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    买重庆时时彩正规网站: 抗人神经生长因子HNGF的单克隆抗体及HNGF的定量检测试剂盒.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201510073968.1

    申请日:

    2015.02.12

    公开号:

    CN104777311A

    公开日:

    2015.07.15

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/68申请日:20150212|||公开
    IPC分类号: G01N33/68 主分类号: G01N33/68
    申请人: 北京华安科创生物技术有限公司
    发明人: 刘荷中; 霍立红; 何景昌; 乐伟; 史权威
    地址: 100085北京市海淀区上地开拓路5号A409
    优先权:
    专利代理机构: 北京海虹嘉诚知识产权代理有限公司11129 代理人: 吴泳历
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201510073968.1

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2016.08.17|||2015.08.12|||2015.07.15

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明提供一种抗人神经生长因子hNGF的单克隆抗体及hNGF的定量检测试剂盒,属于免疫学和生物技术领域。所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.8771的杂交瘤细胞所分泌。根据其特异性,本发明还提供一种人神经生长因子hNGF的定量检测试剂盒,包括酶标板,所述酶标板的微孔中包被有本发明的单克隆抗体,具有很高的灵敏度和特异性,与mNGF无交叉反应,能够精确、快速地计算出待测样品中hNGF蛋白的含量,操作简单易行。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  抗人神经生长因子的单克隆抗体,由保藏号为CGMCC No.8771的杂交瘤细胞所分泌。

    2.  分泌抗人神经生长因子的单克隆抗体的杂交瘤细胞系,其保藏号为CGMCC No.8771。

    3.  人神经生长因子hNGF的定量检测试剂盒,其特征在于:包括酶标板,所述酶标板的微孔 中包被有权利要求1所述的单克隆抗体。

    4.  根据权利要求3所述的试剂盒,还包括酶标抗体、蛋白标准品和辅助试剂;所述酶标抗体 为辣根过氧化物酶HRP标记的权利要求1所述的单克隆抗体。

    5.  根据权利要求4所述的试剂盒,所述辅助试剂包括底物显色溶液、反应终止液和清洗缓冲 液;所述底物显色溶液为底物溶液A:pH5.0,50mmol/L磷酸-柠檬酸缓冲液中含终浓度为体 积百分含量3%的过氧化氢溶液;和底物溶液B:四甲基联苯胺甲醇溶液,浓度为0.l mg/ml; 所述反应终止液为2mol/L硫酸;所述清洗缓冲液为:pH7.4,20mmol/L PBS中含体积百分含 量为0.05%的吐温20溶液。

    6.  一种检测hNGF蛋白含量的方法,其特征在于采用权利要求5所述的试剂盒,其步骤如下:
    (1)抗原-抗体反应:在所述酶标板的微孔中分别加入待测样品,然后每孔加入酶标抗体, 混匀,37℃孵育30分钟,重复洗板4次;
    (2)显色反应:每孔依次加入底物显色溶液,显色后再加入反应终止液结束反应;
    (3)比色:以空白对照孔的吸光值调零,用酶标仪在450/630nm双波长下测定OD值并记录;
    (4)获取标准曲线及其曲线方程:所述标准曲线的横坐标值为梯度浓度的蛋白标准品的浓度 值,纵坐标为采用步骤(1)-(3)的方法测得的梯度浓度的蛋白标准品的OD值;
    (5)结果判断:将测得的OD值带入所述曲线方程,计算得到各样品中hNGF的浓度。

    7.  根据权利要求6所述的方法,
    所述蛋白标准品的梯度浓度为:0,7.8125ng/ml,15.625ng/ml,31.25ng/ml,62.5ng/ml 和125ng/ml;
    所述底物显色溶液为底物溶液A:pH5.0,50mmol/L磷酸-柠檬酸缓冲液中含终浓度为体 积百分含量3%的过氧化氢溶液;和底物溶液B:四甲基联苯胺甲醇溶液,浓度为0.l mg/ml;
    所述反应终止液为2mol/L硫酸;
    所述清洗缓冲液为:pH7.4,20mmol/L PBS中含体积百分含量为0.05%的吐温20溶液;
    待测样品加入量为25μl,酶标抗体加入量为75μl,底物显色溶液加入量为底物溶液A和B 各50μl,反应终止液为50μl。

    说明书

    说明书抗人神经生长因子hNGF的单克隆抗体及hNGF的定量检测试剂盒
    技术领域
    本发明涉及一种抗人神经生长因子hNGF的单克隆抗体及hNGF定量检测试剂盒,属于免疫学和生物技术领域。
    背景技术
    神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)是由其效应神经元支配的靶组织合成和分泌的,它影响外周和中枢神经系统某些神经元的存活和分化,在神经系统的发育以及损伤和修复中具有重要作用。
    目前定量检测人神经生长因子hNGF的方法有利用R&D的DuoSet ELISA试剂盒(R&D Systems,DY256)进行检测,通过酶联免疫反应对样品中的hNGF进行定量。R&D试剂盒是以昆虫细胞表达的重组人神经生长因子为标准品,其以包被抗体包被酶联板,加入抗原后以生物素化的检测抗体结合所捕获的抗原,然后再加入链亲和素-HRP结合物反应,洗涤后显色。由于该试剂盒在双抗体夹心ELISA的基础上采用了生物素-链亲和素放大系统,虽然敏感性高,但也导致了操作繁琐,检测过程耗时长,一个实验过程需要6个小时完成。而且,由于其标准曲线范围在31.25-2000pg/ml,因此检测高浓度样品时需要高倍稀释,因而导致检测结果误差很大。
    因此,需要开发一种快速简便、灵敏度适中且特异性强的hNGF快速检测试剂盒来解决现有试剂盒存在的问题,推动有关人神经生长因子的研究、药品的开发及临床应用。
    发明内容
    根据上述领域的需要,我们制备了特异性强、敏感性高的抗hNGF的单克隆抗体,研发出一种hNGF定量检测试剂盒,解决了hNGF的快速、准确定量的问题。
    本发明请求?;さ募际醴桨溉缦拢?
    抗人神经生长因子的单克隆抗体,由保藏号为CGMCC No.8771的杂交瘤细胞所分泌。
    分泌抗人神经生长因子的单克隆抗体的杂交瘤细胞系,其保藏号为CGMCC No.8771。
    人神经生长因子hNGF的定量检测试剂盒,其特征在于:包括酶标板,所述酶标板的微孔中包被有上述单克隆抗体。
    还包括酶标抗体、蛋白标准品和辅助试剂;所述酶标抗体为辣根过氧化物酶HRP标记的上述单克隆抗体。
    所述辅助试剂包括底物显色溶液、反应终止液和清洗缓冲液;所述底物显色溶液为底物溶液A:pH5.0,50mmol/L磷酸-柠檬酸缓冲液中含终浓度为体积百分含量3%的过氧化氢溶液;和底物溶液B:四甲基联苯胺甲醇溶液,浓度为0.l mg/ml;所述反应终止液为2mol/L硫酸;所述清洗缓冲液为:pH7.4,20mmol/L PBS中含体积百分含量为0.05%的吐温20溶液。
    一种检测hNGF蛋白含量的方法,其特征在于采用上述试剂盒,其步骤如下:
    (1)抗原-抗体反应:在所述酶标板的微孔中分别加入待测样品,然后每孔加入酶标抗体,混匀,37℃孵育30分钟,重复洗板4次;
    (2)显色反应:每孔依次加入底物显色溶液,显色后再加入反应终止液结束反应;
    (3)比色:以空白对照孔的吸光值调零,用酶标仪在450/630nm双波长下测定OD值并记录;
    (4)获取标准曲线及其曲线方程:所述标准曲线的横坐标值为梯度浓度的蛋白标准品的浓度值,纵坐标为采用步骤(1)-(3)的方法测得的梯度浓度的蛋白标准品的OD值;
    (5)结果判断:将测得的OD值带入所述曲线方程,计算得到各样品中hNGF的浓度。
    根据上述方法,
    所述蛋白标准品的梯度浓度为:0,7.8125ng/ml,15.625ng/ml,31.25ng/ml,62.5ng/ml和125ng/ml;
    所述底物显色溶液为底物溶液A:pH5.0,50mmol/L磷酸-柠檬酸缓冲液中含终浓度为体积百分含量3%的过氧化氢溶液;和底物溶液B:四甲基联苯胺甲醇溶液,浓度为0.l mg/ml;
    所述反应终止液为2mol/L硫酸;
    所述清洗缓冲液为:pH7.4,20mmol/L PBS中含体积百分含量为0.05%的吐温20溶液;
    待测样品加入量为25μl,酶标抗体加入量为75μl,底物显色溶液加入量为底物溶液A和B各50μl,反应终止液为50μl。
    本发明提供一种抗人神经生长因子的单克隆抗体,所述单克隆抗体是通过使用重组人神经生长因子蛋白抗原对动物免疫、筛选杂交瘤克隆而获得的。该单克隆抗体具有特异性强、敏感性高的优点,可以在免疫组化、ELISA等多种方法中使用。
    本发明还提供能够高效稳定地分泌上述抗人神经生长因子单克隆抗体的杂交瘤细胞系,所述细胞系已于2014年01月16日以保藏号为CGMCC No.8771保藏于中国普通微生物菌种保藏中心。
    通过进一步研究,本发明还提供一种人神经生长因子hNGF的定量检测试剂盒,包括酶标板,所述酶标板的微孔中包被有本发明的单克隆抗体。所述试剂盒具有以下优点:1)以上述单克隆抗体作为捕获单抗,拥有更高的灵敏度和特异度,与mNGF无交叉反应,对样品中的hNGF定量准确,重复性好;2)试剂盒配套用的rhNGF蛋白标准品,能够精确、快速的定量 计算出待测样品中hNGF蛋白的含量,整个实验过程仅需1.5小时即可完成,与现有的hNGF检测试剂盒相比,大大缩短了检测耗时,节约了时间成本。
    本发明试剂盒还包括酶标抗体、蛋白标准品和辅助试剂,所述辅助试剂包括底物显色溶液、反应终止液和清洗缓冲液。本发明试剂盒中的酶标板是用rhNGF蛋白纯品对小鼠免疫而获得的鼠抗hNGF单克隆抗体对平板进行包被而制备的。所述平板可选用市售的酶标板,规格可以是96孔平板或12X8、12X4可拆条板。
    在优选实施例中,本发明试剂盒中的辅助试剂为:a)底物显色溶液A:50mmol/L磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.0)配制的3%过氧化氢溶液;B:四甲基联苯胺(TMB)甲醇溶液,浓度为0.l mg/ml;b)反应终止液:2mol/L硫酸;c)清洗缓冲液(20倍浓缩液,20X):20mmol/L PBS(pH7.4)配制的0.05%吐温20溶液;d)样本稀释液:2%BSA(小牛血清白蛋白)。
    本发明还提供一种检测hNGF蛋白含量的方法,所述方法采用本发明提供的上述试剂盒对样品中的hNGF定量,不仅操作简单,而且灵敏度高、特异性好,能够快速准确地计算出待测样品中hNGF的含量。在实际应用中,可以采用本方法计算发酵液中rhNGF的表达量和rhNGF纯化过程中收集液的rhNGF的含量,真实地反应出发酵液和rhNGF纯化样品中rhNGF的存在水平,与mNGF没有交叉反应,便于质量控制,从而推动hNGF的临床研究。
    生物保藏信息:
    生物材料名称:6G3
    分类命名:小鼠杂交瘤细胞
    保藏日期:2014年1月16日
    保藏号:CGMCC No.8771
    保藏机构:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
    地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所
    附图说明

    图1.免疫后小鼠血清效价检测结果
    图2.抗hNGF单克隆抗体纯化效果的SDS-PAGE鉴定
    图3.抗hNGF单克隆抗体蛋白的Western Blot结果
    图4.人神经生长因子定量检测试剂盒的标准曲线
    具体实施方式
    下面结合具体实施例对本发明进一步说明,应该理解的是,下述实施例仅用于解释本发明而不是对本发明的限制。
    BALB/c小鼠:由北京大学医学部实验动物中心提供。
    重组人NGF制品和rhNGF蛋白标准品:由本单位表达、纯化并制备(乐伟,彭璐佳,史权威,等.重组人神经生长因子的高效表达和生物活性评价研究.中国药事.2014,28(6):601-606.)。
    本发明未特别说明的实验试剂均为本领域常规试剂,可以通过商购或采用本领域常规方法制备而得,规格为实验纯级即可。
    实施例1、抗hNGF单克隆抗体的制备
    1)BALB/c小鼠免疫
    选取5只雌性BALB/c小鼠,将重组人神经生长因子(刘荷中,乐伟,史权威,等.高效表达重组人神经生长因子的CHO细胞株及其构建方法.专利号:ZL 201110004328.7)抗原与弗氏完全佐剂(SIGMA,F5881)混合,乳化完全后皮下注射,每只小鼠的免疫剂量为80μg。首次免疫后,间隔2周及3周,将rhNGF抗原与弗式不完全佐剂(SIGMA,F5506)进行乳化后重复免疫两次,小鼠尾部取血,测血清效价,选取效价高的小鼠进行融合试验。融合前3天,腹腔加强免疫1次。
    2)细胞融合及杂交瘤细胞筛选
    超净台内无菌环境下取免疫BALB/c小鼠的脾脏研磨制成脾细胞悬液,用RPMI 1640培养基洗涤2次,收取1×108脾细胞与2-5×107骨髓瘤细胞SP2/0混合于一支50ml融合管中,补加RPMI 1640培养基至30ml,充分混匀。1000r/min离心10分钟,将上清尽量吸净。在手掌上轻击融合管底,使沉淀细胞松散均匀。用1ml吸管在1分钟左右加预热至37℃的50%PEG 2000(pH 8.0)1ml,边加边轻轻转动,肉眼可见有颗粒出现,缓慢加入RPMI 1640培养基至20ml。1000rpm离心6分钟,弃去上清。前10天在HAT选择性培养基中进行培养,之后直至第一次克隆化完成前选用HT培养基培养。2周后用间接酶联免疫吸附法(ELISA法)检测融合细胞的阳性率,选出阳性值较高的孔,经有限稀释对检测出的阳性杂交瘤细胞进行克隆,连续克隆化3次使阳性克隆孔的阳性率达两次100%后,选出阳性值高的孔转孔并扩大培养并冻存?;竦昧烁咝榷ǚ置诳筯NGF单克隆抗体的杂交瘤细胞株6G3,于2014年01月16日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心,保藏号为CGMCC No.8771。
    3)抗hNGF单克隆抗体腹水的制备及抗体纯化
    采用体内诱生法大量制备单克隆抗体。取6-8周龄的健康Balb/c雌性小鼠,腹腔注射石蜡(0.5ml/只)。1周后,杂交瘤细胞离心洗涤,用PBS调整细胞数至1×106个/ml,每只小鼠注射0.5ml。5~7d后,待小鼠腹部增大,采集腹水。腹水离心后收集上清,用HITRAP Protein A HP预装柱(GE Healthcare,CAS:17-0402-01)纯化抗体,分装后于-70℃保存。
    实施例2、抗hNGF单克隆抗体性质鉴定
    1)抗hNGF单克隆抗体亚类鉴定
    采用Rapid ELISA Mouse mAB Isotyping Kit(PIERCE,Cat.No.:37503)鉴定单抗的类及亚类,按照试剂盒说明书操作。结果表明,细胞株6G3的IgG亚类为IgG1型,轻链为Kappa。
    2)抗hNGF单克隆抗体亲和力常数测定
    采用捕获抗体的方法,用GE公司生物分子相互作用分析仪Biacore 3000检测抗hNGF单克隆抗体的亲和力及结合动力学。
    表1 Biacore检测抗hNGF单克隆抗体与rhNGF抗原的亲和力 

    3)抗hNGF单克隆抗体特异性鉴定
    采用Western Blot来鉴定单克隆抗体的特异性??筯NGF单克隆抗体蛋白的纯化效果用SDS-PAGE鉴定(图2),用Gel-Pro软件分析电泳条带的结果表明,抗体纯度均不低于90%。对rhNGF和mNGF进行SDS-PAGE电泳,电转印后,用制备的单抗(1μg/ml)进行孵育,AP标记的羊抗鼠IgG作为二抗(1∶5000稀释),按Western Blot的一般步骤操作??筯NGF单克隆抗体蛋白的Western Blot实验结果如图3所示,由于人的NGF与小鼠NGF之间同源性高达89.1%,并有资料证明人与小鼠NGF之间存在免疫交叉反应,故在Western鉴定过程中也得到了相同的结果。所以我们的Western Blot检测结果显示与mNGF存在微弱交叉反应。实施例3、定量检测hNGF蛋白含量的酶联免疫试剂盒的制备
    试剂盒委托北京热景生物技术有限公司开发并组装(林长青,一种抗GP73蛋白的单克隆抗体、其制备方法和应用.专利申请号:200810181016.1;林长青.乙型肝炎病毒大蛋白前S区抗原检测试剂盒.专利申请号:200510077451.6),方法简述如下:
    1)酶标板包被:将抗hNGF单克隆抗体用50mmol/L,pH9.5的碳酸缓冲液稀释后加入酶标板的各孔,每孔100μl,吸附过夜,用吐温一磷酸盐缓冲液洗板,再用吐温一磷酸盐缓冲液封闭过夜,甩干后晾干,即获得单克隆抗体包被的酶标板。
    2)试剂盒中的酶标单克隆抗体可以用辣根过氧化物酶(HRP)标记抗hNGF单克隆抗体来制备。制备方法如下:
    a)以NaIO4-乙二醇法进行HRP的氧化,达到终浓度10mg/ml。
    b)在碱性碳酸盐缓冲液(50mmol/L,pH9.5的碳酸盐缓冲液)中透析6小时,实现HRP对抗hNGF单克隆抗体的标记,反应结束后用新鲜配制的1mg NaBH4溶液终止反应,再对PBS透析过夜。
    c)用饱和硫酸铵沉淀,获得纯化的HRP酶标抗hNGF单克隆抗体。 
    3)酶联免疫试剂盒中,辅助试剂可包括酶联反应底物溶液、显色液、反应终止液和清洗缓冲液。一种可用于上述试剂盒的辅助试剂如下:
    a)底物显色溶液:
    底物溶液A:50mmol/L磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.0)配制的3%过氧化氢溶液;
    底物溶液B:四甲基联苯胺(TMB)甲醇溶液,浓度为0.l mg/ml;
    b)反应终止液:2mol/L硫酸;
    c)清洗缓冲液(20倍浓缩液,20X):20mmol/L PBS(pH7.4)配制的0.05%吐温20溶液;
    d)样本稀释液:2%BSA(小牛血清白蛋白)。
    实施例4、酶联免疫试剂盒检测hNGF蛋白含量的方法
    重组人NGF标准品由本单位表达、纯化并制备(史权威、乐伟、霍丽红,等.基于CHO细胞表达系统的重组人神经生长因子纯化方法.专利号:ZL 201210206171.0),检测hNGF蛋白含量的步骤如下:
    制备标准曲线:
    1)抗原-抗体反应:在试剂盒提供的酶标板的微孔中分别加入25μl不同浓度(0,7.8125ng/ml,15.625ng/ml,31.25ng/ml,62.5ng/ml,125ng/ml)的rhNGF蛋白标准品,接着每孔加入75μl酶标试剂混匀,37℃孵育30分钟。重复洗板操作4次。
    2)显色反应:每孔依次加入底物溶液A,显色液B各50μl,显色10分钟,每孔再加入50μl反应终止液结束反应。
    3)比色:以空白对照孔的吸光值调零,用酶标仪在450/630nm双波长下测定OD值并记录。
    4)使用直线线性回归拟和方式进行数据处理。以各标准品的OD值减去空白对照的OD值之后的值为纵坐标(Y轴),各标准品的浓度为横坐标(X轴)作图,得到标准曲线,如图4所示。
    样品检测:与标准品检测(1)-(3)相同,检测样品的OD值减去空白对照的OD值之后,带入标准曲线方程中得到样品NGF浓度。整个检测可在1个小时左右完成。
    实施例5、定量检测hNGF含量的酶联免疫检测试剂盒的评价
    1)准确性:取本单位自制20120814批已知浓度110μg/ml的rhNGF蛋白溶液,在规定范围内,至少用25个测定结果进行评价。分别取稀释蛋白含量为25ng/ml、50ng/ml、75ng/ml三个浓度的供试品溶液各5份,按ELISA检测试剂盒检测步骤进行5次独立试验。用由 浓度为25ng/ml,50ng/ml,75ng/ml的标准品所检测得到的吸光度回归标准曲线得到的值进行回收率比较,回收率在88-105%之间。
    2)精密度:随机抽取2块包被后的板子,取本单位自制20120814批已知浓度110μg/ml的rhNGF蛋白溶液,在规定范围内,至少用25个测定结果进行评价。分别取稀释蛋白含量为25ng/ml、50ng/ml、75ng/ml三个浓度的供试品溶液各5份,按ELISA检测试剂盒检测步骤进行5次独立试验。计算每次测定结果,求出均值、标准差SD和相对标准偏差RSD(即变异系数CV)。对25ng/ml、50ng/ml、75ng/ml三个浓度25次检测结果进行统计,均值分别为21.87ng/ml、52.10ng/ml和76.95ng/ml;标准差SD分别为2.86、3.91和3.66;相对标准偏差RSD(即变异系数CV)分别为13.06%、7.51%和4.76%。精密度结果显示相对标准偏差RSD(即变异系数CV)≤15%。
    3)检测敏感度:根据上述实验操作结果统计,本试剂盒的检测敏感度为0.63ng/ml。
    4)特异性:取已知浓度15μg/ml mNGF标准品溶液(苏肽生,舒泰神药业有限公司,批号:201211148),在规定范围内,至少用25个测定结果进行评价。取稀释蛋白含量50ng/ml的供试品溶液5份,按ELISA检测试剂盒检测步骤进行5次独立试验。取25份mNGF蛋白溶液样品进行检测,均无交叉反应出现。
    以上所述,仅是本发明的优选实施例,并非对本发明做任何形式上的限制。任何本领域熟练技术人员,在本发明的技术方案范围内,凡利用上述公开的技术内容做出少许改动或修饰,应视为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明?;さ姆段?。

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    神经 生长因子 HNGF 单克隆抗体 定量 检测 试剂盒
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