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    重庆时时彩怎么改单: 一种特异识别链霉素的核酸适配子及其在链霉素检测中的应用.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201510106215.6

    申请日:

    2015.03.11

    公开号:

    CN104745588A

    公开日:

    2015.07.01

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/115申请日:20150311|||公开
    IPC分类号: C12N15/115(2010.01)I; G01N33/53 主分类号: C12N15/115
    申请人: 河北大学
    发明人: 刘中成; 樊武舫; 张艳芬; 解瑶; 赵丽君; 赵丽健; 王向欢
    地址: 071002河北省保定市五四东路180号
    优先权:
    专利代理机构: 石家庄国域专利商标事务所有限公司13112 代理人: 白海静
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201510106215.6

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2017.12.12|||2015.07.29|||2015.07.01

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种特异识别链霉素的核酸适配子,所述适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;同时,本发明还公开了利用核酸适配子定性及定量测定的链霉素方法和在食品检测中的应用。本发明以链霉素为靶物质,利用SELEX技术经亲和色谱筛选了高亲和性、高特异识别链霉素的核酸适配子,并将该适配子与胶体金比色法相结合,建立了基于寡核苷酸适配子的链霉素新型检测方法,该方法可简单、快速、准确、经济、特异地对链霉素进行定量或定性检测,可广泛应用于食品、卫生及进出口检验检疫等多个领域。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种特异识别链霉素的核酸适配子,其特征在于,所述适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示。

    2.  一种如权利要求1所述的核酸适配子用于胶体金比色法在定性及定量检测食品中链霉素的应用。

    3.  一种定性检测链霉素的方法,其特征在于,包括以下步骤:
    (a)将质量比浓度为0.01%的HAuCl4溶液加热煮沸,边搅拌边加入质量比浓度为1%的柠檬酸钠,溶液变色后,煮沸并持续10-15min,冷却至室温,得胶体金;
    (b)以45-60μL的胶体金中加入100 nmol/L的特异识别链霉素的核酸适配子的比例将两者混合,室温孵育1-2 h,制得了适配子标记的胶体金;其中所述特异识别链霉素的核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示;
    (c)在适配子标记的胶体金中加入待测样品,若溶液颜色为酒红色,则待测样品中链霉素浓度小于200 nmol/L;若溶液颜色由酒红色变为紫色,则待测样品中链霉素的浓度为200~800 nmol/L;若溶液颜色由酒红色变为蓝色,则待测样品中链霉素的浓度为大于800 nmol/L。

    4.  一种定量检测链霉素的方法,其特征在于,包括以下步骤:
    (A)将质量比浓度为0.01%的HAuCl4溶液加热煮沸,边搅拌边加入质量比浓度为1%的柠檬酸钠,溶液变色后,煮沸并持续10-15min,冷却至室温,得胶体金;
    (B)以45-60μL的胶体金中加入100 nmol/L的特异识别链霉素的核酸适配子的比例将两者混合,室温孵育1-2 h,制得了适配子标记的胶体金;其中所述特异识别链霉素的核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示;
    (C)在步骤(B)制得的适配子标记的胶体金中加入浓度分别为25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、400 nmol/L、800 nmol/L、1600 nmol/L的链霉素,室温孵育1 h,加入50 μL浓度为200 mmol/L的NaCl,在波长为A520和A620分别测定其吸光值,以链霉素的浓度为横坐标,以同一浓度链霉素所述测得的A620和A520的比值为纵坐标,作链霉素浓度与A620/520比值的曲线图,拟合其标准曲线;测定样品时,将待测样品加入到适配子标记的胶体金中,测定其在波长为A520和A620的吸光值,求A620/520比值,将其带入标准曲线中得到所对应的链霉素含量值,即为待测样品中所含链霉素的含量。

    说明书

    说明书一种特异识别链霉素的核酸适配子及其在链霉素检测中的应用
    技术领域
    本发明涉及生物技术检测领域,具体地说是一种特异识别链霉素的核酸适配子及其应用。
    背景技术
    链霉素(streptomycin)是一种广谱氨基糖苷类抗生素,可抑制革兰氏阴性杆菌和部分革兰氏阳性杆菌的,广泛应用于医药、农业及畜牧业中。但是,在实际使用中,由于使用不合理或非法使用,导致其在肉类、肝脏、肾脏、牛奶和蜂蜜等动物源性食品中的大量残留,严重地危害了人类健康,可使人产生一系列过敏反应和肾毒性、耳毒性等病症,甚至会导致失聪。因此,FDA、欧盟和我国等许多国家和地区均对链霉素的最大残留限量做了严格的规定,可见,检测链霉素在食品中是否残留以及残留量多少具有重要的意义。
    目前,链霉素残留的检测方法主要有以下三种:1、液相色谱-质谱联用检测法,该方法将色谱的分离能力与质谱的定性功能结合起来,实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析,是一种灵敏可靠的检测链霉素残留的方法,其在牛奶中的检测线可低至10 μg/kg,准确性和精确度都相对较高;但是,由于链霉素没有紫外吸收,采用色谱检测时需要进行柱后衍生或荧光标记,进样前需对样品进行前处理,操作复杂,而且所用设备昂贵,操作技术性强,费事费力;2、免疫检测法,如CN103645322 A公开了一种检测链霉素的化学发光试剂盒,包括盒体、设在盒体内的酶标板和设在盒体内的试剂,所述酶标板的各孔包被有包被抗原;所述试剂包括:链霉素单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体、链霉素系列标准溶液、浓缩磷酸盐缓冲液、浓缩洗涤液、化学发光液;酶标板选择乳白色不透明聚苯乙烯96孔化学发光酶标板,酶标板的各孔包被有以链霉素与卵清蛋白偶联制成的包被抗原;该方法操作简单,其特异和灵敏度也较高,但是,该方法存在筛选小分子链霉素抗体过程较为繁琐,不同批次性能不同,消耗时间,费用相对较高;3、微生物检测法,该方法费用较低,但其灵敏度和特异性较差,耗费时间较长,所以实际应用相对较少??杉?,当前这些检测小分子链霉素的方法并不十分完善,所以建立一种新的快速、精确、灵敏、经济的检测链霉素残留的方法是行业内积极探索的课题。
    适配子是利用指数富集配体系统进化(SELEX)技术从核酸文库中筛选获得的与靶物质发生特异性结合的寡核苷酸序列,它可特异性识别并结合蛋白、小分子、离子、细胞等靶物质。由于链霉素等小分子抗体制备较为困难,所以适配子作为检测小分子物质的分析工具,将具有广阔的应用前景。在实践应用中,适配子在诸多方面均优于抗体,如化学稳定性好、易于合成,不易变性、较低的免疫原性等;另外,适配子在基因治疗,抗传染及癌症治疗中的安全性也得到了证实。到目前为止,人们已筛选了许多小分子物质的特异性适配子,并以适配子为基础开发了一系列小分子物质的检测系统。但是,到目前为止,在国内外的研究中还没有发现关于特异性识别链霉素的适配子以及利用适配子对链霉素进行快速、准确定性及定量检测的相关报道。
    发明内容
    本发明的目的之一是提供一种特异性识别链霉素的核酸适配子,并将其应用于定性或定量检测链霉素中,以解决现有链霉素检测过程繁琐,检测精准性较差的问题。
    本发明的目的之二是提供一种定性及定量检测链霉素的方法,以解决现有技术检测链霉素存在要么检测工序繁琐、费时费力、成本较高,要么精确度和灵敏性相对较差的问题。
    本发明是这样实现的:一种特异识别链霉素的核酸适配子,所述适配子的核苷酸序列为:CCCGTTTAAAGTAGTTGAGAGTATTCCGTTTCTTTGTGTC(见SEQ ID NO : 1)。
    所述核苷酸适配子加上固定序列后其核苷酸序列为:
    5’-ACCGACCGTGCTGGACTCTGCCCGTTTAAAGTAGTTGAGAGTATTCCGTTTCTTTGTGTCCAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3’,划线部分即为固定序列。其二级结构特征如图1所示。
    本发明不局限于SEQ ID NO : 1所示的序列,将所述核酸适配子进行修饰或改造得到的核酸适配子衍生物也属于本发明的?;し段?。
    本发明所述核酸适配子衍生物可为如下任意一种:删除或增加部分核苷酸,得到与所述核酸适配子具有相同功能的核酸衍生物;进行核苷酸取代或部分修饰,得到与所述核酸适配子具有相同功能的核酸衍生物;以此核酸适配子为骨架进行改造,得到与所述核酸适配子具有相同功能的核酸衍生物;将所述核酸适配子改为肽核酸,得到与所述核酸适配子具有相同功能的核酸衍生物;将所述核酸适配子进行标记荧光类物质、酶类物质或其它标记物质,得到与所述核酸适配子具有相同功能的核酸衍生物。
    本研究以链霉素为靶物质,利用SELEX技术筛选获得了特异性识别链霉素的核酸适配子,并测定了其核苷酸序列;该核酸适配子通过荧光法鉴定得知,其对链霉素具有很高的亲和力和高度的特异性,这为进一步开发利用适配子检测链霉素奠定了基础。本发明提供的核酸适配子与蛋白类的抗体相比具有分子量较小,可以化学合成,成本较低,稳定性好,且易于保存;可直接体外合成,便于标记且可以在不同部位进行选择性的标记;将其用于检测链霉素方法灵活,易于优化;实际应用中,可以以该苷酸适配子为基础,来设计开发多种链霉素实验室检测方法,可在食品、卫生及进出口检测等领域得到广泛应用。
    本发明所述的核酸适配子结合胶体金比色法用于定性或/和定量检测食品中链霉素的应用。
    一种定性检测链霉素的方法,包括以下步骤:
    (a)将质量比浓度为0.01%的HAuCl4溶液加热煮沸,边搅拌边加入质量比浓度为1%的柠檬酸钠,溶液变色后,煮沸并持续10-15min,冷却至室温,得胶体金;
    (b)以45-60μL的胶体金中加入100 nmol/L的特异识别链霉素的核酸适配子的比例将两者混合,室温孵育1-2 h,制得了适配子标记的胶体金;其中所述特异识别链霉素的核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示;
    (c)在适配子标记的胶体金中加入待测样品,若溶液颜色为酒红色,则待测样品中链霉素浓度小于200 nmol/L;若溶液颜色由酒红色变为紫色,则待测样品中链霉素的浓度为200~800 nmol/L;若溶液颜色由酒红色变为蓝色,则待测样品中链霉素的浓度为大于800 nmol/L。
    一种定量检测链霉素的方法,包括以下步骤:
    (A)将质量比浓度为0.01%的HAuCl4溶液加热煮沸,边搅拌边加入质量比浓度为1%的柠檬酸钠,溶液变色后,煮沸并持续10-15min,冷却至室温,得胶体金;
    (B)以45-60μL的胶体金中加入100 nmol/L的特异识别链霉素的核酸适配子的比例将两者混合,室温孵育1-2 h,制得了适配子标记的胶体金;其中所述特异识别链霉素的核酸适配子的核苷酸序列如SEQ ID NO : 1所示;
    (C)在步骤(B)制得的适配子标记的胶体金中加入浓度分别为25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、400 nmol/L、800 nmol/L、1600 nmol/L的链霉素,室温孵育1 h,加入50 μL浓度为200 mmol/L的NaCl,在波长为A520和A620分别测定其吸光值,以链霉素的浓度为横坐标,以同一浓度链霉素所述测得的A620和A520的比值为纵坐标,作链霉素浓度与A620/520比值的曲线图,拟合其标准曲线;测定样品时,将待测样品加入到适配子标记的胶体金中,测定其在波长为A520和A620的吸光值,求A620/520比值,将其带入标准曲线中得到所对应的链霉素含量值,即为待测样品中所含链霉素的含量。
    本发明以将上述筛选的高特异性和高亲和性的与链霉素相结合的核酸适配子与胶体金比色法相结合,建立了基于寡核苷酸适配子的链霉素新型检测方法,可简单、快速、准确、经济、特异地对链霉素进行定量或定性检测,为开发新型链霉素分析方法或检测工具奠定良好基础,同时也为其他小分子物质的检测提供思路,可以在食品、卫生及进出口检测等领域得到广泛应用。
    附图说明
    图1为本发明核酸适配子的二级结构特征图。
    图2环氧基活化凝胶与链霉素-环氧基凝胶偶联复合物的红外图谱。其中图中a为链霉素-环氧基凝胶偶联复合物,b为环氧基活化凝胶。
    图3氨基磁珠与链霉亲和素磁珠的红外图谱。其中图中a为氨基磁珠,b为链霉亲和素磁珠。
    图4每轮筛选PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。
    图5每轮筛选PCR产物的荧光值。
    图6为荧光标记法测定的适配子亲和力结果图。
    图7为本发明实施例1中适配子A17、A25以及A15的二级结构特征图。
    图8为不同浓度的链霉素与适配子标记胶体金聚沉状态图。
    图9为不同浓度的链霉素加入标记适配子的胶体金的光谱图。
    图10为A620/A520比值与链霉素浓度关系曲线图。
    图11为A620/A520比值与链霉素浓度的标准曲线图。
    图12为链霉素及对比例的定性检测图。
    具体实施方式
    以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。实施例中所用的试验材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
    实施例1 特异识别链霉素的核酸适配子的获得
    (1)环氧基凝胶与链霉素的偶联:取3 ml环氧基活化凝胶用双蒸水洗五次,然后抽滤干燥;将干燥后的环氧基活化凝胶中加入到10 ml含20 mg/ml链霉素的0.1mol/L的Na2CO3-NaHCO3偶联缓冲液(pH值为10.5)中,37℃孵育16h;反应结束后,将孵育产物用0.1mol/L的PBS溶液冲洗三次,再加入1 mol/L的乙醇胺进行封闭,室温孵育1 h;封闭后的凝胶偶合物依次用5倍的去离子水、0.1 mol/L含0.5 mol/L NaCl的HAc-NaAc缓冲液(pH值为4.0)、去离子水、0.1 mol/L含0.5 mol/L NaCl的硼酸-四硼酸钠缓冲液(pH值为8.0)和去离子水充分洗涤,抽滤干燥,去除了未反应的配基,得链霉素-环氧基凝胶偶联复合物;将链霉素-环氧基凝胶偶联复合物重悬于4℃的质量比浓度为20%的乙醇溶液中备用;将所得的链霉素-环氧基凝胶偶联复合物与环氧基活化凝胶进行红外检测,验证其偶联结果,结果见图2所示?;费趸沸纬蒀-O键和C-N键,从图2中可以看出链霉素-环氧基凝胶偶联复合物在1180 cm-1处有一特征峰,环氧基活化凝胶在此处无特征峰,而此峰就是由C-N伸缩震动产生的,这说明链霉素已通过化学反应固定在环氧基凝胶上。
    (2)阳极柱和阴极柱的制备:
    阳极柱的制备:将3 mL链霉素-环氧基凝胶偶联复合物装入亲和层析柱空柱中,用1 mol/L NaCl溶液分5洗进行洗脱,每次10 mL,洗脱总体积50 mL(每次洗脱必须保证凝胶浸于液体中)再用去离子水洗10个柱体积,得阳极柱,最后保存于10 mL质量百分比为20%的乙醇溶液中;
    阴极柱的制备:将3 mL未与链霉素偶合的环氧基活化凝胶用10-20倍体积的去离子水冲洗5次,以除去DMSO,在砂芯漏斗中抽干,转移至10 mL的亲和层析柱中,得阴极柱。
    (3)构建ssDNA随机文库:
    利用Oligo6.0和primer premier 5.0设计80 bp的随机单链寡核苷酸(single strand DNA,ssDNA)文库,中间为40 bp随机序列,两端分别为20 bp固定序列,具体序列全长为:
    5’-ACCGACCGTGCTGGACTCTG-40bp-CAGTATGAGCGAGCGTTGCG-3’。
    设计PCR扩增引物如下:
    上游引物P1:5’-ACCGACCGTGCTGGACTCTG-3’,
    生物素标记的上游引物P2:5’-Biotin-ACCGACCGTGCTGGACTCTG-3’;
    下游引物P3:5’-CGCAACGC TCGCTCATACTG-3’,
    荧光标记的下游引物P4:5’-FAM-CGCAACGC TCGCTCATACTG-3’。
    所述ssDNA随机文库序列及上、下游引物及标记引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。
    (4)适配子筛选与鉴定:
    a、偶联:取步骤(3)合成的ssDNA随机文库500 pmol溶解于1ml结合缓冲液(包括20 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl和5 mmol/L MgCl2,pH值为8.0)中,100℃变性5 min,4℃冷却10 min后,将其加入到阴极柱内,37培养箱中孵育10 min,收集未与阴极柱内环氧基活化凝胶相结合的ssDNA随机文库加入到阳极柱内,37℃孵育1 h;然后用淋洗缓冲液(包括20 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L NaCl,5 mmol/L KCl,5 mmol/L MgCl2和质量比浓度为0.01%的Tween20,pH值为8.0)淋洗200个柱体积,流出速度1 mL/min,最后加入1 mL洗脱缓冲液(包括20 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L NaCl,5 mmol/L KCl,5 mmol/L MgCl2和10 mmol/L的链霉素,pH值为8.0),洗脱五次,收集每次洗脱缓冲液,在收集的洗脱缓冲液中加入洗脱液1/10体积的3 mol/L NaAc,使其最终浓度为0.3 mol/L,充分混匀后加入等体积的预冷异丙醇,-20℃静置过夜,在4℃下,12000 rpm离心15 min,弃上清,用质量比浓度为70%的乙醇溶液洗两次(12000 rpm离心15 min),小心移出上清液,滤纸吸去管壁上所有的液滴,于室温下以使残留的液体挥发至干,得ssDNA沉淀,记为(1,目);
    b、对称PCR扩增:将ssDNA沉淀用60℃预热的100 μL ddH2O溶解,以0.5 μL溶解后的ssDNA为模板,用生物素标记的上游引物P2(5’-Biotin-ACCGACCGTGCTGGACTCTG-3’)、荧光标记的下游引物P4(5’-FAM-CGCAACGCTCGCTCATACTG-3’)进行对称PCR扩增,其所述对称PCR扩增的体系为:取浓度均为10 μmol/L的生物素标记的上游引物P2、荧光标记的下游引物P4各0.5 μL,ddNTP 1 μL,PCR buffer 2 μL,Taq酶0.1 μL,灭菌水15.4 μL。扩增程序为:94℃预变性3 min,94℃变性45 s,68℃退火45 s,72℃延伸45 s,6轮热循环。平行做5管,得到第一轮筛选扩增产物,记为(1,d);
    c、PCR纯化:PCR产物用纯化试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)进行纯化,将PCR产物加入到平衡好的吸附柱中,12000 rpm离心,筛掉50 bp以下的DNA序列,回收50 bp以上序列,去除杂带,得纯化对称PCR产物,记为(1,c);
    d、次级文库的制备:先制备链霉亲和素磁珠,取5 mg(1 mL)氨基磁珠超声混匀,装入10 mL的EP管中,用5 mL的PB(0.1 mol/L pH 7.4)混悬,磁分离,吸弃上清液,用PB洗三次;加入质量百分比浓度12%的新配的戊二醛5 mL,37℃摇床孵育4 h,PB洗三次;加入1 mL  100 μg/mL的链霉亲和素(链霉亲和素溶于双蒸水中),37℃摇床孵育4 h,得链霉亲和素磁珠,磁分离链霉亲和素磁珠,清洗干净备用;将氨基磁珠和链霉亲和素磁珠进行红外检测,验证其偶联结果,结果见图3;其中图中a为氨基磁珠,b为链霉亲和素磁珠。
    由图3中b可见,红外图谱显示链霉亲和素磁珠在544 cm-1和1606 cm-1处有吸收峰,而席夫碱的特征峰在1650~1590 cm-1范围,说明有C=N缩振动峰产生;红外图谱区别于氨基磁珠,证明链霉亲和素磁珠成功偶联;
    取6~7×107(1 mg)链霉亲和素磁珠,用2倍B&W缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,1mmol/L EDTA,2.0 mol/L NaCl)洗涤磁珠一次;上磁力架1-2 min,吸弃洗涤液;取100 μL 1倍B&W缓冲液混悬;加入100 μL等体积的纯化对称PCR产物(1,c),37℃摇床结合30 min;上磁力架1~2 min,分离已结合对称PCR产物dsDNA的链霉亲和素磁珠,用1倍B&W缓冲液洗涤结合dsDNA的链霉亲和素磁珠2~3次,对链霉亲和素磁珠结合的dsDNA进行解链,具体为:加入200 μL的150 mmol/L NaOH,37℃孵育15 min,使dsDNA解链;上磁力架,含生物素的一条ssDNA留在链霉亲和素磁珠上并吸附在管壁,而另一条与其互补的荧光标记的ssDNA存在于上清中,记为目标产物,记为(1,s)。测量链霉亲和素磁珠制备的(1,s)产物以及纯化后(1,c)的荧光强度,计算其回收效率。计算结果为:将荧光强度为112.67荧光标记的PCR产物加入链霉亲和素磁珠解链后得到的上清液中荧光强度为38.67,回收率为34.32%。并可根据荧光强度,计算其每一轮的亲和力。
    e、每一轮筛?。喝∧勘瓴铮?,s)500 pmol结合缓冲液定容至1 mL,95℃变性2 min后,立即放置4℃水浴10 min,加入阳极柱,孵育1 h,通过淋洗,洗脱得到(2,目),(2,d),(2,c),(2,s)。第三轮同第二轮类似,?。?,s)500 pmol与阳极柱孵育得到(3,s),用于第四轮的筛选。第四轮相比于第三轮,需要进行反筛,?。?,s)300 pmoL,用结合缓冲液定容至1 mL,95℃变性2 min后,立即放置 4℃ 水浴10 min,加入阴极柱,孵育10 min,转入阳极柱孵育1 h,通过淋洗,洗脱,进行第四轮筛选得到(4,目),(4,d),(4,c),(4,s)。
    第五轮到第十轮重复第一轮的筛选,每三轮筛选进行一次反筛,用于除去非特异性结合的序列。将第十轮筛选到的ssDNA(10,目)作为模板加入上述上游引物P1和下游引物P3进行PCR扩增,扩增体系的其他底物和扩增程序同上,将每轮的对称PCR产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,得到图4,图中1、2、3、4分别为第3轮、5轮、7轮、9轮筛选的PCR产物,M表示Marker;从图中可以看出条带清晰,无杂带;以每一轮的次级文库测量其荧光强度,作为评价每一轮亲和力的标准,洗脱收集的次级文库荧光强度越高,亲和力越高,结果见图5,图中1~10分别表示SELEX筛选每轮PCR产物的荧光值。
    将第十轮筛选得到的ssDNA为模板对称PCR扩增得到的产物纯化后,连接pUCM-T载体,转入大肠杆菌,挑取含ssDNA单克隆进行测序,共测序31个阳性克隆,经测序后获得13个不同序列的适配子,即为与链霉素亲和性较高的ssDNA;通过Mfold program软件分析ssDNA二级结构,根据一级序列同源性及二级结构的相似性对所获适配子进行分类,见表1。
    表1  ssDNA随机区的一级序列

    (5)荧光法检测筛选与链霉素亲和力最高的适配子:
    取测序鉴定后的与链霉素亲和性较高的ssDNA的13种转化菌30 μL接种于3 mL含Amp的LB液体培养基,摇菌过夜,加入1.5 mL EP管,12000 rmp离心1 min,弃上清。采用质粒抽提试剂盒(上海生工)进行质粒小提;以所述质粒作为模板与生物素标记上游引物P2和荧光标记的下游引物P4进行对称PCR扩增,扩增体系中各物质的体积和扩增程序同上,纯化,将纯化产物用链霉亲和素磁珠结合,磁分离,解链,将得到13种荧光标记的适配子。
    将13种不同序列适配子分别与阴极柱阳极柱进行孵育,按上述工艺进行淋洗,洗脱步骤,测定阳极柱洗脱液的荧光强度,每300 μL测一次荧光强度。记录阳极柱中最强峰的强度,比较13个不同序列适配子峰高,做柱形图,作为亲和力测定的标准,见图6。由于适配子与阴极柱孵育,加入淋洗液,随着加入量的增加,荧光强度逐渐减少,加入洗脱液,荧光强度不再变化,证明适配子不会吸附在阴极柱上,随着淋洗液的加入,适配子会逐渐流出;适配子与阳极柱孵育,加入淋洗液,随着加入量的增加,荧光强度不变,加入洗脱液,荧光强度由小变大,证明适配子与阳极柱产生了特异性结合,淋洗液不会将适配子淋洗下来,当加入洗脱液时,适配子被逐渐洗脱。其中阳极孵育加入洗脱液,洗脱下来的溶液荧光强度越高,证明适配子与阳极柱亲和力越高。根据阳极柱峰值的高低,判断亲和力大小。所获得适配子的荧光值均极显著高于阴性对照(P<0.01),表明筛选获的适配子均可与链霉素稳定结合。从图6中可见,第三家族中A15与A31亲和力高于其他两家族中适配子,选取每个家族中亲和力最高的适配子进行比较,第三家族中A15亲和力显著高于第一家族中的A17和第二家族中的A25。
    (6)根据亲和力柱形图可选择每个家族中亲和力最高的一个适配子求其Kd值并做二级结构预测。将每个家族中选出的适配子作为模板,与荧光标记的下游引物和生物标记的上游引物进行对称PCR扩增,用磁珠法进行解链得到纯化的荧光标记适配子,稀释成不同浓度(0.02、0.04、0.08、0.1、0.15 μg)与1 mg的磁珠复合物进行孵育,测量孵育前后不同浓度适配子的荧光强度,计算结合的荧光强度作为纵坐标。根据origin绘图软件,作非线性拟合。根据米氏方程:y/2=ymax·[ssDNA]/(Kd+[ssDNA]),计算出Kd值,其中y为吸附适配子的荧光强度,纵坐标;ymax吸附适配子最大的荧光强度;[ssDNA]为适配子浓度,横坐标;Kd值为解离常数,Kd值越小则亲和力越高。通过测定,结果显示适配子A15、A17、A25的Kd值分别为6.07nmol/L,8.56nmol/L和10.31nmol/L,其二级结构及Kd值见图7,其中A15适配子Kd值显著低于其他适配,说明A15号与链霉素亲和力最高,即如SEQ ID NO:1所示。
    实施例2 利用适配子定性及定量检测链霉素
    (1)胶体金制备:将20 mL、质量比浓度为0.01%的HAuCl4加热煮沸,边搅拌边加入500 μL质量比浓度为1%的柠檬酸钠,颜色变化后,溶液持续煮沸10min,移除热源搅拌直至室温,得胶体金;可将胶体金储存在质量比浓度为0.05%的叠氮化钠中,备用;
    (2)定性检测:在50 μL的胶体金中加入100 nmol/L的特异识别链霉素的核酸适配子,室温孵育1 h,制得了适配子标记的胶体金;把终浓度分别为25 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L、400 nmol/L、800 nmol/L、1600 nmol/L的链霉素加入到适配子标记的胶体金中,室温孵育1 h;最后加入50 μL浓度为200 mmol/L的NaCl,观察颜色变化,如图8所示。
    图8显示当链霉素浓度大于200 nmol/L时,胶体金溶液由酒红变为紫色或蓝色,说明颜色变化与链霉素浓度相关。当链霉素浓度小于200 nmol/L时为红色,表明有少量的胶体金发生聚沉,裸眼不能区分颜色变化情况,但可以通过光吸收值变化检测链霉素浓度。当链霉素浓度为200~800 nmol/L,颜色变为紫色,表明大部分的胶体金发生聚沉。当链霉素浓度大于800 nmol/L,颜色为蓝色,表明全部的胶体金发生聚沉。以此实验结果,可以以50 μL的胶体金中加入100 nmol/L的适配子的比例制成适配子标记的胶体金,将其作为测试卡的底物或试剂盒的测试液,用来检测样品中是否含有链霉素,具体操作为:在适配子标记的胶体金中加入待测样品,裸眼观察溶液的颜色,若溶液的颜色仍为酒红色,则待测样品中链霉素的浓度小于200 nmol/L;若溶液颜色由酒红色变为紫色,则待测样品中链霉素的浓度为200~800 nmol/L;若溶液颜色由酒红色变为蓝色,则待测样品中链霉素的浓度为大于800 nmol/L。这样可以初步定性测定待测样品中链霉素的含量范围。
    当待测样品中含有链霉素,但其浓度小于200 nmol/L时,溶液为酒红色,表明有少量的胶体金发生聚沉,裸眼不能区分颜色变化情况,但可以通过光吸收值变化检测链霉素浓度;当待测样品中链霉素浓度为200~800 nmol/L,溶液颜色变为紫色,表明大部分的胶体金发生聚沉;当链霉素浓度大于800 nmol/L,溶液颜色为蓝色,表明全部的胶体金发生聚沉;透射电镜结果显示,适配子标记的胶体金聚沉程度与链霉素浓度正相关,与颜色变化及光吸收变化结果相一致。
    (3)定量检测:对步骤(2)中胶体金聚沉程度利用紫外可见分光光度计扫描,如图9所示,当胶体金聚沉程度随着链霉素浓度增加而加大时,A520有所下降,而A620逐渐上升,两处的吸光值变化与链霉素浓度变化具有明显相关性,经过分析后发现A620/A520的比值与链霉素浓度的变化更接近线性相关,因此,选择A620/520比值变化定量检测链霉素浓度,其测定结果见图10。从图10中显示,当链霉素浓度为25-800nmol/L时,其A620/A520的比值与链霉素浓度基本呈线性关系;对其进行拟合,所得标准曲线如图11所示,其R2为0.998;在实际测定样品时,将待测样品加入到适配子标记的胶体金中,测定其在波长为A520和A620的吸光值,求A620/520比值,将其在带入标准曲线中,即可得知待测样品中所含链霉素的含量;
    (4)适配子高度特异识别的验证:为了测定链霉素适配子的特异性,选择与链霉素同一类的氨基糖苷类抗生素及其他非氨基糖苷类抗生素(硫酸卡那霉素、G418、红霉素、氯霉素以及盐酸托普霉素)作为阴性对照与适配子A15标记的胶体金进行反应。结果如图12所示,肉眼可直接观察胶体金颜色变化。其中待测样品1为阳性对照、2为800 nmol/L链霉素、3为200 nmol/L链霉素、4为硫酸卡那霉素、5为G418、6为红霉素、7为氯霉素、8为盐酸托普霉素。从图12可见,仅加入链霉素可导致胶体金颜色由红变为紫色或蓝色,其他抗生素均不能与适配子A15结合而不能使胶体金变色。虽然链霉素,硫酸卡那霉素和G418均属于氨基糖苷类抗生素,具有相似的结构,但适配子A15仅与链霉素结合,表现了高度的特异性。通过分光光度计检测A620/A520光度值吸,结果与胶体金比色法相一致,均表明适配子A15可对特异性识别并结合链霉素。
    实施例3牛奶及蜂蜜中链霉素残留量的定量检测
    从本地超市采购不含链霉素的蜂蜜和牛奶样品,采用加标回收实验对链霉素进行定量检测,具体操作如下:
    牛奶样品处理:在1 mL牛奶样品中加入3 mL乙酸乙酯和3 mL水,漩涡混合15 min;然后在4℃下,8000 rpm/min离心15min;混合物分为三层,收集水层作为下一步检测样品;
    蜂蜜样品处理:蜂蜜用双蒸水稀释五倍进行稀释,作为检测样品;
    将一系列标准浓度链霉素:25nmol/L、50nmol/L、100nmol/L、200nmol/L、400 nmol/L分别加入处理后的牛奶及蜂蜜样品中,利用实施例2定量检测方法检测样品中链霉素浓度,其检出结果与添加链霉素浓度一致,其定性检测结果与定量检测相一致。这说明本发明利用适配子检测链霉素准确性较高,而且从表中数据可以得知,牛奶样品中链霉素的回收率为70~90%,蜂蜜中为76~98%之间,二者检测的相对标准偏差(RSD)均值小于4.58 %。该结果表明本发明所获核酸适配子可成功应用于实际样品中链霉素的检测,而且准确性和精确度都相对较高。
    检测结果见表2。
    表2  牛奶和蜂蜜样品中链霉素检测结果

                             SEQUENCE LISTING
     
    <110>  河北大学
     
    <120>  一种特异识别链霉素的核酸适配子及其在链霉素检测中的应用
     
    <130> 
     
    <160>  1    
     
    <170>  PatentIn version 3.3
     
    <210>  1
    <211>  40
    <212>  DNA
    <213>  核算适配子
     
    <400>  1
    cccgtttaaa gtagttgaga gtattccgtt tctttgtgtc                           40

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    一种 特异 识别 链霉素 核酸 配子 及其 检测 中的 应用
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