粉样纤维,但是在其他化学、物理、生物学特征上可能有所不同,例 如对于某些淀粉样蛋白质聚集物,它们的结构可能有所不同。
    在某些实施方案中,前纤维状寡聚体会出现在先兆子痫病人的尿液中。在某些实施方 案中,这种前纤维状寡聚体在样本中的出现,例如在尿液中,能够被构象依赖性-氨基酸序 列非依赖性的抗体所识别。在某些实施方案中,A11抗体可以起到这种作用。
    在某些实施方案中,原纤维会出现在样品中,例如先兆子痫病人的尿液中。在某些情 况下,这些原纤维在样本的出现,例如在尿液中,能够被构象依赖性-氨基酸序列非依赖性 抗体所识别。在某些实施方案中,Officer抗体可以起到这种作用。
    在某些实施方案中,纤维状寡聚体或者淀粉样纤维会出现在样品中,例如先兆子痫病 人的尿液中。在某些情况下,这些纤维状寡聚体或者淀粉样纤维在样本的出现,例如在尿 液中,能够被构象依赖性-氨基酸序列非依赖性抗体所识别。在某些情况下,OC抗体可以 起到这种作用。
    这种构象依赖性-氨基酸序列非依赖性识别超分子聚集物的抗体可以利用动物,例如用 小鼠或者兔子,采用含有前纤维聚集物(寡聚体)、纤维状聚集物(寡聚体)、具有“淀粉样” 性质并且可能形成这种前纤维聚集物的多肽原纤维或者纤维、纤维状聚集物、原纤维或者 淀粉样纤维等来制备。现在已知一些具有“淀粉样”特征的多肽,例如Aβ(1-40)、Aβ(1-42)、 多聚谷氨酰胺(PolyGln)分子NH2-KKQ42KK-COOH等,这些例子在Example 4,Kayed  etal.Mol Neurodegener.2007;2:18;Hrncic et al.Am J Pathol.2000;157:1239-1246; O’Nuallain B et al.Proc Natl Acad Sci USA.2002;99:1485-1490中有详细的描述。
    制备抗体用的动物可以用一群形态单纯的纤维来免疫,例如产生构象依赖性-氨基酸序 列非依赖性的特异性识别纤维或纤维状聚集物的抗体。这样产生的抗体中,一些可能专门 识别纤维或纤维状聚集物,而并不识别(不交叉反应)随机的螺旋状单体、前纤维寡聚体 或者正常折叠的前体蛋白。
    另一种方法是用无定形的前纤维聚集物来免疫动物制备抗体,例如产生构象依赖性-氨 基酸序列非依赖性的特异性识别前纤维聚集物的抗体。这样产生的抗体中,一些可能专门 识别前纤维状聚集物,而并不识别(不交叉反应)纤维状寡聚体、淀粉样纤维、单体或者 正常折叠的前体蛋白。
    另一种方法是用原纤维来免疫动物制备抗体,例如产生构象依赖性-氨基酸序列非依赖 性的特异性识别环形原纤维的抗体。这样产生的抗体中,一些可能专门识别原纤维,而并 不识别(不交叉反应)前纤维寡聚体、纤维状寡聚体、淀粉样纤维、单体或者正常折叠的 前体蛋白。
    申请人已经说明,检测与先兆子痫相关的异常蛋白质构象(超分子聚集物)的特异性 能够随着二级抗体被人IgG预先吸附以减少非特异性结合而显著增加。这一结论的部分根 据是申请人发现与先兆子痫相关的蛋白质超分子聚集物中包含人类免疫球蛋白或其片段。 未提前吸附的二级抗体的交联反应会导致二级抗体的非特异性结合。在某些实施方案中, 提供检测尿液中与先兆子痫相关的异常蛋白质构象的方法,这些方法包括获取已经患有、 被怀疑患有、或者有高风险产生先兆子痫的怀孕期女性的尿液样本,将尿液样本与特异性 识别蛋白质聚集类疾病相关构象的一级抗体(单克隆或者多克隆)在适合结合的条件下接 触,使错误折叠的蛋白质与抗体结合,成为一个组合物,再将这个结合体与预先吸附过人 IgG以降低非特异性结合的二级抗体接触,并检测尿液中是否存在错误折叠蛋白与抗体的 复合体,这种复合体的出现即代表了先兆子痫可能发生。
    在一些实施方案中,蛋白质聚集物按照上文的方法与A11一级抗体接触,并接着与预 先吸附过的二级抗体接触。这样,检测的A11阳性程度即代表了先兆子痫综合症的严重性。
    应当明白的是,只要能够足够地与人IgG预先吸附以防止非特异性结合,任何能够检 测一级抗体的二级抗体都可以被采用。从这个层面上讲,这一发明并不局限二级抗体。二 级抗体可以连接任何用于检测的标记,其中包括但不限于放射性同位素标记、酶标记、非 放射性同位素标记、荧光标记、毒素标记、亲和标记、化学发光标记或者核磁共振对比度 试剂等。另外需要注意的是,随着目的的不同,检测系统可以很方便地变化,例如采用多 种标签的高通量/自动化筛选或者其他检测方法,从这个层面上讲,这一发明并没有局限性。 也应当明白的是,这里提到的抗体只是作为例子,也可以用这里提到的或者其他已知的方 法产生更多的抗体。除了这里提到的之外的其他抗体,包括但不限于全抗体、单克隆抗体、 多克隆抗体、嵌合抗体、人抗体、灵长类动物抗体、多特异性抗体、单链抗体、表位结合 抗体、含有VL或VH结构域的抗体等,例如识别蛋白质聚集物的、识别错误折叠或异常 蛋白质构象的、识别特定蛋白质(那些本专利提到的生物标记蛋白)片段的抗体等,也构 成了这一发明的一部分。
    在一些实施方案中,本发明提供了识别蛋白质聚集体、错误折叠或者异常的蛋白质构 象的单克隆抗体。在某些实施方案中,提供与A11抗体使用相同抗原制备的抗体(Science 300:486-489,2003),这些抗体优先识别不同种类的前纤维蛋白寡聚体构象。在某些实施方 案中,提供#204、#205和#89单克隆抗体,这些抗体表现出能够免疫识别蛋白质聚集体, 能够识别先兆子痫病人尿液中这些蛋白质聚集体,并且在对照组尿液中检测不出此类蛋白 质聚集体的存在。在某些实施方案中,能够识别前纤维蛋白寡聚体的不同的构象的单克隆 抗体例如#204、#205和#89单克隆抗体,可以用来诊断先兆子痫。
    这里提到的尿液中的蛋白质聚集物不仅仅可以用于诊断已经发生的先兆子痫,也可以 预测这种疾病未来的发生。除了检测尿液中出现的蛋白质聚集物之外,胎盘组织样本也可 以出现这种蛋白质聚集物的特征。用选择性抗体检测胎盘中异常折叠的蛋白质和蛋白质聚 集体的方法同样也可以用于诊断先兆子痫。在某些实施方案中,与蛋白质寡聚体结合的抗 体可能具有治疗的作用,如(i)破坏蛋白质寡聚体/聚集物;(ii)阻止蛋白质寡聚体/聚集物 的进一步生长;(iii)稳定已有的蛋白质寡聚体/聚集物,防止其转化为更易致病的构象;(iv) 将蛋白质寡聚体/聚集物从致病构象转化为非致病构象。
    这样的治疗方法已经用于治疗老年痴呆症,例如使用抗β-淀粉样蛋白的抗体等。申请 人发现,先兆子痫是一种与异常蛋白质寡聚体积累有关的疾病。在一些实施方案中,对异 常折叠的蛋白质的独特构象具有亲和性的抗体,如本专利提到的#204、#205和#89-17单克 隆抗体或类似的抗体,可以用于治疗先兆子痫。
    申请人发现,先兆子痫病人尿液中出现的蛋白质聚集物,其中包括一种或多种免疫球 蛋白的重链和轻链、血浆铜蓝蛋白和interferon-inducible protein 6-16(IFI-6)蛋白,也同样 对于检测、预防、治疗这种疾病有意义。在一些实施方案中,提供了对于先兆子痫的诊断 和预后方法,这些方法包括对于先兆子痫病人胎盘或者尿液中的蛋白质聚集体中蛋白质的 定量分析,相应的蛋白质包括免疫球蛋白重链和轻链、血浆铜蓝蛋白和IFI-6蛋白。在一 些实施方案中,对于蛋白质的定量分析包括测量相对于某个标准的蛋白质浓度,例如某个 血压正常的个体的样本。在一些实施方案中,使用特异性识别免疫球蛋白重链和轻链、血 浆铜蓝蛋白或者IFI-6的抗体。
    在一些实施方案中,提供特异性识别存在于先兆子痫病人或者高危个体尿液样本中的 错误折叠蛋白质聚集体的构象表位的抗体,用于检测先兆子痫的发生。这里提供的抗体包 括单克隆抗体和多克隆抗体,也包括抗体片段以及包含相关抗原识别结构域的抗体衍生 物?!翱固濉闭飧龃适侵负兄辽僖桓隹乖岷嫌虻拿庖咔虻鞍追肿踊蚱渌肿?。这里用到 的“抗体”一词包括全抗体(如IgG,IgA,IgE,IgM或IgD),单克隆抗体,多克隆抗体, 嵌合抗体,人性化抗体,灵长类动物抗体,多特异性抗体,单链抗体,表位结合片段如Fab、 Fab’和F(ab’)2,Fd,Fvs,单链Fvs(scFv),硫交联Fvs(sdFv),含有VL或VH结构域 的片段,以及完全合成或者重组的抗体。
    本发明中的免疫球蛋白或者抗体分子可以是任何种类(如IgG,IgE,IgM,IgD,IgA 和IgY),类型(如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2)或者亚型的免疫球蛋白分子。
    在一些实施方案中,提供多克隆抗体,例如“Office”,“OC”和“A11”多克隆抗体。单克 隆抗体和多克隆抗体可以通过用免疫原的不同表位来免疫的方法从活体中取得,例如用寡 聚蛋白聚集物(前纤维状和纤维状)、原纤维聚集物或者含有淀粉样纤维的聚集物进行免 疫。这些聚集物在构象上可以是均一的,也可以是不均一的/无定形的。
    抗血浆可以从一系列动物中通过一次或多次注射一种抗原得到,也可以选择性加入非 特异性免疫增强剂,例如佐剂等。对于许多小分子或者半抗原来说,可能需要与一种载体 蛋白通过某种偶联试剂相连,这种载体蛋白可能会被辅助性T细胞识别来起到帮助的作用。 均一或者不均一/无定形的寡聚蛋白质聚集体(前纤维状或者纤维状)、原纤维聚集体或者 含有淀粉样纤维的聚集物可以与某种佐剂共同使用,例如不完全福氏佐剂。
    在一次或多次免疫之后,产生的抗体中主要可能为对表位有亲和性的IgG。多克隆抗 体能够提供多种特异性。多克隆抗体的特异性可以通过用纯化的抗原进行亲和层析的方法 来提高。
    在一些实施方案中,提供单克隆抗体,例如“M204”“M205”和“M89”单克隆抗体。这些 和其他识别类似抗原的单克隆抗体能够用于本专利中描述的方法,如诊断或者协助诊断先 兆子痫;预测或者协助预测怀孕女性患先兆子痫的可能性;以及确定或者协助确定一名怀 孕期女性是否有发展为先兆子痫的危险。
    例如,单克隆抗体89对于怀孕期女性的尿液的免疫反应程度能够表明HELLP综合症 的风险和严重程度,HELLP是严重先兆子痫的一种非典型形式,其特征有溶血、肝脏酶类 水平升高和血小板水平偏低。在HELLP综合症中,早期的诊断非常重要,因为这种病症 的致死率高达25%。已经制备了抗α原纤维(alpha protofibrils)的单克隆抗体,这种抗体 能够与溶血素形成的原纤维反应,这些聚集物是由细菌产生的外毒素形成的,在体外实验 中能够引起红细胞裂解。本专利申请中提供的结果(例如图13)支持了使用单克隆抗体 89对单克隆抗体204,205或者多克隆抗体A11的相对免疫反应强度来确定HELLP综合 症的风险和急需治疗的程度。同时,也描述了确定或者协助确定怀孕期女性患HELLP综 合症的风险和急需治疗的程度的方法。这种方法包括评估一个样本中(例如尿液或胎盘组 织)单克隆抗体89的免疫反应强度与单克隆抗体204、205以及多克隆抗体A11中至少一 个的反应强度之比。这种反应强度之比与未患先兆子痫的对照组怀孕期女性的不同能够判 断或者协助判断怀孕期女性患HELLP综合症的可能性。
    单克隆抗体可以通过免疫动物,如小鼠和大鼠来取得??梢源颖幻庖叩亩锷砩戏掷?出B细胞,例如从胰腺中取得。分离出来的B细胞能够和其他细胞融合,例如与骨髓癌细 胞系融合,来产生杂交瘤细胞,这种细胞能够无限地培养在离体环境中。这些杂交瘤细胞 能够通过稀释来分离(单细胞克隆)并培养成不同的集落。这些集落可以被用来筛选产生 某种特殊亲和性和特异性的抗体的单个集落。筛选出的杂交瘤细胞能够培养在培养液中, 产生的抗体能够从培养液中分离出来。杂交瘤细胞也能够被注射入动物体内,例如小鼠, 来产生活体肿瘤(例如腹膜瘤),从而产生抗体,这些抗体能够从腹水中收集。血浆的促 使细胞裂解的作用能够被选择性地失活,例如用加热的方法。
    能够用于制备抗体的包括某些特定的蛋白、多肽、半抗原、化学性化合物和蛋白质聚 集体,例如均一性和不均一性/无定形的寡聚聚集体(前纤维状和纤维状),原纤维聚集物 或者含有淀粉样纤维的聚集物。了解这一方法的人士会发现,用于免疫的多肽的量会随着 许多因素的不同而变化,例如用于免疫的动物、所选择的多肽的抗原性以及注射的部位。 作为免疫原的多肽(如聚集物)可以经过适当的修饰,或者与佐剂共同使用以增加多肽的 抗原性。在某些情况下,多肽(聚集物),肽链,半抗原和小分子可以与载体蛋白共轭连 接以激发免疫反应。均一性或者非均一性/无定形寡聚聚集物(前纤维,纤维),原纤维聚 集物或者含有淀粉样纤维的聚集物可以与佐剂共同使用,例如不完全福氏佐剂。
    能够用于提高抗原性的方法已经很清楚,包括例如将抗原与某异源性蛋白(如球蛋白 或者β-半乳糖苷酶)相连接,或者在免疫时加入一种佐剂。
    滴定确定抗体用量时可以采用例如抗原特异性ELISA,蛋白质印迹分析,或者放射免 疫反应等方法来测定。一般采用一只或多只动物产生抗体。这里提供的抗体或者免疫特异 性片段可能来自以下任何一种动物:包括兔,绵羊,山羊,鸡,小鼠,大鼠,仓鼠,天竺 鼠,驴,骆驼,或者马。
    在一次或多次注射抗原之后,每次注射后7-10天以后,可以取动物血浆来确定特定抗 体的产生量(滴定)。这种测试可以是对于抗原本身,例如用ELISA方法检测??固蹇梢?储存在许多不同的缓冲溶液中,例如在中性pH值的0.01M、pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS) 中,还可以选择性地加入0.1%叠氮化钠以抑制微生物生长。对于长期储存,抗体可以保存 在低温下,例如4℃、-20℃或者-70℃??固蹇梢员4嬖诖笥?.5mg/mL的浓度下,也可 以加入一种载体蛋白(如1%牛血浆白蛋白),或者在需要冷冻时加入50%甘油。
    制备抗体的方法,包括准备抗原,免疫动物和收集抗血浆的方法可以在以下参考文献 中找到:Antibodies:A Laboratory Manual,E.Harlow and D.Lane,ed.,Cold Spring Harbor  Laboratory(Cold Spring Harbor,NY,1988)pp.55-120和A.M.Campbell,Monoclonal  Antibody Technology;Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,Elsevier  Science Publishers,Amsterdam,The Netherlands(1984).
    这里采用的名词“抗体片段”包括任何含有一个表现出抗原结合功能的抗原结合域的抗 体??固蹇梢杂么臣际醣涑善?。例如,用胃蛋白酶处理抗体可以产生F(ab’)2片段。 产生的F(ab’)2片段能够处理使二硫键减少,来产生Fab’片段。木瓜蛋白酶消化可以形成 Fab片段。重组技术或者化学合成可以用来产生Fab,Fab’,F(ab’)2,scFv,Fv,dsFv,Fd,dAbs, TandAbs,ds-scFv,dimers,minibodies,diabodies,双特异性抗体片段和其他抗体片段。这种产 生抗体片段的方法已经有了详细的描述??固迤?,包括单链抗体,可能仅包含可变区域, 也可以含有以下几个区域全体或部分组合:铰链区域,CH1,CH2和CH3结构域。
    在一些实施方案中,抗体或抗体片段含有一个抗体轻链可变区域(VL)和一个通常包 含抗原结合位点的抗体重链可变区域(VH)。在某些情况下,抗体或抗体片段含有全部或 部分重链恒定区,如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1,IgA2,IgE,IgM或者IgD恒定区。在某 些情况下,重链恒定区是IgG1重链恒定区的全部或部分??固寤蛘呖固迤我部赡芎?全部或部分kappa轻链恒定区,或者lambda轻链恒定区。在某些情况下,轻链恒定区是一 个lambda轻链恒定区,或者是它的一部分。这些恒定区的全部或部分可以自然产生,也可 以部分或者全部合成。这些恒定区的序列已经有了详细的报道。
    这里用到的名词“重链部分”包括来自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。含有重链部分的 多肽至少含有以下部分之一:CH1结构域,铰链结构域(高级、中级或者低级铰链结构域), CH2结构域,CH3结构域,或者它们的片段及衍生物。例如,在本专利中用到结合用的多 肽链可能含有一个CH1结构域;或者含有一个CH1结构域,至少部分铰链结构域,和一 个CH2结构域;或者含有一个CH1结构域和一个CH3结构域;或者含有一个CH1结构 域,至少一部分铰链结构域,一个CH2结构域,以及一个CH3结构域。在其它一些实施 方案中,本专利中的多肽链含有一个CH3结构域。进一步地,这里用到的多肽链可能缺少 至少一部分的CH2结构域(如全部或部分的CH2结构域)。根据基本的知识可以理解,这 些结构域(如重链部分)可以经过修饰,使其与天然的免疫球蛋白的氨基酸序列不同。
    这里用到的名词“轻链部分”包含天然免疫球蛋白轻链衍生出的氨基酸序列。一般,轻 链部分含有至少一个VL或者CL结构域。
    在一些实施方案中,抗体或者抗原结合片段是哺乳动物抗体或者抗原结合片段,例如 小鼠、大鼠、兔、人的抗体或者抗原结合片段。
    在一些实施方案中,所用的抗体为人抗体。这里用于描述抗体的“人”是指抗体或片段 含有来源于或者与人一致的(例如来源于人的生殖细胞或者体细胞)可变(如VH,VL, CDR或FR区域)或恒定区域或两者兼具。
    在一些实施方案中,人性化抗体或人抗体可以用于人类治疗中,例如治疗或者防止先 兆子痫。在这些抗体中,效应部分可能是来自于人,所以抗体可以更好的与人体免疫系统 的其他部分相互作用,即抗体不会被机体识别为异源物质。在某些情况下,这些抗体与天 热存在的人类抗体有同样的半衰期。
    在一些实施方案中,人抗体可能含有一个或者多个并非天然存在的人类核苷酸编码的 序列,这些序列是人工改造过或者加入的,以修饰抗体的序列。
    重组技术在产生大量抗体、抗体片段和单链抗体时被优先采用。一般地,重组产生抗 体、抗体片段或者衍生物采用杂交瘤细胞中分离出来的编码所需抗体的mRNA。这个 mRNA被用于产生编码抗体或者一个片段的cDNA分子。一旦得到,这个cDNA可以依据 方法的不同在真核和原核宿主中被扩增和表达。
    在一些实施方案中,提供抗体的衍生物。这里用到的“抗体衍生物”一词包含抗体本身 或者一个片段,也可能包含多余的结构部分。这些部分可能会增加抗体的水溶性、吸收性、 生物半衰期等等,在活体或者试管中降低抗体毒性,去除或者减弱抗体在活体中不良的副 作用,或者作为一个可以检测抗体存在的标记物。能够调节这些作用的结构已经有了详细 的报道。在某些情况下,提供标记过的、可监测的抗体。如果一种抗体与一个能用已知方 法鉴别、可视化或者定位的分子结合,那么这种抗体就称为“标记过、可监测的”。合适的 可监测的标记包括放射性同位素标记、酶标记、非放射性同位素标记、荧光标记、毒素标 记、亲和标记、化学发光标记和核磁共振对比试剂。
    在一些实施方案中,提供能够分泌选择性识别特定超分子聚集物构象的单克隆抗体, 例如识别特定的在前纤维寡聚体、纤维状寡聚体、环形原纤维或者淀粉样纤维的抗体。
    在一些实施方案中,这些单克隆抗体可以被用于治疗或者防止先兆子痫。这些抗体也 可以用于定性或者定量的监测先兆子痫相关的错误折叠蛋白质聚集物,如在尿液样品中。 这些先兆子痫相关的错误折叠蛋白质聚集物表现出特定的寡聚体构象,这些构象能够用单 克隆抗体来识别,并且这些构象的出现能够说明患者已经发生先兆子痫,或者预测即将发 生先兆子痫综合症的风险。
    3.SerpinA1和白蛋白作为先兆子痫的生物学标记
    申请人之前已经用蛋白质组学技术(SELDI-TOF质谱)与标准的分子和生物化学识别 检测相结合的方法证明,患有先兆子痫的女性的尿液和其他体液和组织中所含的SerpinA1 多肽或白蛋白多肽的量比未患这种疾病的女性高(U.S.Appl.No.: 12/084004(PCT/US2006/042585),其内容以引用得形式结合到本文中)。
    在某些方面,这个发明与检测来自受试者样品(如尿液)中SerpinA1多肽或白蛋白多 肽的方法来确定先兆子痫的状态有关。在某些情况下,以SELDI为基础的测量方法可以用 于对受试者的先兆子痫发病情况的检测。这些方法可能包含一个检测最多13个SerpinA1 和白蛋白多肽片段生物标记的水平的步骤。这个方法部分基于SerpinA1和白蛋白多肽生物 标记的出现与先兆子痫发病的关联。13种SerpinA1和白蛋白多肽生物标记物已经被鉴别 出来(U.S.Appl.No.:12/084004(PCT/US2006/042585)),其中部分的SEQ号码在这里列出:
    [MIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK(SEQ ID NO:1);
    MoxIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK(SEQ ID NO:2);
    MoxIEQNTKSPLFMoxGKVVNPTQK(SEQ ID NO:3);
    EDPQGDAAQKTDTSHHDQDHPTFNKITPNLAEFAFS(SEQ ID NO:4);
    DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVL(SEQ ID NO:5);
    DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIA(SEQ ID NO:6)]
    这里用到的名词“白蛋白”是指全长的白蛋白多肽,也指它的一个片段多肽。白蛋白多肽生 物标记的例子在这里以SEQ号码列出:
    [DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVL(SEQ ID NO:5);
    DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIA(SEQ ID NO:6)]
    野生型白蛋白的全长氨基酸序列为Genbank Accession No.P02768.
    已经有研究发现,来自怀孕女性的样品如果上面的13种生物标记物的含量超过一定的 标准,就能够指示先兆子痫的发生。在这些情况下,有两种尿液中蛋白质的评分标准(UPS): 一种Boolean评分(UPSb),代表指派给13种生物标记的每一种Boolean指示剂的总和, 另一种与之互补的是一种排序的评分(UPSr),它能够将13种生物标记的Boolean指示剂 结果用数值1(即客观存在)保留下来,其计算方法为:UPSr=[S/N/10]+1,其中S/N=SELDI 分析中的信噪比。所以,理论上说,UPSb的评分范围为0到13(每一种SerpinA1和白蛋 白多肽生物标记物),而UPSr能够从0取到无穷。每种评分都有最合适的评价标准,用于 区分对照组和患有严重先兆子痫的患者。UPSb水平高于6以及UPSr水平高于8表示受试 者患有严重的先兆子痫。UPSb水平低于6和UPSr水平低于8表示受试者未患有严重的先 兆子痫。如果一个样本含有其它UPSb和UPSr的评分组合,那么在1,2,3,4,5,6, 或者更多天后应该获取第二份样品,这份样品可以用本专利中的方法检测,来确定受试者 是否患有先兆子痫。测试样品的准备,生物标记物的探测和测量,以及诊断的方法都在本 文和引文(U.S.Appl.No.:12/084004(PCT/US2006/042585))中有所描述。
    4.用VEGF,PIGF和sFlt-1作为先兆子痫的生物标记
    研究表明,患有先兆子痫的女性体内血浆中血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因 子(PIGF)和可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFlt-1)的浓度会发生变化(Levine RJ et al.N Engl  J Med 2004:12;350:672-83;Maynard SE et al.J Clin Invest 2003;111:649-58;Levine RJ et al. N Engl J Med 2004:12;350672-83)。申请人过去曾经证明VEGF,PIGF和sFlt-1可以作为 早期诊断先兆子痫的生物标记(U.S.Publ.No:US-2006-0183175;PCT/US2005/047010,其 内容以引用得形式结合到本文中)。申请人已经说明,患有高血压的怀孕女性尿液中sFlt-1 的浓度显著上升,PIGF浓度显著降低。在某些情况下,本专利采用测量尿液样本中的PIGF 和sFlt-1的方法,并且采用这两种作用相反的生长因子的比值来将患有严重先兆子痫的怀 孕女性与其他怀孕女性区分开,其他怀孕女性包括可能表现出伴有或者不伴有慢性高血压 的轻微先兆子痫的个体,以及血压正常的对照组。专利中描述的方法也可以用来评估怀孕 女性发展出某一种高血压并发症的风险,其中包括先兆子痫。这些并发症可能包括剖腹产 带来的血液中尿酸含量升高,血管收缩压和舒张压上升,蛋白尿,妊娠,生产时胎儿的重 量,胎盘破坏,宫内胎儿生长迟缓,溶血,血小板减少症,肝脏酶类升高和HELLP综合 症等。
    在某些情况下,采用一个方程式来分析获得的生物标记物的浓度或者水平。得到的数 值能够提供一名怀孕女性发展出高血压症状的可能性,例如先兆子痫。这里用到的名词“方 程式”代表任何数学表达式,算法或者其他能用来评估某个生物标记物的水平是否说明一名 怀孕女性已经或者可能患有高血压或者并发症的风险的方法。
    在某些情况下,这种方程式可以用来计算怀孕女性的uFP值。在本专利中,uFP指的 是log[sFlt-1/PIFG×100]。一方面,uFP值大于1.4是一个预后指标,代表这名怀孕女性需 要治疗或者防止高血压相关综合征的危险升高。另一方面,uFP值大于2.1说明这名怀孕 女性有患严重先兆子痫的风险。另外,uFP值大于2.1还说明这名怀孕女性可能需要剖腹 产。
    测试样本的制备,检测,生物标记物测量和诊断的方法在本文和引文(U.S.Publ.No: US-2006-0183175)中都有描述。
    5.测试样本的准备(为本专利中描述的某些方法)
    样本可以是来自怀孕的受试者,如一个需要检测先兆子痫情况的孕妇。受试的怀孕个 体可以是先前根据其个人病史或家族史确定有很高的患先兆子痫风险的女性?;吃械氖苁?者也可以是先前被诊断为患有慢性高血压。其他受试者可以是已知患有先兆子痫的怀孕女 性。在一些实施方案中,本发明描述的方法可以用来监测已经诊断出患有先兆子痫的个体, 例如确定某种治疗方法对于一个患先兆子痫的女性的作用。另外,受试者也可能是用于常 规检测是否患有先兆子痫的健康女性,或者是建立受试者自身或者为其它受试者建立生物 标志物的基准水平。在其它情况下,样本可能来自其它非人类的雌性怀孕个体,或者未怀 孕的个体,例如用于鉴别治疗先兆子痫的化合物的方法等。
    尿液样本可以在取样后立即检测,或者经过一段时间后再检测,只要在测量时样本中 还含有可以测量的生物标记物。例如,尿液样本可以保存在-70℃,或者混合后储存在用能 够稳定或保存生物标记物的试剂预先处理过的容器中。比较好的情况是,尿液样本采自早 晨空腹的第一次尿液。
    本专利中涉及的生物标记可以在不同的生物样本中测量,最好是来自液体样本,如尿 液。生物标记也可以在组织或者其它生物液体样本中测量。能够用本专利的方法和试剂盒 测量其它生物样本的例子包括但不限于血液、血浆、血浆、阴道分泌液、脑脊液、眼泪和 唾液等。如果需要,可以将样品经过处理以提高生物标记的可检测性。例如,来自受试者 的尿液样品可以分成多个组分。任何能够富集所需的生物标记多肽的方法都可以被采用。 根据检测方法的不同,样品处理,例如预先分离的步骤,可以是选择性的,并且不是提高 生物标记的可检测性所必需的。例如,如果采用特异性与生物标记物结合的抗体来检测生 物标记在尿液中是否存在,那么样品处理就不是必需的。样品处理可以包括对样品的分离, 以及收集确定含有生物标记物的组分。分馏的方法包括例如体积排阻色谱、离子交换色谱、 肝素色谱、亲和色谱、分级提取、凝胶电泳和液相色谱等。分离的方法示例在引文 (PCT/US03/00531)中有描述。
    作为示例,样品可以用阴离子交换色谱预先分离。阴离子交换色谱能够将样品中的蛋 白质依据电荷特征分离。例如,可以采用Q阴离子交换树脂,样品可以接下来用不同pH 的洗脱剂洗脱下来。阴离子交换色谱可以分离样品中比其他生物分子带更多负电荷的生物 分子。用更高pH洗脱的蛋白质可能带有比较弱的负电荷,用低pH洗脱的蛋白质可能带有 比较强的负电荷。因此,除了可以降低样品的复杂性外,阴离子交换色谱还可以将依据结 合特性分离蛋白质。
    作为另外一个例子,生物分子也可以用高分辨率电泳来分离,例如一维或者二维凝胶 电泳。含有生物标记的组分可以被分离出来,并且进一步用气相离子光谱测定。比较好的 方法是采用二维凝胶电泳产生二维的生物分子点的阵列,其中包括一种或多种生物标记 物。例子见Jungblut and Thiede,Mass Spectr.Rev.16:145-162(1997)。二维凝胶电泳可以用 普遍采用的方法进行,参考Deutscher ed.,Mechods in Enzyniology vol.182。在某些情况下, 样品中的生物分子可以采用例如等电聚焦的方法分离,这时生物分子在一个pH梯度中被 分离,达到各自净电荷为0的点(等电点)。这种第一步分离的方法会得到一个一维的生 物分子阵列,这个阵列中的生物分子接下来会被用另一种通常和第一步不同的方法分离。 典型的方法中,二维凝胶电泳可以用化学的方法分离分子量1000-200000Da的复杂生物分 子混合物。这些凝胶的pH值通常为3-10(大范围凝胶)。
    作为另外一个例子,高效液相色谱(HPLC)也可以用于依据物理性质分离样品中的生 物分子混合物,例如依据极性、电荷和大小。HPLC设备一般含有一个固定相,一个泵, 一个注射器,一个分离柱,和一个检测器。一部分样品中被注射进入柱子中,样品中的生 物分子通过柱子分离?;旌衔镏胁煌纳锓肿右谰菰诠潭ㄏ嗪土鞫嘀胁煌姆峙湫?为,以不同的速率通过柱子。与所需的生物标记物的分子量或者其他物理性质相同的组分 可以被采集。这一组分可以接下来用气相离子光谱来检测生物标记物。例如,可以用MALDI 或者SELDI的方法检测。
    分析前,生物标记可以被选择性地修饰以提高分辨率,或者鉴别其特征。例如,生物 标记可以经过蛋白质裂解处理??梢圆捎萌魏魏鲜实牡鞍酌复?。蛋白酶,例如胰蛋白酶, 常常将蛋白质切割为特定数目的碎片,这些碎片非常有用,可以作为生物标记的指纹,用 来间接测定这些生物标记。这对于区分分子量接近的生物标记非常有用。另外,裂解后的 片段更适用于大分子量生物标记的分析,因为小分子量的生物标记更容易用质谱分析。接 下来,生物标记的特性可以进一步用物理、化学特征的匹配在蛋白质数据库中分析(例如 SwissProt)。
    在一些实施方案中,在检测标志物前,可以将来自怀孕女性的尿液样本用一种或多种 稳定试剂处理,或者在收集样本前将用于收集样本的容器用一种或多种稳定试剂处理。这 里的名词“稳定剂”是指一种或多种分子,例如多肽或核苷酸,可以用来防止标志物的分解。 在一些情况下,稳定剂可以是一种蛋白酶抑制剂,包括AEBSF,Pefabloc SC,抗蛋白酶, 抗蛋白酶的二盐酸化物,抑蛋白酶肽,苯甲醚和苯甲醚的盐酸化物,苯丁抑制素,胰凝乳 蛋白酶抑制剂,E-64,EDTA及其钠盐,亮抑酶肽,乙基马来酰亚胺,胃酶抑素和胃酶抑 素A,膦酰二肽,叠氮化钠,胰蛋白酶抑制剂或者ε-氨基己酸。
    5.探测和测量生物标记物(为本专利描述的一些实施方案)
    本发明中用到的先兆子痫的生物标记物可以用任何已经广泛使用的方法检测。这些方 法的例子包括但不限于免疫学方法检测分泌蛋白,蛋白质纯化方法,蛋白质功能和活性测 试,核酸杂交方法,核酸反转录方法,和核酸扩增方法。在某些情况下,生物标记物的水 平可以用ELISA来测定。
    这里提供的方法和组合物使通过检测或者监控来自怀孕女性的样品中的先兆子痫相关 的生物标记(例如SerpinA1多肽,白蛋白多肽,VEGF多肽,sFlt-1多肽和PIGF多肽)的 水平来评估或者监控一名怀孕女性患先兆子痫的风险。这可以通过在怀孕后的各个时期用 本发明描述的方法获取尿液样品和检测生物标记的水平来实现。得到的数值可以与对照的 数值比较,也可以与已知的(预先确定好的)标准比较。这里用到的名词“合适的标准”或 者“对照”是指从对照个体取得的尿液中测得的生物标记水平。合适的标准可以通过正?;?孕女性和确定有高血压症状如先兆子痫的怀孕女性的尿液样本来确定。在某些情况下,本 发明中提供的标准来自于与测试样本取样时相同怀孕周数的个体。来自受试者的样本可以 同时获取和分析?;蛘?,先兆子痫相关的生物标记(例如SerpinA1多肽,白蛋白多肽, VEGF多肽,sFlt-1多肽和PIGF多肽)也可以在受试者的样本用作其他常规检测之前或之 后测定。标准的先兆子痫相关的生物标记水平可以由掌握基本技能的人员用已经广泛采用 的方法获得。
    诸如SerpinA1多肽和白蛋白多肽的生物标记最好可以用固定在固相载体的捕捉剂来捕 捉,例如这里描述的任意一种生物芯片、多孔微量滴定板、树脂或者其他合适的载体。比 较好的质谱技术是表面增强激光解吸/离子化(SELDI)质谱,例如用U.S.Patent No. 5,719,060and No.6,225,047中描述的方法。在这些方法中,表面上的探针将待分析的组分 呈递给能量来源的步骤在解吸/例子化的过程中起到了重要的作用。在这种情况下,名词“探 针”是指一种能够连接含有探针的表面,并且将待分析的物质呈递给离子化能量源,进行离 子化并且注入液相离子光谱(例如质谱)的设备。一个探针一般含有一个固定底物,可以 是活动的或者固定的,这个底物含有一个样品呈递表面,在这个表面上,待分析物被呈递 给离子化能量源。
    在一种称为“表面增强亲和捕捉”的SELDI中,探针包含一个化学选择性表面(“SELDI 探针”)?!盎а≡裥员砻妗苯岷弦恢治郊?,也称为“结合基团”或者“捕捉试剂”,或者一 种能够结合捕捉试剂的反应基团,例如通过一个能够形成化学键或配位键的反应。
    这里的“反应基团”代表一个能够结合捕捉试剂的化学基团?;费趸衔锖?carbodiimidizole是很好的能够共价结合多肽捕捉试剂如抗体或者细胞受体的反应性区域。 次氮基乙酸和亚氨基二乙酸是很好的能够与金属离子配位的反应区域,这些金属离子可以 与含组氨酸多肽非共价相互作用?!胺从π员砻妗笔侵附岷狭朔从诺谋砻??!拔郊痢被?者“捕捉试剂”是指任何能够结合所需的生物标记物的物质。本发明中,适用于SELDI的吸 附剂在U.S.Patent No.6,225,047中有描述。
    一种类型的吸附剂是“色谱吸附剂”,这种吸附剂是色谱中常用的材料。色谱吸附剂包 括例如离子交换材料,金属螯合剂,固定的金属螯合剂,疏水性相互作用吸附剂,亲水性 相互作用吸附剂,染料,混合吸附剂(如疏水吸引/静电排斥性吸附剂)?!吧锾匾煨晕?剂”是另一个范畴,指含有生物分子的吸附剂,例如核苷酸、核酸分子、氨基酸、多肽、单 糖、多糖、脂肪酸、脂质、类固醇或者它们的共价结合物(如糖蛋白,脂蛋白,糖脂)。 在某些情况下,生物特异性吸附剂可以是大分子结构,例如蛋白质复合物,生物膜或者病 毒。具体的生物特异性吸附剂有抗体,受体蛋白和核酸。通常,生物特异性吸附剂比色谱 性吸附剂对于所分析的物质具有更高的特异性。
    另一种SELDI称作SEND,利用了将能量吸收分子结合在表面的探针(“SEND探针”)。 这里的“能量吸收分子”(EAM)是指能够从激光解吸离子化源吸收能量,并且帮助被分析 的物质解吸和离子化的分子。EAM包括用于MALDI的分子,其中的代表性物质为肉桂酸 衍生物,芥子酸(SPA),氰基氢氧化肉桂酸(CHCA)和二羟基苯甲酸,阿魏酸,和羟基 苯乙酮衍生物。这一类别也包含在SELDI中使用的EAM,这些物质在U.S.Patent No. 5,719,060中有列举。
    另一种形式的SELDI称为SEPAR,这种方法涉及使用一种探针,这种探针含有与表面 结合的区域,能够共价结合被分析的物质,并且在受光照射后通过一个光敏键的断裂释放 被分析的分子,光照可以是激光。例子见U.S.Patent No.5,719,060。SEPAR和其他种类的 SELDI可以依据本专利中的要求进行调整,用于检测生物标记或者生物标记物的总体情况。
    本发明中对于生物标记物的检测可以用某些选择性条件进行增强,例如某些吸附剂和 洗涤液。这里“洗涤液”是指一种试剂,通常是溶液,它可以用来影响或者修饰某种待分析 物质在吸收表面的吸附,或者去除表面上未结合的物质。洗涤液的洗脱特性可以由例如pH 值,离子强度,疏水性,促溶性,去垢剂强度和温度决定。
    在本发明中的一些实施方案中,样品采用“生物芯片”的方法分析?!吧镄酒笔侵敢?个一般为平面的固体底物,上面连接着一种捕捉试剂(吸附剂)。经常地,生物芯片的表 面包含许多能够分清楚的位置,每一个位置上固定着一种捕捉试剂。生物芯片可以用于在 中间结合一种探针,接着这种探针可以用于气相离子光谱,如比较好的采用质谱分析?;?者,生物芯片也可以与另一种底物结合,形成一种可以用光谱分析的探针。
    本发明中,有许多生物芯片都能用于捕捉生物标记物,这些芯片有来自商业来源的如 Ciphergen Biosystems(Fremont,CA),Packard BioScience Company(Meriden,CT),Zyomyx (Hayward,CA),Phylos(Lexington,MA)。这些生物芯片的离子在U.S.Patent Nos.6,225,047, 6,329,209和PCT Publication Nos.WO 99/51773和WO 00/56934中都有描述。
    更具体一点说,Ciphergen Biosystems生产的生物芯片含有铝制底物上的条状表面,表 面上在可以定位的位置有色谱型或生物特异性吸附剂。条状结构的表面上包被有二氧化 硅。
    Ciphergen Protein阵列中具有代表性的是H4,SAX-2,WCX-2和IMAC-3生物芯 片,这些芯片包含功能化的交联高分子。这些分子以水凝化的方式,通过物理方法与生物 芯片表面连接,或者通过硅烷与生物芯片表面共价连接。H4生物芯片具有异丙基特性,用 于疏水性连接。SAX-2生物芯片具有四级铵特性,用于阴离子交换。WCX-2生物芯片具 有羧酸特性,用于阳离子交换。IMAC-3生物芯片具有次氮基乙酸特性,用于以配位形式 吸收过度金属离子,例如Cu++和Ni++,这些固定的金属离子又可以用于配位吸附生物标 记物分子。
    含有吸附剂的底物与尿液样本接触一段足够的时间,使可能存在的生物标记物与吸附 剂结合。孵育一段时间后,洗涤底物表面以去除未结合的物质。任何合适的洗涤剂都可以 被采用,最好是采用液体溶剂。接下来,用能量吸收分子与结合了生物标记物的底物相互 作用。能量吸附分子是指能够从气相离子光谱的能量源中吸收能量的分子,这种分子能够 帮助生物标记物从底物上解吸下来。示例的能量吸收分子包括肉桂酸衍生物,芥子酸和二 羟基苯甲酸。比较好的能量吸收分子是芥子酸。
    一旦吸附到底物上,例如生物芯片或者抗体上,任何合适的方法都可以用来测量样品 中的生物标记物。例如,生物标记物可以用许多检测和测量的方法测定,如气相离子光谱 类方法,光学方法,电化学方法,原子力显微镜和放射性频率方法。这些方法可以用来检 测一个或多个生物标记物。
    在某些情况下,探测和测量生物标记使用的是质谱的方法,尤其是SELDI方法。SELDI 是指一种解吸/离子化气相离子光谱的方法(例如质谱),被检测的物质被捕捉到一个含有 SELDI探针的表面上,在“SELDI MS”中,所用的气相离子光谱是质谱。SELDI技术在上 文有更详细的描述。
    在其他情况下,可以用免疫检测的方法来检测样品中的生物标记物。免疫检测方法采 用抗体来特异性结合抗原(如生物标记物)。免疫检测的特点是采用抗体特异性结合抗原 的特点来分离、结合和定量测量某种抗原。因此,在某种指定的免疫检测条件下,抗体与 某种特定的抗原的结合能力是与背景结合能力的2倍以上,并且与样品中其他的蛋白质没 有明显的结合。这种特异性的结合可能要求抗体经过对某种特定蛋白质的特异性筛选。例 如,用某种动物例如大鼠、小鼠或人类的生物标记分子制备的多克隆抗体可以通过筛选, 获得仅与这个物种的这个生物标记物反应而不与其他蛋白质反应的多克隆抗体,“其他蛋白 质”不包括基因多态性产物和这种生物标记物的不同等位基因的产物。这种筛选可以通过将 抗体中与其他物种的这个蛋白交叉反应的部分去除的方法来实现。
    利用纯化的生物标记物或者它们的核苷酸序列,可以用已知的方法制备特异性结合某 种生物标记的抗体(例如SerpinA1多肽或者白蛋白多肽)。方法可以参考Coligan,Current  Protocols in Immunology(1991);Harlow&Lane,Antibodies:A Laboratory Manual(1988); Goding,Monoclonal antibodies:Principles and Practice(2d ed.1986);Kohler&Milstein, Nature 256:495-497(1975);Huse et al.,Science 246:1275-1281(1989);Ward et al.Nature 341: 544-546(1989).
    通常,来自受试者的样品可以与特异结合某种生物标记的抗体反应??固逡部梢匝≡?性地与一种固相载体结合,用来在抗体与样本结合前帮助洗涤和复合物的分离。固相载体 有玻璃或者塑料质地,形式为微量滴定板、杆状、珠子或者微球等??固逡部梢粤釉谝?个探针底物上,或者蛋白质芯片上。
    在样品和抗体共同孵育之后,洗涤混合物,并且检测生成的抗体-生物标记复合物。这 个可以通过将洗涤后的混合物与检测试剂共同孵育来实现。这种检测试剂可以是例如连接 有可检测标签的二级抗体等。典型的可检测标签包括磁性小球,荧光染料,放射性标签, 酶(如辣根过氧化物酶,碱性磷酸酶等常用于ELISA的酶),和有色的标记如胶体金或者 有色玻璃或者塑料小球?;蛘?,样品中的生物标记也可以用间接的方法检测,例如用一个 加入标签的二级抗体来检测与生物标记特异结合的抗体,或者使用竞争性或抑制性的检测 方法,例如用一种与待检测的生物标记物的一个特定的表位结合的单克隆抗体与之前的混 合物共同孵育的方法。
    检测抗体-生物标记复合物的存在和含量的方法包括例如检测荧光、冷光、化学发光、 吸收、反射、发射、二次折射、折射率(例如表面等离子共振,椭圆光度法,共振镜方法, 门控波导耦合器方法或者干涉测量法)等。光学方法包括显微镜(共聚焦和非共聚焦), 成像方法,和非成像方法。放射频率方法包括多极共振光谱。许多实用的方法都已经广泛 采用,包括例如:酶联免疫检测(EIA)例如酶联免疫吸附测试,放射免疫检测,蛋白质 印迹检测或者槽印迹检测。
    免疫检测的方法既可以测定一种生物标记在样品中是否存在,也可以确定存在的量。 抗体-标记复合物的量可以通过与标准比较来确定。标准可以是例如已知的化合物或样品中 其他蛋白质的量??梢岳斫獾氖巧锉昙堑牧坎⒉荒懿獬鼍灾?,而是以与标准物的比值 形式出现。
    当样品测量后产生数据时,例如用质谱方法测量后,数据可以用计算机软件分析。在 某些情况下,与底物结合的生物标记能够在气相例子光谱中被检测出来,这些生物标记被 一种离子源例如激光离子化,产生的离子被离子光学装置收集起来,然后在质量分析器中 分离并分析经过的离子。检测器随后将检测到的离子的信息翻译为质量-电荷比的形式。因 此,生物标记物的含量和质量都能被检测。
    通常,由解吸和检测得到的生物标记的数据可以用电子计算机分析。计算机程序分析 所得的数据,指示出被检测到的生物标记的数目,并且选择性地显示每个生物标记的信号 强度和分子量。数据分析也可以包含确定生物标记的信号强度,并且去除与预先设定的数 据分布偏离的数据。例如,可以通过计算每一个峰值相对于某个参考值的强度来归一化观 察到的峰值。参考值可以是机器或者化学试剂如能量吸收分子本身产生的背景噪音,这个 信号在分析时被设为零值。
    电脑可以把所得的数据转化成不同的显示格式。标准的光谱可以用于显示,但是一种 更实用的方法是只显示峰高和质量信息,这样可以得到一个比较干净的图像,并且使得分 子量接近的生物标记更容易区分;另一种实用的方法是比较一个或者更多的光谱,并且标 记出不同样品间上调或者下调的生物标记分子。使用这些方法,就可以确定某种特定的生 物标记是否在样品中存在。
    用于分析数据的软件可以包括一种算法,来分析一个信号峰值是否代表一种生物标记。 软件也可以用来将观察到的生物标记峰的数据用于分类树或者人工神经网络分析,来确定 一种生物标记的峰值或者多个峰值的组合是否代表一种羊膜内炎症的诊断。
    7.对于先兆子痫的多种或综合分析
    在一些实施方案中,本发明提供了检测或者预测先兆子痫的方法,这些方法可以采用 一种或者多种方法来测量一个或者多个先兆子痫的生物标记,如用多种方法,那么后面的 测量结果可以用于确认前面的测试结果,或者得到更多的定性和定量结果,这样能够提高 结果的预测价值,并且为诊断带来更高的可信度。例如,最开始可以采用刚果红保留值 (Congo Red Retention)测试的方法(例如斑点印迹)来得到关于受试者是否患有或可能 发展为先兆子痫的第一个指标。这个第一步测试可以由受试者自己在不需要监视或者实验 室设备的情况下完成,或者只需要很少的技术和实验设备。
    如果刚果红保留测试的结果是阳性的,那么可以进一步进行定量,这个指标也可以用 作检测或者预测先兆子痫的严重程度。除了刚果红保留测试和类似的基于染料的测试,样 品也可以用于基于抗体的测试,例如使用检测错误折叠蛋白聚集物的特定构象的抗体。这 些测试可以采用与刚果红保留测试所用的相同的样品,或者采用来自同一受试者的第二个 样品;测试可以在刚果红保留测试之后进行,也可以同时进行。这些使用识别错误折叠蛋 白质聚集物特定构象的抗体的测试可以在一些实施方案中用于证实刚果红保留测试的结 果,或者可以用来获得更多的定性信息,例如将某种特定的蛋白质寡聚体构象的存在与否 与发展为先兆子痫的可能性联系起来,或者指示先兆子痫的严重性。除了这些基于先兆子 痫样本中蛋白质聚集物的测试外(如亲刚果性/刚果红保留测试和基于抗体的蛋白质聚集物 分析),也可以采用其它测试方法来证实这些测试的结果,或者获取更多定量和定性的数 据。例如,可以用更多的测试来检测更多的生物标记物是否存在,包括检测先兆子痫生物 标记物白蛋白、SerpinA1、sFlt-1、PIGF、VEGF,采用的方法可以是ELISA或者用SELDI-TOF 方法分析蛋白质片段。另外,可以计算预测性的生物标记水平的比值,例如sFlt/PIGF[uFP]。 进一步,其他蛋白质的存在或者相对水平也可以用于先兆子痫的诊断,例如尿液蛋白质聚 集物中的免疫球蛋白,血浆铜蓝蛋白等。
    应该注意的是,这里描述的测试方法可以用任何顺序进行,可以单独进行或者以任何 组合方式进行。在这个方面,本发明没有限制。申请人之前也曾经说明和描述过,这些测 试方法中的任何一个都足以检测先兆子痫,帮助诊断和预后。
    8.治疗
    蛋白质构象疾病,例如老年痴呆症,轻链淀粉样变性病和朊蛋白疾病,都是随淀粉样 纤维的增多和聚集加剧的,原因是细胞内蛋白质错误折叠为异常的3D结构。最近的观察 结果显示可溶性前淀粉样寡聚体(纤维组织的中间体)具有蛋白毒性,能够导致表皮破坏 和氧化压力。申请人曾经证明,表皮破坏和氧化压力在严重先兆子痫中起到了致病作用。 申请人意外发现先兆子痫是一种构象疾病,并与蛋白质错误折叠和聚集有关,其特点是淀 粉样蛋白的聚集。申请人又进一步用构象特异性多克隆或单克隆抗体染色的方法说明,患 有先兆子痫的受试者尿液中的错误折叠中间体具有组装成为孔状结构(淀粉样通道)的倾 向,这可能在临床发病的过程中起到重要作用,例如表皮破坏和氧化压力。申请人推断, 在诊断出先兆子痫的病人胎盘中积累的异常蛋白质聚集物说明这种蛋白质聚集是这种疾 病的致病因素之一。在一些实施方案中,提供了治疗先兆子痫的方法,这些方法包括免疫 学和药理学的策略,并基于阻断可能组装成淀粉样通道的错误折叠蛋白质寡聚体的产生。 在一些实施方案中,提供了治疗先兆子痫的方法。在一些实施方案中,这些治疗方法是基 于已经发现的能够减轻其他蛋白质错误折叠疾病(例如老年痴呆症)的严重程度的方法。 在研究类似蛋白质异常聚集疾病,例如老年痴呆症和其他淀粉样变性疾病的新的治疗方法 过程中,人们已经发现了新的能够抑制新的蛋白质聚集物生成、或者减少已有蛋白质聚集 物负担的药物。我们的有关先兆子痫与蛋白质异常聚集相关的发现显示可以用这些药物治 疗先兆子痫。
    多种方法和药物已经被发展出来并用于抑制或者减少老年痴呆症中的β淀粉样聚集来 治疗老年痴呆症,例如针对于纤维或者寡聚体生成的小分子抑制剂、肽抑制剂,对于一种 或多种蛋白质聚集物组分的免疫,用针对一种或多种蛋白质聚集物组份的抗体或抗体片段 进行被动抗体免疫。这些试剂中的一些已经被证明可以抑制除β-淀粉样蛋白外其他蛋白质 的聚集。例如,对氨基苯酚和2-氨基-4-氯苯酚以及它们的衍生物(Cell Biochemistry and  Biophysics 44:549-553(2006))能够抑制其他蛋白质的聚集。
    在一些实施方案中,本发明提供了用蛋白质聚集抑制剂来抑制蛋白质聚集物的形成, 或者逆转已经形成的蛋白质聚集来治疗先兆子痫的方法。在一些实施方案中,提供能够使 易聚集的蛋白质原来的构象更稳定的试剂来降低异常折叠以及接下来的聚集的速率。在一 些实施方案中,提供针对于纤维或者寡聚体生成的小分子抑制剂、肽抑制剂,对于一种或 多种蛋白质聚集物组分的免疫,用针对一种或多种蛋白质聚集物组份的抗体或抗体片段进 行被动抗体免疫,作为治疗或者预防先兆子痫的方法。在一些实施方案中,提供抗β淀粉 样蛋白试剂(如在Drug Discovery Today:TherapeuticStrategies 1:7-12(2004)中和本专利中总 结的)来治疗或者预防先兆子痫。
    申请人还发现SerpinA1或者它的多肽片断是先兆子痫蛋白质聚集物的成分之一。过去 曾有报道说SerpinA1可以作为早期诊断先兆子痫的生物标记(U.S Appl.No.: 12/084004(PCT/US2006/042585))。
    这里用到的“SerpinA1多肽”一词是指全长的SerpinA1多肽,也指全长SerpinA1多肽的 一个片段多肽。SerpinA1过去已经被鉴定为一个丝氨酸蛋白酶抑制剂,和一个alpha 1抗 胰蛋白酶。SerpinA1多肽的Genbank序列为No.P01009??梢岳斫獾氖橇硪桓鯯erpinA1 等位基因编码的SerpinA1多肽也可以用于检测受试者是否患有先兆子痫。例如,由M1A, M2,或M3等位基因编码的SerpinA1多肽都可以用作诊断或者评估受试者的先兆子痫。 SerpinA1多肽在肝脏和胚胎滋养层合成,并且以多种与SerpinA1的抗蛋白质裂解作用无关 的形式存在。SerpinA1多肽极易被氧化,强氧化压力会引起SerpinA1的氧化。在试管实验 中,来自全长SerpinA1多肽C端的一个片段多肽能够引起氧化反应和嗜中性趋化行为。
    在先兆子痫患者尿液中鉴别出SerpinA1表明先兆子痫与其他疾病如alpha-1抗胰蛋白 酶缺乏症有着类似的病源,后者是由于错误折叠的alpha-1抗胰蛋白酶的积累导致肝细胞 损伤和肝硬化(N.Engl.J.Med.346:45-53(2002);J.Clin.Inv.110:1585-1590(2002))。在某 些情况下,提供能够防止SerpinA1蛋白或者其片段异常聚集的治疗试剂。在其他情况下, 提供能够解聚已有的SerpinA1或者其片段聚集物的试剂。例如,一种这样的试剂是三甲基 胺氮氧化物和相关化合物(Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.24:727-732(2001))。另一个例子是 FLEAIG多肽(SEQ ID NO:7)和相关多肽及衍生物(Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.35: 540-548(2006))。在某些情况下,三甲基胺氮氧化物和相关化合物,或者FLEAIG多肽(SEQ  ID NO:7)和相关多肽及衍生物被提供作为一种有用的治疗方法,来治疗或预防先兆子痫。
    正如具有一般的相关技能的人士所认为的,对于一个治疗方法的评估也可以基于对于 先兆子痫的综合症和最终结果的评估。因此,本发明也可以用于确定由一个或多个生物标 记(如SerpinA1,白蛋白,sFlt-1,PIGF,VEGF,错误折叠蛋白聚集物/亲刚果红物质)代表 的受试者的发病,发展或者好转情况。在一些实施方案中,本发明的方法可以用于检测已 经诊断为先兆子痫的受试者的一种或多种生物标记的水平。在其它一些实施方案中,本发 明的方法可以用于获得用于诊断个体先兆子痫的测量结果。在一些实施方案中,受试者可 能已经处于先兆子痫的药物治疗中,而在其它一些实施方案中受试个体可能没有接受先兆 子痫的治疗。
    选择治疗先兆子痫的方法可以部分基于怀孕女性中有异常高水平的先兆子痫生物标记 物(如SerpinA1,白蛋白,sFlt-1,PIGF,VEGF),或者有与先兆子痫相关的错误折叠蛋白 聚集物并表现出亲刚果红特性。治疗方法可以包括采用某种特定种类的药物,活动方式的 变化,或者饮食的变化,这些至少部分基于某种先兆子痫指示物的出现(例如检测出一种 或多种生物标记,亲刚果红/错误折叠蛋白质聚集物或者是特定的蛋白质寡聚体构象)。这 些个体可能已经在接受先兆子痫的药物治疗。根据本发明,可以基于检测出的一种或多种 生物标记、亲刚果红/错误折叠蛋白质聚集物或者是特定的蛋白质寡聚体构象,调整个体的 治疗方案。一个个体可能先前并没有接受任何先兆子痫的治疗,那么接受监测一种或多 种生物标记、亲刚果红/错误折叠蛋白质聚集物或者是特定的蛋白质寡聚体构象,这样可以 帮助选择最有效的治疗方案。
    9.试剂盒
    在一些实施方案中,本发明提供可以在所描述方法中使用的试剂盒。试剂盒所含的试 剂可以包括带标记的化合物或者能够检测出尿液中嗜刚果红性或者错误折叠蛋白聚集物 的试剂。在一些实施方案中,试剂盒还可以包含对蛋白质具有亲和性的支持表面,可以与 样品(如尿液样品)相接触;试剂盒还可以进一步含有一种能够和与先兆子痫相关的错误 折叠蛋白聚集物结合的染料(如刚果红),这种染料可以用于与样品接触;试剂盒中也可 以含有器皿、试管或者容器,用来将样品和染料混合,或者用来孵育结合了样品中蛋白质 的具有蛋白亲和性的支持表面。试剂盒也可以包括一种或多种洗涤液,用来去除未结合错 误折叠蛋白聚集物的染料。试剂盒可以还包含阳性对照品和阴性对照品来帮助控制染料结 合和洗涤条件和时间,以保证在,例如上述对蛋白质具有亲和性的支持表面(“测试条”) 上进行足够的结合和洗涤。
    在一些实施方案中,本发明提供了适用于本发明检测方法的试剂盒,试剂盒所含的试 剂可以是标记的化合物或者能够检测出尿液中错误折叠蛋白聚集物及其含量的方法(例如 提供能与聚集物结合的抗体),合适的能够与生物标记物结合的试剂包括抗体、抗体衍生 物、抗体片段等。对于基于抗体的试剂盒,此试剂盒可以包含例如:(1)第一个抗体:一个 用于和生物标记物结合的抗体(例如结合在固相载体上),(2)第二个抗体:一个不同于第 一个抗体的、可以与第一个抗体或者上述生物标记物结合的抗体,并带有可供检测的标记。
    可以用这种试剂盒检测的先兆子痫相关生物标记包括sFlt-1,PIGF,VEGF,白蛋白, SerpinA1,IFI6和血浆铜蓝蛋白。在一些实施方案中,试剂盒含有特异性识别某些错误折 叠蛋白质构象(例如纤维构象)等的抗体??固蹇梢杂敫檬约梁锌杉觳獾睦嘈偷难分刑?定的蛋白质聚集物构象结合。在某些情况下,样品是含有先兆子痫相关的蛋白质聚集物的 尿液样本,其中含有免疫球蛋白,二级抗体可以预先吸附Ig,以降低或者防止二级抗体与 含有免疫球蛋白的蛋白质聚集物的非特异性结合。
    这些试剂盒,在一些实施方案中,也可以含有其他组成部分,例如一种缓冲剂,一种 防腐剂,或者一种蛋白质稳定剂。试剂盒还可以包含另一种组分用于检测可检测的标记的 (例如一种酶或者一种底物)。
    试剂盒的每一个组成部分都可以用一个独立的容器盛装,并且所有不同的容器都可以 放在一个包装中,其中包括用于解释检测结果的使用指南。容器可以预先用稳定剂处理, 稳定剂也可以作为试剂盒的一个组成部分。
    实施例
    实施例1
    方法
    尿液样品刚果红斑点印迹实验步骤(红点测试)
    1.将收集的尿样离心。1500g,15分钟,4℃
    2.使用Pierce BCA试剂盒(Thermo Scientific Cat#23225)测量离心后尿样中蛋白浓度。为 了测量蛋白,尿液样本可能需要稀释12倍。从潜在具有先兆子痫风险的女性处得到的尿 样的蛋白质浓度变化很大,根据体内含水情况,健康人尿液中蛋白水平也有很大变化。因 此,最好能够使总蛋白浓度一致化。在超过680个女性尿样中,只有约5%(37/681)的总 蛋白不足2mg/mL。约60%的尿样中含有超过6.6mg/mL的总蛋白。总体来说,在大多数 情况下没有干燥样本的必要,例如使用SpeedVac。干燥方法已经得到检验,其结果证明, 干燥不能改变样品的红色斑点印迹结果。为了保持一致性,在所有测试中均使用了 SpeedVac干燥。
    3.锥形离心管中加入一定体积的样品,使其中含有200μg蛋白。使用SpeedVac离心至干 燥。
    4.准备刚果红储备液(5mg/ml)。刚果红(Sigma,Cat#C6277)溶于水。14,000g离心10 分钟,分离未溶解的粉末。储备液应当是新鲜制备的,而且应当在制备后一小时内使用(例 如,加入尿样)。也可以选择通过稀释储备液50倍制备刚果红工作溶液(0.1mg/ml)。
    5.在0.1mL PBS中加入2μl刚果红储备液,作为空白样本。
    6.将干燥后的尿液样本从SpeedVac上取下,加入30μl刚果红工作浓度溶液,震荡混匀。
    7.使用震荡器将样本剧烈震荡1小时,使刚果红与样本结合。
    8.一小时后,在硝酸纤维素膜(0.2微米孔径)上用5μl混有刚果红的样品点双点。每一 点应当含有33.3μg蛋白。同时点空白样本。如果使用超过一张膜,则每一张膜上都需要有 空白样本点。最好每一次测试都加入阳性对照。在透照仪前加上格子,再将硝酸纤维素膜 放在透照仪上进行点点,可以使每个点分布整齐,从而能够跟踪每一个样品的位点。
    9.让膜干燥15分钟。
    10.在水中洗涤3分钟
    11.拍照(所有点此时应当具有相似的染色强度)
    12.在50%的甲醇中洗涤3分钟,在70%的甲醇中洗涤1分钟,最后在90%甲醇中洗涤, 直到空白样本中的红色消失(通常7到10分钟)。
    13.拍照(各点染色强度,例如阳性对照和空白样本,应当看起来有所不同)。
    14.在甲醇洗涤前后分别扫描图像,并且计算每一点的光密度(OD)。使用任何一种密度 测量软件均可,例如NIH Image J。
    15.计算所有样本的刚果红结合百分比(CRI),计算方法为:(同一样本甲醇洗涤之前的 平均OD值/同一片膜上空白样本的平均OD值)X 100。
    16.计算所有样本的刚果红保留百分比(CRR),包括空白样本。计算方法为:(同一样 本甲醇洗涤之后的平均OD值/同一样本甲醇洗涤之前的平均OD值)X 100;随后,从所 有尿样斑点值中减去空白样本的CRR。如果甲醇洗涤彻底,空白样本的斑点不应有任何残 留的红色,其OD平均值应当为0。
    17.将CRR>20%的红色斑点定为测试阳性,CRR<15%的称为阴性。
    18.如果CRR在15%到20%之间,则重复测试。根据测试结果,被分析的223个样本的诊 断和预后诊断分界线在大约16.1%。
    应当注意使所有孵育和准备(例如离心)的时间、体积、浓度都接近最佳值。不过,不同 的时间、体积和浓度也可以得到可靠的测试结果,而且可以通过不是太多的试验就可摸索 出来,因此上述孵育和准备的时间、体积、浓度并不是限制性的,更进一步,所有这里描 述的可能用到化学物质和/或仪器都没有特殊限制,其它等价化合物和/或仪器也可以使用。 另外,请注意某些步骤具有选择性,步骤之间的顺序可以改变,某些步骤可以删除或者合 并。这些改变对于具有常规技术的人都将是显而易见的。例如,孵育时间不足1小时(步 骤7),在尿样中加入非变性溶剂(例如Tween20),或者用乙醇、异丙醇替代甲醇进行 洗涤,都可以得到可靠的测试结果。
    研究设计:
    将招募到的110名女性按照预先设定分为3组:血压正常对照组(CRL n=49,GA:28 【21-34】周);慢性高血压组(cHTN n=12,GA:29【24-34】周)和严重先兆子痫组(sPE n=49,GA:30【24-34】周)。另外,34名属于先兆子痫高危人群、但无症状的孕期女性 被长期追踪观察。尿样刚果红染色情况通过使用等量蛋白进行斑点印迹固定和光谱漂移测 试(spectral shift assay)被量化。被染色的蛋白通过串联质谱被鉴定,并且通过Western 杂交被验证。使用SELDI-TOF生成了尿液蛋白组指纹。胎盘蛋白刚果红染色通过极化显 微镜检测。
    结果
    图1展示了刚果红斑点检测的硝酸纤维素膜在洗涤前(左)和洗涤后(右)的照片(硝 酸纤维素膜上点样量为5μl/点)。正如图中所示,在洗涤前刚果红对各个样品的染色情况 一致,但是洗涤后染色只针对患有严重先兆子痫的女性尿液样本(此时空白样本为阴性对 照)。图2展示了对一组横向比较的尿液样品(24个样本)进行了刚果红点测试后(33μL/ 点加到硝酸纤维素膜上)洗之前和洗之后的情况的一张照片。被带方框数字标注的样本来 自于被确诊患有严重先兆子痫的女性(sPE)。如图中所示,在洗涤前,刚果红对各个样 本的染色情况相似,但是洗涤后只针对患有严重先兆子痫的女性尿液样本。图3展示了对 一组纵向比较的尿液样品(28个样本)进行了刚果红点测试后(33μL/点加到硝酸纤维素 膜上)洗之前和洗之后的情况的一张照片。在整个妊娠过程中全程跟踪了六个孕妇,多次 抽取尿液进行分析。2号患者和5号患者之后患上先兆子痫。5号患者带有方框的样本采 自临床确诊发病时期。样品U348i和U348j是在由于先兆子痫而进行有医学指征分娩(紧 急剖腹产)后取得的样品。如此处所示,早在她们被确诊患有先兆子痫之前,二位患者就 已经具有异常的刚果红斑点尿样检测阳性结果(红点为阳性)。图14展示了在纵向跟踪 组病人中预测因先兆子痫而进行有医学指征分娩的曲线。通过刚果红测试对36名处于高 危(n=30)或低危(n=6)的女性进行测试。其中,这一组的四人患上严重先兆子痫,进 行了有医学指征分娩。这里的数据显示,之后患上先兆子痫的女性的第一次测试样本中即 具有高尿液嗜刚果红性。我们无法取得更早的样本,以确认这些女性是否在孕前就具有这 样的阳性结果。图4为柱状图,展示了患有重度先兆子痫(sPE)、慢性高血压(cHTN) 和正?;吃?CRL)的孕妇的刚果红保留值(CRR)。其中刚果红保留值经过针对总蛋白 质浓度的均一化处理。如图所示,CRR明显与重度先兆子痫有关,并且具有很好的指示作 用。尿样在患者确诊患有重度先兆子痫后入院时被测试。图5显示了以下几组的刚果红保 留值和刚果红结合值系数的ROC曲线:A)确诊先兆子痫,B)预测到因先兆子痫而进行 有医学指征分娩(223个尿样,从114名不同孕妇处获取),一些女性在怀孕期间做了连 续的尿样分析。图6显示,尿液蛋白的刚果红保留值与先兆子痫的存在和严重程度紧密相 关,正如使用异常蛋白组学图(UPSr)分析的结果。
    图7显示,尿液蛋白的刚果红保留值与比率值uFP相关联,uFP:log[sFIt-1/PIGF x100], 正如此处和U.S.Publ.No:US-2006-0183175;PCT/US2005/047010所描述。图8显示,与其 他疾病中错误折叠的蛋白类似(例如阿尔茨海默病和阮病毒病),先兆子痫症尿液中的错 误折叠蛋白也可以用相同方法分离出来:比如(A)利用刚果红亲和性进行斑点印迹(方 框中的样本来自被临床诊断患有重度先兆子痫的女性,如前所述)(B)凝胶过滤,或者 (C)离心,并将沉淀下来的刚果红结合蛋白用水洗涤(例如,针对(B)和(C))。
    在进一步的实验中,胎盘组织切片被刚果红染色。在有先兆子痫的切片中出现云状双 折射物质积聚在syncytiotrophoblasts,而对照组合体中没有。图15A显示来自三名女性的 胎盘组织切片,其中两人因重度先兆子痫而早产(A-F),另外一人为突发性早产(对照, G-H)。这些切片使用刚果红染色,然后在显微镜下使用白光(A、D、G)或者极化光(B、 C、E、F、H和I)观察,C组和F组分别是B组和E组中方形部分的进一步放大(640x)。 如B和E中所示,患有先兆子痫的女性胎盘显示出云状灰蓝色(B和C)或者灰绿色(E 和F)双折射物质积聚在合体(syncytiotrophoblast)层(红色箭头)。组I:阿尔茨海默病 患者脑部切片的极化光图像,在相同条件下使用刚果红染色。
    图15B显示先兆子痫患者尿样中对刚果红有阳性反应的沉淀物图像。在与刚果红结合 并离心之后,沉淀物(A)被水洗涤三次(洗涤之间重复离心),用一滴水重悬,然后放 在载玻片上使用显微镜极化光观察(B),或者在用1%醋酸铀(uranyl acetate)染色后放 置在电子显微镜的网格上,染色可以为(C)阳性或者(D)阴性。箭头指向一种非细胞结 构,很可能是原纤维。
    在进一步的实验中,刚果红染色的物质,同那些对构象抗体有免疫活性的条带一起走 SDS凝胶电泳,并且用质谱分析。在先兆子痫患者的尿蛋白和对构象抗体有免疫活性的条 带中都检测到了抗胰蛋白酶、血浆铜蓝蛋白、IgG的重链和轻链的片段。对嗜刚果红性物 质进行针对SERPINA1的Western印迹试验,观察到许多能与抗体反应结合的梯度分布的 片断。Western印?;虬叩阌〖J匝橐蚕允鞠日鬃羽锘颊吣蛞褐泻醒兜鞍缀?IFI6-16。ELISA验证了轻链的存在。图16展示了从两名重度先兆子痫患者处取到的尿液 样本(U647和U648),它们被加载在双重4-20%还原性SDS PAGE胶上,部分通过刚果 红亲和沉淀富集错误折叠蛋白(3、4道和7、8道,红色星号),部分没有富集(1、2道 和5、6道)。左图为胶经过考马斯亮蓝染色后总蛋白的情况(1-4道)。在刚果红沉淀后 的样本中,很多新的条带变得可见。右图为转移到硝酸纤维素膜上蛋白对丝氨酸蛋白酶抑 制剂A1(SERPINA1)的免疫活性。在7、8两道可以见到额外的梯状片段图形,但是5、 6中不可见。每一组都有分子量标记物。
    这同时暗示,刚果红可以被用来有效浓缩生物样本(此处为先兆子痫患者尿样)中的 错误折叠蛋白和聚集蛋白,从而做进一步研究。
    总之,数据显示先兆子痫的特征是尿样中,与CRL和cHTN相比嗜刚果红性蛋白显著 增加,而与GA无关(P<0.001)。在纵向长期观察组中,那些因患上重症先兆子痫而早 产的女性(n=4)的尿液中,嗜刚果红性蛋白在临床症状出现前8-10周就已经出现。刚果 红与先兆子痫尿样中蛋白结合后,产生光吸收中的红移现象,与其他淀粉样超分子蛋白结 构中观察到的现象类似。尿液刚果红亲和性结果与先兆子痫的蛋白质组文库特征相关(r= 0.89,P<0.001)。
    上述数据证明,先兆子痫是一种以淀粉样超分子蛋白质聚集物和尿液中的嗜刚果红性 蛋白为标志的妊娠期疾病。通过斑点印迹和光谱漂移测试鉴定尿液中的嗜刚果红性蛋白, 可以查出患有先兆子痫的病人,并且提供了一种诊断方法。通过上述方法检测出的尿液嗜 刚果红性蛋白聚集物,不仅可以诊断已经存在的先兆子痫,同时也可以预测未来是否会发 展为先兆子痫(临床结果)。作为检测尿液中嗜刚果红性蛋白聚集物的补充,胎盘组织样 本的刚果红染色结果也显示出此类蛋白聚集物的标志性特点。在胎盘组织中使用刚果红染 色的方法同样可以应用在先兆子痫的诊断中。
    应该明白的是,除了刚果红,也可以使用这一领域中多种其它化学试剂和方法来检测 分析蛋白聚集物(例如,硫代核黄素)。
    实施例2
    方法
    研究设计:
    将预先招募到的347名女性按照预先设定分组:血压正常对照组(CRL n=98,GA:27 【7-42】周);慢性高血压组(cHTN n=40,GA:32【11-41】周);妊娠期高血压组(gHTN  n=8GA:37【26-39】周);轻度先兆子痫组(mPE n=36,GA:36【24-41周】);严重 先兆子痫组(sPE n=117,GA:32【22-42】周)和叠加型先兆子痫(spPE n=33GA:33【18-40 周】)。另外,35名无症状的孕期女性在全部妊娠期被长期追踪观察,并进行一系列测试。 刚果红斑点测试通过等量化尿蛋白进行标准化,在几分钟内通过刚果红保留值百分比进行 客观量化。CRR通过与蛋白-肌酐比例(P/C)相比对因为先兆子痫而进行有指征分娩(IND) 的预测能力进行评判,如此处以及(U.S.Publ.No:US-2006-0183175;PCT/US2005/047010) 所述。
    结果
    先兆子痫的特征是,对偶氮染料刚果红(CR)亲和的错误折叠蛋白的分泌增加。刚果 红染料也被用于检测阿尔茨海默病和阮病毒病中异常的淀粉样蛋白聚集物。刚果红斑点测 试CRR被设计并证实为一种以尿液嗜刚果红性蛋白为基础的先兆子痫诊断和预后诊断方 法,它的原理为检测妊娠期间某一尿液样品中错误折叠蛋白整体情况或总量。图9A显示 不同实验组尿液蛋白的CRR值(CRL:对照;cHTN:慢性高血压;gHTN:妊娠期高血 压;mPE:轻度先兆子痫;sPE:重度先兆子痫;spPE:叠加性先兆子痫)。61%(211/347) 的女性具有IND:CRL:4%;crHTN:40%;gHTN:75%;mPE:69%;sPE:99%;spPE: 100%。77%(162/211)的IND女性为早产,51%(107/211)少于34周。在mPE中,CRR 有所上升,在sPE和spPE中上升更加明显,与GA值无关。有指征分娩的女性在加入本 研究时即有CRR升高(图9B,P<0.001)。图9C显示,在被长期跟踪观察的女性中,11% (4/35)进行有指征早产(IND)。在这一组中,CRR在临床诊断出先兆子痫症状之前14±4 周就开始升高。与尿样sFlt1/PlGF(P=0.014)和尿蛋白/肌酐比例(P/C)相比,CRR对于 IND的预测准确性更高(图9C)。
    总之,通过CRR判断总体蛋白错误折叠情况是一种简单的先兆子痫诊断和IND预测 方法,IND是对早产的重要原因之一。
    实施例3
    方法
    研究设计:
    将招募到的111名女性的尿样分为3组:严重先兆子痫组(n=49,GA:28±1周); 慢性高血压组(cHTN n=12,GA:29±1周)和血压正常对照组(CRL n=50,GA:28±1 周)。等量的尿蛋白被用于斑点印迹检测。这里用到三种构象特异性抗体,分别识别前体 纤维可溶寡聚链(A11,Invitrogen),环形原纤维(Officer)或者纤维(OC)。通过删除 主要抗体的方法可以验证特异性。聚集物蛋白的组分通过质谱鉴定,并且使用Western杂 交和序列特异性抗体验证。
    结果
    蛋白构象异常引起的疾病,例如阿尔茨海默病、轻链淀粉样变性和阮病毒病,会因淀 粉样纤维的形成和聚集物而恶化。这种聚集物由细胞蛋白错误折叠为异常3D结果导致。 可溶前淀粉样寡聚链(纤维聚集的中间体)具有蛋白毒性效果,导致内皮损伤和氧化压力。
    先兆子痫病理学中的一些重要特征是心血管内皮的活化,以及随后的血管痉挛。关于 其起因的理论包括胎盘的异常植入和发育、氧化压力、内皮前列腺素和一氧化氮平衡异常、 基因多样性、自体抗体循环异常和母体系统化炎症反应的异常(Buhimschi IA等人,Hum  Reprod Update 1998;4:25-42;Ward K等人;Nat Genet 1993;4:59;Wallukat G等人,J Clin  Invest 1999;103:945-952;Fass MM等人,Am J Obstet Gynecol 1994;171:158-64;Roberts  JM等人,Lancet 1993;341:1447-51)。鉴于内皮损伤和氧化压力在重度先兆子痫中扮演 致病角色,尿液中可溶前体淀粉样寡聚蛋白与先兆子痫之间的关系特性被鉴定并分类。
    被用于检测尿液可溶前体淀粉样寡聚蛋白的抗体可以检测包括如下几种构象的蛋白: i)前体纤维可溶寡聚构象,例如“A11”抗体等。ii)环形原纤维构象,例如“Officer”抗体等, 以及iii)纤维构象,例如“OC”抗体等。
    包括尿蛋白聚集物在内的尿液斑点杂交显示出一个问题,即非特异性A11抗体结合。 随后发现(借助尿蛋白样本的质谱分析),样本中尿蛋白聚集物同时包括错误折叠的人类 免疫球蛋白(IgG)的重链和轻链,正是它们被大多数二级抗体非特异性识别(例如与之 发生交叉反应)。在筛选了大批二级抗体的特异性之后,人们发现,使用被IgG预先吸附 过的二级抗体是保证特异性的关键。
    当使用A11多克隆抗体检测尿蛋白聚集物实验中的二级抗体被人IgG预先吸附过后, 由于二级抗体与尿蛋白聚集物中错误折叠蛋白和免疫球蛋白(IgG)轻重链的非特异性结 合减少,检测的敏感性大幅度上升。使用这种检测方法,A11测试是否为阳性将与症状的 严重程度相关。图10为使用A11、OC和Officer三种多克隆抗体对尿样斑点探测后进行 Western印迹的硝酸纤维素膜的照片。这三种多克隆抗体(A11针对广泛的构象,OC针对 纤维型,Officer针对一些环形结构annular)表现出针对先兆子痫患者样本的免疫活性(图 中所示为,尿液、血液、脑脊液(CSF)和胎盘破碎液;PE:先兆子痫;CRL:对照组)。 Officer抗体被认为对于在RBC类似物中可能与类淀粉样蛋白通道一起形成通道或空洞的 蛋白构象有特异性,从而可能解释先兆子痫病人的溶血现象。尿液、血液、脑脊液和胎盘 破碎液也经过了测试。数据显示,先兆子痫是一种构象异常,其特征是淀粉样蛋白的沉寂。 同步进行A11和Officer染色表明,错误折叠的蛋白中间体具有聚集成为空洞样结构的倾向 (类淀粉蛋白通道),这可能与临床疾病表现有关。
    图11展示了3组女性尿液斑点测试的代表性结果。这3组分别是:先兆子痫组(PE)、 cHTN和对照。每一个斑点包含40mg尿蛋白。箭头标出样本点的位置。将膜与样本使用 框架对比,样本的位置被黑色圈标注。结果表明,许多患有先兆子痫并具有刚果红染色阳 性结果的女性,其尿样具有A11免疫活性,虽然并非所有刚果红阳性的女性都具有。这一 数据表示,A11阳性与症状的严重程度相关。
    患有重度先兆子痫的女性尿液表现出A11和Officer免疫活性的上升(sPE:42±8, cHTN:9±6,CRL:3±1U/μg,P<0.001),但是不包括OC,上述结果与GA值相独立。 尿液A11和Officer斑点测试结果的强度与高血压(P=0.007)和蛋白尿(P=0.005)的严重 程度相关。
    在进一步实验中,检测了PE尿液中哪种蛋白质参与形成了被A11识别的聚集物。两 个高分子量、且为A11阳性的条带被从非还原性SDS PAGE胶上切下。使用胰蛋白酶消化, 随后将样本送入Keck仪器进行sPE尿液中蛋白质可溶寡聚链的鉴定。下述鉴定结果得到 了质谱的验证:免疫球蛋白的重链和轻链、铜蓝蛋白和干扰素诱导蛋白6-16蛋白(GIP3, IFI6-16),其中干扰素诱导蛋白被发现与阿尔茨海默病presenilin-2蛋白相互作用,调节细 胞凋亡。先兆子痫尿液斑点测试中,IFI6-16的出现被其抗体验证。这一抗体是小鼠多克隆 抗体,来自Novus Biologicals Inc,Littleton,CO.,编号为H00002537-A01。
    上述研究结果,即,先兆子痫患者尿液中蛋白具有A11抗体免疫活性,这些蛋白包括 免疫球蛋白的重链和轻链、铜蓝蛋白和干扰素诱导蛋白6-16蛋白(GIP1,IFI6-16),证 明了胎盘和/或尿液中的一种或多种此类蛋白聚集物的量化同样可以应用在先兆子痫的诊 断与预后诊断。
    实施例4样本评估
    抗原和抗体的准备方法根据Kayed等人的文章“Fibril specific conformation dependent  antibodies recognize a generic epitope common to amyloid fibrils and fibrillar oligomers that is  absent in prefibrillar oligomers”Molecular Nuerodegeneration 2007,2:18中,文中描述为:
    纤维抗原制备方法为:在50%HFIP/H2O、0.02%叠氮化钠中搅拌2mg/ml的Aβ42肽7 天。随后,将HFIP在氮气气流中蒸发净,再将样本搅拌7天,使用PBS透析(分子量分 界线为10,000Da)。所得的纤维通过EM检查,其纯度通过使用抗寡聚蛋白的抗体检测, 以不含寡聚蛋白为准??乖挥迷诟街恍挛骼及淄?Pacific Immunology Corp.,Ramona, CA,92065)免疫,采用经过IACUC认证的方法。每一只兔子被500μl完全弗氏佐剂(CFA) 中的抗原免疫,随后每隔4周使用500μl不完全弗氏佐剂(IFA)中的抗原进行加强免疫, 一共加强两次。
    纤维和寡聚链的准备:在室温下,将0.3mg冻干的Aβ42溶解在150μl六氯异丙醇 (HFIP)中10-20分钟,制备Aβ纤维和纤维寡聚物。将所得的Aβ溶液加入DD水中, 配制成80μM的浓度,置于有机硅离心管中。经过室温10-20分钟的温育之后,将样品离 心15分钟,使用14000×G的转速,上清部分(pH 2.8-3.5)被转移到新的有机硅管中, 并且置于氮气弱气流中10分钟,以蒸发HFIP。之后,在500RPM条件下使用Teflon包被 的微小搅拌棒搅拌样本24小时,温度为22℃。这一方法初始是为制备A11阳性纤维前体 寡聚物,但是近期的更多研究表明,这个方法同样可以制备OC阳性的纤维寡聚物(Kayed 等人,“Common structure of soluble amyloid oligomers implies common mechanism of  pathogenesis”,Science 2003,300(5618):486-489)。通过4℃以100000×G的转速离 心一小时,分离纤维和纤维Aβ42寡聚物。含有纤维状寡聚物的上清和含有纤维的沉淀被 分离并收集。用等量的水将沉淀重悬?;蛘?,使用1mg冻干的Aβ42,溶解在200μl的DMSO 中,室温放置10-15分钟,使之形成纤维寡聚物。DMSO中的纤维寡聚物根据其大小, 使用pH为7.4的10mM的磷酸,通过TSK-GEL SuperSW2000柱进行分离(Tosoh  Bioscience LLC),设定流速为0.3ml/分钟。
    结果
    因为A11抗体对寡聚形态的蛋白没有特异性,使用单克隆抗体再做进一步确认将提供 更多的有用信息。因此,A11阳性和阴性的尿样都使用一组单克隆抗体进行检测,它们和 A11抗体由同样的抗原诱生(Science 300:486-489,2003),但是相比与A11,这些单 克隆抗体对于不同类型的纤维前体蛋白寡聚物构象具有不同的亲和力和倾向性。我们得到 了10个尿样的测试条带,这些样本来自患有先兆子痫(PE)的女性或者对照组(CRL) 女性。图12显示耶鲁实验室得到的A11免疫活性结果(条带1)。条带2使用了同样的试 剂和方法,不同的是,A11抗体被删去,并作为对二级抗体非特异结合的对照。其余条带 被送到UC Irvine的实验室。
    图13的照片为经过Western印迹之后的硝酸纤维素膜上的尿样斑点(PE:先兆子痫; CRL对照)。这些样本分别使用了单克隆抗体(M204,M205,M118,M09,M55)和多 克隆抗体A11(A11),以及不含一级抗体的阴性对照(Neg.),以对比二级抗体的非特 异性结合。这一实验提供了独立的确证,证实A11抗体对于先兆子痫尿液具有免疫活性, 并且表明某些更具有选择性的单克隆抗体同样表现出免疫活性。这些发现表明,识别不同 纤维前体蛋白寡聚物构象的单克隆抗体,例如单克隆#M204,#M205和#M89,都可以 用于先兆子痫的诊断。
    从患有先兆子痫的女性处取得的尿样,可以被单克隆抗体M204强烈染色,被M205 轻微染色,但对照组不具备这一特点。其中一部分先兆子痫样本也会被识别环形原纤维的 M89抗体染色。图13显示的样本中,被M89染色最深的PE病理同时也是具有与HELLP (#4病例)相符合的早期临床退化情况。相反的是,#6病例(对M89染色为阴性,但 是对M204、M205和A11为阳性)患有重度先兆子痫的诊断仅仅基于肺部积水这一单一 标准,而其他PE女性多是通过血压或者尿蛋白被确诊。#6病例随后发展成围产期心肌病, 并因此需要重症监护病房的强力循环系统支持。对M89染色的差异提示,#6病例可能具 有独特的病因,并且也许能够通过构象单克隆抗体,例如抗环形原纤维的单克隆抗体09 和89,的不同免疫活性区分这些疾病。
    实施例5抗体的制备
    两只新西兰白兔被注射了抗原,其中含有通过羧基末端巯酯将末端巯基连接到金颗粒 胶体的Aβ1-40。一百微克的多肽聚合抗原与不完全弗氏佐剂一同注射,并且使用相同的 抗原每隔3周进行加强注射,持续约5个月。待免疫响应被确认与A11抗体的响应等值后, 一只动物被处死,其脾脏被收集并且其中的淋巴细胞通过标准方法被用于制备杂交瘤细 胞。
    培养杂交瘤细胞足够长时间之后,多克隆井中的上清液被取出,并从中筛选构象依赖 型纤维前体寡聚物特异性的抗体,此处使用Aβ纤维前体寡聚物作为初始筛选试剂。Aβ单 体、纤维前体寡聚物和纤维被用于第二轮筛选,以去除不具备构象依赖性,与各种Aβ构 象都相互作用的抗体。大约118个多克隆井因具有超过标准值0.5AU的免疫活性而被选出。 这些多克隆被进一步分类,所得的单克隆通过Aβ单体、纤维前体寡聚物和纤维进行进一 步筛选和鉴定。
    在第二轮筛选之后,对纤维前体寡聚物或者纤维具有独特倾向性的克隆被筛选出来。 具有代表性的克隆通过与A11多克隆抗体以及6E10,一种序列特异性鼠单克隆抗体对比 被挑选出来。通过斑点印迹测试抗体的构象特异性和序列特异性。斑点印迹测试包括1μg Aβ单体、纤维前体寡聚物和纤维,以及1μgαsynuclein纤维前体寡聚物、免疫球蛋白轻 链、朊病毒106-126多肽段、KK(Q40)KK和降钙素。A11多克隆抗体与所有类型的纤 维前体寡聚物作用,但是不与Aβ单体和纤维作用。6E10只识别含有Aβ的样本??寺?18、 201、204、205和206对纤维前体寡聚物有特异性,但是不识别单体或者纤维。这一组克 隆表现出针对其他被识别的纤维前体寡聚物的独有特异性??寺?21特异性识别Aβ纤维, 但是不识别任何一种纤维前体寡聚物或者Aβ单体。
    很多克隆分泌具有相同特异性的抗体。其中最多的类型是与克隆201相似,即只识别 Aβ纤维前体寡聚物,不识别其他类型的寡聚物。所有这些克隆同时也是IgM??寺?18同 克隆48和55也无法区分(数据未给出)
    以下列出了两种单克隆IgG,即118和204的序列信息。多变区的氨基酸序列是不同 的,与它们不同的特异性相符。
    #118kappa VI+Cl
    AQAAELVMTQTPASVSAAVGGTVTINCQSSESVYNSRLSWFQQKPGQPPKLLIY FASTLASGVSSRFSGSGSGTEFTLTISGVQCDDAATYYCAGHFSNSVYTFGGGTE VWTGDPV APTVLIFPPSADLVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTG IENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC* (SEQ ID NO.7)
    #118Vh+Clh
    AAQPAMAQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSAYEVSWVRQAPGKGLEWI GIIYANGNTVYASWAKGRFTISKTSTKVDLRIPSPTTEDTATYFCARDIYTTTTNL WGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTHSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNS GTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPS TCSKTSC(SEQ ID NO.8)
    #204kappa VI+Cll
    AQAAELDMTQTPASVSEPVGGTVTIKCQASQSISSYLAWYQQKPGQRPRLLIYET STLASGVPSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQSTYENPTYVSFGGGTEV GVKGDPVAPTVLIFPPSADLVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGI ENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC* (SEQ ID NO.9)
    #204Vh+Clh
    AAQPAMAQSVKESGGRLVTPGTPLTLACTVSGFSLNTYSMFWVRQAPGKGLQ WIGIISNFGVIYYATWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCVRKYGSEWG GDLWGPGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVT WNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKT VAPSTCSKTSC(SEQ ID NO.10)
    #205kappa VI+Cll
    AQAAELVMTQTPSSVSAAVGGTVTISCQSSESVYNNNYLSWYQQKPGQPPKRLI 30DSASTLDSGVPSRFKGSGSGAQFTLTISDLECDDAATYYCAGAYVNWMRIFGGG TEVVVKGDPVAPTVLIFPPSADLVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQT TGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGD C*(SEQ ID NO.11)
    #205Vh+Clh
    MAQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGFSLINYYMNWVRQAPGKGLEWIGLITG WADTYYANSAKGRFTISKTSSTTVDLKITSPTTDDTATYFCVRGGHTNIISLWGP GTLVTVSSGQPKAPSVFPLPPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLT NGVRIFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSK TSC(SEQ ID NO.12)
    针对Aβ寡聚物和纤维的单克隆抗体:
    虽然多克隆对于不同聚集形式的类淀粉蛋白的免疫应答具有很强的特异性,但是单克 隆抗体在确定类淀粉蛋白聚集物精细结构变化、鉴定聚集物的结构和病理重要性上具有独 特的优势。我们在初期关注的是针对纤维前体类淀粉蛋白抗原簇的抗体,但是使用金胶体 偶连的Aβ免疫小鼠,如同我们制备A11。我们尝试通过使用4个不同品系的小鼠,在两 个不同供应商处制备小鼠单克隆抗体。虽然我们在小鼠多克隆血浆中得到了构象依赖型 IgG的良好滴度,我们仍然只能从小鼠脾脏细胞融合产物中克隆分泌IgM的杂交瘤细胞。 我们尝试了不同的免疫途径,进行6个月的免疫注射,并使用不用来源的淋巴细胞(外周 和淋巴结),但是我们一直未能得到IgM以外的克隆。无法从小鼠杂交瘤细胞中得到分泌 IgG的克隆的原因仍然未知。虽然这些IgM克隆具有一定的用途,但是在很多应用条件下 并不适合,所以我们与Epitomics,Inc签约,制备兔单克隆IgG。尽管我们使用了和获得 小鼠单克隆抗体时相同的抗原和筛选方法,我们得到了更多的阳性独立克隆(>200),其 中的许多个都是IgG克隆(数据未给出)。这中间的许多克隆具有相似的表型,并且被归 入我们目前鉴定了的6个不同的组中。(图1)
    我们得到的单克隆抗体的特异性值得关注,主要由于以下几个原因(图1)。尽管我 们都是用Aβ单体、寡聚物和纤维来筛选与之作用的抗体,所有通过注射A11AβC端巯酯 连接金胶体而得到的单克隆抗体,都具有构象特异性。没有一种克隆识别类似6E10单体。 这表明,针对固态抗原的免疫应答具有高度构象特异性。没有任何抗体可以同时识别纯纤 维和纯寡聚物样品,表明这些抗原决定簇的分布相互排斥。第二,大部分抗体(M118, M204,M205,M206)识别“通用抗原决定簇”,它们分布于从其他蛋白和肽链序列得到的 纤维前体寡聚物。但是,在这一组识别“通用”纤维前体寡聚物抗原决定簇的抗体中,抗体 识别的寡聚物类型有相当大的差异。所有的通用单克隆抗体识别Aβ寡聚物,因为它们被 用于第一次筛选,但是每一个抗体都具有比A11多克隆免疫应答更加严格的特异性。例如, M204可以强烈识别大多数的寡聚物,但是与免疫球蛋白轻链寡聚物的反应明显较弱。M205 与αsynuclein和轻链寡聚物反应强烈,但是与阮病毒106-126、聚合Q以及降钙素寡聚物 不反应。M118倾向于轻链和聚合Q,但是对synuclein、阮病毒或者降钙素寡聚物没有作 用。这些结果显示,在这一类群中广泛分布的纤维前体寡聚物中带有多种不同的抗原决定 簇,而单克隆抗体可以识别这些独特的抗原决定簇。第三,一些单克隆抗体同时具有构象 依赖性和序列特异性。M201只识别Aβ寡聚物,而M121只识别Aβ纤维。M118、M204 和M205是IgG,其他抗体是IgM。
    实施例6
    单克隆抗体由Epitomics,Inc在兔子中制备。新西兰白兔被注射了Aβ环形原纤维,使 用Kayed等人在J.Biol.Chem.2009(1)中描述的方法制备。纯净的Aβ环形原纤维以Aβ纤 维前体寡聚物为起始材料制备,寡聚物的制备方法如前所述(2)。APF通过在纤维前体 寡聚物溶液中加入5%(体积比体积)正己烷制备,每隔5分钟样本被涡旋震荡混合器混 合1分钟,总共用时50分钟。随后,样本在水中被透析,使用MW分界为10kDa的透析 膜。兔子共被注射了7次,每次注射500μg的Aβ环形原纤维,相隔3周。筛选其血浆中 的环形原纤维特异性滴度,具有最高滴度的兔子被选用制备单克隆抗体。所得杂交瘤细胞 的上清液首先通过ELISA筛选Aβ环形原纤维、Aβ纤维和Aβ单体。对于Aβ环形原纤维 具有超过1.0光密度,且对于Aβ纤维和Aβ单体的活性是背景级别的井被选作二级筛选。 大约100个井被选入二级筛选,筛选对象为0.1%的SDS溶液中的Aβ环形原纤维(APFs)、 α溶血素孔、Aβ纤维、Aβ纤维前体寡聚物、Aβ单体和Aβ,使用斑点杂交。结果如下所 示。
    在二级筛选中,单克隆09和89只对于α溶血素孔有免疫反应。我们同时鉴定了它们 对溶解在10mM的NaOH中的α溶血素和Aβ的免疫反应,其western印迹结果如下所示。
    单克隆抗体09和87都被发现能够与Western印迹中大约65kDa的条带反应。M87同 样与大约40kDa的条带反应。65kDa处的α溶血素条带与用于制备单克隆抗体的兔子的 多克隆血浆也有明显反应。
    1.Kayed,R.,A.Pensalfmi,L.Margol,Y.Sokolov,F.Sarsoza,E.Head,J.Hall,and  C.Glabe.2009.Annular proto fibrils are a structurally and functionally distinct  type of amyloid oligomer.J Bioi Chern 284:4230-4237.
    2.Kayed,R.,and C.G.Glabe.2006.Conformation-dependent anti-amyloid  oligomer antibodies.Methods EnzyrnoI413:326-344.
    这一发明的使用需要这一领域中常规的传统的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、 微生物学、DNA杂交和免疫学技术,除非另行说明。这些技术都在文献中有所描述。
    这一发明的应用并不局限于之前文本或者图画中描述的各组分的构建和安排。这一发 明同样可以用于其它情况,而且通过各种方法被应用。此处使用的用语和术语是以描述为 目的,不应被看作限制。对于“包括”、“含有”或者“具有”、“包含”、“涉及”等词以及其变化, 是为了包括其下列出的多个项目,或者与之等价以及额外的项目。

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