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    重庆时时彩地下庄: 一种荧光分子开关及其荧光探针和荧光探针的应用.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201410012942.1

    申请日:

    2014.01.10

    公开号:

    CN104774147A

    公开日:

    2015.07.15

    当前法律状态:

    终止

    有效性:

    无权

    法律详情: 未缴年费专利权终止IPC(主分类):C07C 63/49申请日:20140110授权公告日:20160817终止日期:20170110|||授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C07C 63/49申请日:20140110|||公开
    IPC分类号: C07C63/49; C07C27/02; C12N15/11; G01N21/64 主分类号: C07C63/49
    申请人: 中国科学院青岛生物能源与过程研究所; 北京三星通信技术研究有限公司
    发明人: 郭静; 孟晋宇; 阳仁强; 王婷
    地址: 266101山东省青岛市崂山区松岭路189号
    优先权:
    专利代理机构: 沈阳科苑专利商标代理有限公司21002 代理人: 周秀梅; 李颖
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201410012942.1

    授权公告号:

    |||||||||

    法律状态公告日:

    2018.02.27|||2016.08.17|||2015.08.12|||2015.07.15

    法律状态类型:

    专利权的终止|||授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及荧光探针,具体的说是一种芴的小分子衍生物的荧光探针及应用。以芴的小分子衍生物作为荧光分子开关。荧光探针为经DNA修饰的芴的小分子衍生物。所述芴的小分子衍生物的荧光探针在荧光分子开关与逻辑门中的应用所述芴的小分子衍生物的荧光探针在细胞荧光成像中的应用。本发明体现了材料学、有机化学、生物学与电子计算机科学交叉融合的优势与特点,提供了在分子水平上构建逻辑体系的新方法。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种荧光分子开关,其特征在于:以芴的小分子衍生物作为荧 光分子开关。

    2.  按权利要求1所述的荧光分子开关,其特征在于:所述芴的小 分子衍生物为2,7-二苯基羧酸取代的芴的小分子衍生物,结构式一 如下,
    式一。

    3.  按权利要求2所述的荧光分子开关,其特征在于:所述式一 所示化合物在pH1-6条件下荧光减弱(“关”);在pH7-14条件 下荧光显著增强(“开”)。

    4.  一种芴的小分子衍生物的荧光探针,其特征在于:荧光探针为 经DNA修饰的芴的小分子衍生物。

    5.  按权利要求4所述的芴的小分子衍生物的荧光探针,其特征在 于:所述芴的小分子衍生物为2,7-二苯基羧酸取代的芴的小分子衍 生物,结构式一如下,
    式一。

    6.  按权利要求5所述的芴的小分子衍生物的荧光探针,其特征 在于:所述经DNA修饰的芴的小分子衍生物为衍生物两端的活性酯基 与DNA的5’端氨基共价结合相连获得。

    7.  按权利要求4所述的芴的小分子衍生物的荧光探针,其特征在 于:所述DNA序列为P1、P2或P3;其中,
    P1:5’-FSM-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’;
    P2:5’-FSM-GGGTTAGGGTTA-3’;
    P3:5’-FSM-ACCTTCACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3’。

    8.  按权利要求4所述的芴的小分子衍生物的荧光探针,其特征在 于:所述猝灭剂为双链DNA(dsDNA),荧光染料SYBR GREEN I(SG I), 溴化乙锭(EB)、适配体或靶分子复合物。

    9.  一种权利要求4所述的芴的小分子衍生物的荧光探针的应用, 其特征在于:所述芴的小分子衍生物的荧光探针在荧光分子开关与逻 辑门中的应用。

    10.  一种权利要求4所述的芴的小分子衍生物的荧光探针的应 用,其特征在于:所述芴的小分子衍生物的荧光探针在细胞荧光成像 中的应用。

    说明书

    说明书一种荧光分子开关及其荧光探针和荧光探针的应用
    技术领域
    本发明涉及荧光探针,具体的说是一种荧光分子开关及其荧光探 针和荧光探针的应用。
    背景技术
    近几十年内计算机的发展速度令人瞠目,然而目前基于硅芯片的 集成电路的密度已接近理论极限,成为制约现代电子计算机进一步发 展的技术难题。而人工智能的实现取决于计算机电路的密度和复杂 性,基于此原因,目前以半导体技术为基础的电子电路或许难以产生 真正的认知能力。解决上述问题的出路在于:从观念和技术上彻底抛 开传统的硅半导体电子器件,进而研究分子计算机,再进而发展基于 生物大分子的生物分子计算机。
    DNA计算机被认为是未来最理想的计算机形式,其优势体现在 以下几点:1)超大规模的并行计算能力;2)庞大的储存容量;3) 极高的能量利用率。因此DNA计算机在信息处理方面的应用能够像其 它电子设备一样具有重要意义,并且有望在某些领域弥补传统电子计 算机的不足,如密码问题、多项式复杂程度的非确定性问题(即NP- 完全问题)等。当然,DNA计算机不仅仅是传统电子计算机的一个补 充,科学家们期望未来DNA计算机能在药物传输与释放、生物传感器、 异?;蛐薷春图膊〖觳獾确矫娣⒒又匾饔?。虽然DNA计算未来潜 力无穷,但目前仍处于研究的初始阶段,有许多瓶颈技术和基础问题 需要解决。理论上来说,基于DNA的分子逻辑门是DNA计算机体系结 构的产生基础和DNA计算机实现技术的硬件基础。因此,DNA逻辑门 的设计与构建就是一个至关重要的基础问题。
    近年来,在丰富DNA逻辑门的类型、提高运算功能以及扩展应用 范围等方面上,化学材料的引入发挥了重要的作用,充分体现了计算 机科学、化学及生物学多学科交叉融合的优势和特点。目前,用于 DNA逻辑门构建的化学材料包括金纳米颗粒、碳纳米管、石墨烯、有 机小分子和量子点等。此外,水溶性阳离子共轭聚合物(Cationic  Conjugated Polymers(CCPs)),作为新型荧光探针,被用于多种共 轭聚合物/DNA超分子逻辑门体系和生物传感器的研究。然而基于共 轭聚合物的DNA逻辑门的研究也逐渐到了瓶颈期,更多的是转向了生 物传感器方面的研究。与聚合物相比,有机小分子具有确定的相对分 子质量、易于提纯、性质稳定、荧光量子产率高等优势。另一方面, 有机小分子可以通过共价键的方式与DNA分子相互作用,主要是与 DNA分子的末端氨基形成共价键连接,或者是共价修饰到某一个碱基 上。这种类型的有机小分子已经广泛用于核酸多态性检测和生物传感 器的研究。目前,除了几种常见的商品化的核酸标记型有机小分子荧 光染料外,有机荧光小分子材料在分子逻辑门和逻辑器件的构建方面 的研究还很少见。
    发明内容
    本发明目的在于提供一种荧光分子开关及其荧光探针和荧光探 针的应用。
    为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
    一种荧光分子开关,以芴的小分子衍生物作为荧光分子开关。
    所述芴的小分子衍生物为2,7-二苯基羧酸取代的芴的小分子衍 生物,结构式一如下,
    式一。
    所述式一所示化合物在pH1-6条件下荧光减弱(“关”);在 pH7-14条件下荧光显著增强(“开”)。
    具体是,所述以2,7-二苯基羧酸取代的芴的小分子衍生物(化 合物5)作为荧光探针在荧光离子开关与逻辑门中的应用中;化合物 5的荧光强度受pH值调节控制,在pH1-6条件下荧光减弱(“关”); 在pH7-14条件下荧光显著增强(“开”);此分子开关在一个小时 内保持良好的稳定性;检测环境为H2O:DMSO=5000:1;pH调节用5 M NaOH和12M HCl溶液。
    一种芴的小分子衍生物的荧光探针,荧光探针为经DNA修饰的芴 的小分子衍生物。所述芴的小分子衍生物为2,7-二苯基羧酸取代的 芴的小分子衍生物,结构式一如下,
    式一。
    所述经DNA修饰的芴的小分子衍生物为衍生物两端的活性酯基 与DNA的5’端氨基共价结合相连获得。
    所述DNA序列为P1、P2或P3;其中,
    P1:5’-FSM-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’;
    P2:5’-FSM-GGGTTAGGGTTA-3’;
    P3:5’-FSM-ACCTTCACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3’。
    所述猝灭剂为双链DNA(dsDNA),荧光染料SYBR GREEN I(SG I), 溴化乙锭(EB)、适配体或靶分子复合物。
    一种芴的小分子衍生物的荧光探针的应用,所述芴的小分子衍生 物的荧光探针在荧光分子开关与逻辑门中的应用。
    一种芴的小分子衍生物的荧光探针的应用,所述芴的小分子衍生 物的荧光探针在细胞荧光成像中的应用。
    所述以经DNA修饰的2,7-二苯基羧酸取代的芴的小分子衍生物 作为荧光探针在荧光离子开关与逻辑门中的应用中;FSM/DNA探针 P1实现分子开关功能,其特点在于P1为水溶性的,可以在水溶液中 实现分子开关功能;在pH4和pH8的循环调节下实现荧光强(开) 和弱(关)的操作;分子开关在一个小时后仍然具有1.7倍以上的荧 光强弱变化。
    其中,FSM/DNA探针P1构建“NOR”和“AND”并行运算逻辑门, 门链为探针P1,输入信号1和信号2分别为P1的互补DNA(DNAc,5’ -AACTCTGCTCGACGGATT-3’)和SG I;在340nm激发下412nm和526 nm处的荧光发射强度分别为“NOR”和“AND”逻辑门的输出信号。 FSM/DNA探针P2构建“NOT”和“AND”并行运算逻辑门,P2和oligo DNA S1(5’-TAAGGGATTGGG-3’)作为门链,K+和SG I分别作为输 入信号1和输入信号2;在380nm激发下412nm和526nm处的荧 光强度分别为“NOT”和“AND”逻辑门的输出信号。
    FSM/DNA探针P3构建三输入“NOR”逻辑门,P3作为门链,ATP、 SG I和EB分别作为输入信号1,2,3;在340nm激发下412nm处 的荧光强度作为三输入“NOR”逻辑门的输出信号。
    FSM/DNA探针P1在浓度范围为1.56μg/mL-25μg/mL时,对人正常 肝细胞HL-7702体外增殖无明显抑制作用;在P1浓度≤12.5μg/ml 时对细胞增殖反而有一定的促进作用。
    FSM/DNA探针P1能穿透细胞膜并对细胞进行荧光成像,其特征 在于P1在pH4条件下荧光淬灭,细胞没有显示出荧光信号;而在 pH8条件下可见细胞质呈现蓝色荧光标记。
    本发明所具有的优点:(1)所述芴的小分子衍生物或芴的小分 子衍生物/DNA探针在pH的调节下呈现荧光强弱的变化,从而实现分 子开关的功能;(2)所述芴的小分子衍生物/DNA探针的荧光可以被 双链DNA(dsDNA),荧光染料SYBR GREEN I(SG I),溴化乙锭(EB) 或适配体或靶分子复合物淬灭,而无需对探针标记淬灭基团,有效的 降低了探针修饰的成本和时间;(3)通过对所述芴的小分子衍生物 /DNA探针的序列进行设计可以得到多种并行运算逻辑门以及多输入 式逻辑门,是良好的逻辑电路构筑单元;(4)所述芴的小分子衍生 物/DNA探针无细胞毒性,能够透过细胞膜,在碱性条件下将细胞质 标记上蓝色荧光,因此对肿瘤细胞的检测具有一定的意义。
    附图说明
    图1为本发明实施例提供的芴的小分子衍生物(化合物5和化 合物6)的合成路线图。
    图2为本发明实施例提供的芴的小分子衍生物/DNA探针 (FSM/DNA probe)的合成路线图。
    图3为本发明实施例提供的芴的小分子衍生物(化合物5,1.7× 10-5M)在不同pH值(1-14)条件下的紫外吸收光谱(H2O:DMSO= 5000:1)图。
    图4为本发明实施例提供的芴的小分子衍生物(化合物5,3.4 ×10-7M)在不同pH值(1-14)条件下的荧光发射光谱(H2O:DMSO= 5000:1)图,其中,激发波长为340nm。
    图5为本发明实施例提供的芴的小分子衍生物(化合物5,3.4 ×10-7M)在pH4和pH8循环调节下的荧光发射光谱(H2O:DMSO= 5000:1)图;其中折线插图为pH4和pH8下分别测定420nm和404 nm的荧光强度,取10次循环荧光强度值作图所得。(a,b)起始pH 为4;(c,d)起始pH为8;激发波长为340nm。
    图6为本发明实施例提供的芴的小分子衍生物(化合物5,3.4 ×10-7M,H2O:DMSO=5000:1)在pH4和pH8条件下荧光强度随 时间的变化图。
    图7为本发明实施例提供的芴的小分子衍生物(化合物6,2.6× 10-7M,H2O:DMF=5000:1)在pH4和pH8条件的荧光发射光谱图; 其中,激发波长为347nm。
    图8(a)为本发明实施例提供的基于芴的小分子衍生物/DNA探 针Probe1(P1)的“NOR”和“AND”并行运算逻辑门示意图;
    图8(b)为本发明实施例提供的在DNAc和SG I两个输入信号 的四种不同组合条件下样品在412nm和526nm处的荧光强度柱状图 (激发波长为340nm);图8(c)为本发明实施例提供的基于P1探 针的“NOR”和“AND”逻辑门真值表图。
    图9(a)为本发明实施例提供的基于芴的小分子衍生物/DNA探 针Probe2(P2)的“NOT”和“AND”并行运算逻辑门示意图;
    图9(b)为本发明实施例提供的在K+和SG I两个输入信号的四 种不同组合条件下样品在412nm和526nm处的荧光强度柱状图(激 发波长为380nm);
    图9(c)为本发明实施例提供的基于P2探针的“NOT”和“AND” 逻辑门真值表。
    图10(a)为本发明实施例提供的在三个输入信号ATP,SG I,EB 的八种不同组合条件下芴的小分子衍生物/DNA探针Probe3(P3)在 412nm处的荧光强度柱状图(激发波长为340nm);
    图10(b)为本发明实施例提供的基于P3探针的三输入“NOR” 逻辑门真值表。
    图11为本发明实施例提供的基于芴的小分子衍生物/DNA探针 P1(2×10-8M)在pH4和pH8之间循环调节下的分子开关;插图是 P1在pH4和pH8之间循环调节时荧光强度变化倍数;pH4和pH8 下分别测定415nm和407nm的荧光强度,激发波长为340nm。
    图12为本发明实施例提供的芴的小分子衍生物/DNA探针P1(2 ×10-8M)在pH4和pH8条件下荧光强度随时间的变化;插图是P1 在pH4和pH8之间循环调节时荧光强度变化倍数;pH4和pH8下 分别测定415nm和407nm的荧光强度,激发波长为340nm。
    图13为本发明实施例提供的MTT法检测芴的小分子衍生物/DNA 探针Probe1(P1)对人正常肝细胞HL-7702体外增殖的抑制作用。1: 阴性对照(细胞培养液);2:阳性对照(10μg/mL紫杉醇处理的 细胞培养液);3-7:不同浓度(1.56,3.12,6.25,12.5和25μ g/mL)的探针P1处理的HL-7702细胞培养液。
    图14为本发明实施例提供的激光共聚焦检测细胞在pH4(上) 和pH8(下)条件下的荧光成像结果。(a,d)细胞荧光成像图; (b,e)细胞在可见光成像图;(c,f)荧光和可见光组合图;激发 波长为340nm,显微放大倍数为400×。
    具体实施方式
    为了更清楚地说明本发明的实施例,下面对实施例所使用的附图 作简单介绍,此处描述的附图是针对本发明的实施例。
    首先,合成芴的小分子衍生物(化合物5),再将其与DNA的5’ 末端共价连接得到芴的小分子衍生物/DNA探针(FSM/DNA探针);其 次,通过调节溶液的酸碱度(pH值)来控制化合物5和FSM/DNA探 针的光谱性质,实现分子开关功能;第三,对探针的序列进行设计, 得到具有不同序列的FSM/DNA探针(P1,P2,P3),由此来构建逻辑门; 第四,对探针的生物毒性进行分析,并在不同pH值条件下进行细胞 荧光成像研究。
    实施例1:
    芴的小分子衍生物(化合物5)的合成(参见图1):
    50mL圆底烧瓶内加入芴2克,20mL氯仿,铁粉10.6mg,冰 浴冷至0℃以下,缓慢滴加4.12g液溴和10mL氯仿混合液,滴加 完之后,再反应2小时。加入亚硫酸氢钠水溶液,除去多余的溴。分 离出氯仿层,浓缩,过滤出固体,再用氯仿重结晶提纯,得到白色晶 体2,7-二溴芴(化合物1)2.95g,产率:78.5%。
    2,7-二溴芴1.5g,三乙基苄基氯化铵0.009g,30mL二甲基 亚砜放于三口瓶中形成悬浮液,滴入50wt%氢氧化钠水溶液1.5mL, 反应半小时,再滴加1.59g1-溴己烷?;旌衔镌谑椅孪陆涟?小时, 乙醚萃取。有机相用饱和食盐水洗,无水硫酸镁干燥。蒸去溶剂,无 水乙醇重结晶得橘红色针状结晶2,7-二溴-9,9-二己基芴(化合芴2) 1.96g,产率:86%,m/z,548,m.p.49-50℃。
    2,7-二溴-9,9-二己基芴(1.70g),4-甲氧羰基苯硼酸(化合 物3,1.46g),无水碳酸钾(0.86g)溶于20mL四氢呋喃(THF) 和9mL水的混合液,氩气?;は录尤胨模ㄈ交ⅲ╊?108mg), 80℃条件下反应16h。反应液用二氯甲烷萃取,然后分别用水和饱 和食盐水洗涤,无水硫酸镁干燥后减压除去溶剂,然后无水乙醇重结 晶得咖啡色固体4(1.52g,产率73%)。
    化合物4(0.7g),KOH(0.8g)溶于四氢呋喃(10mL)和水(5 mL)的混合液,回流反应16h后冷至室温,加入浓盐酸使其产生大量 固体,过滤所得滤饼分别用水和无水乙醇洗涤,真空干燥后得白色固 体(化合物5)0.59g,收率88%。其核磁检测结果如下:
    1H NMR(600MHz,[D6]DMSO):δ8.05(d,J=8.4Hz,4H),7.98 (d,J=8.4Hz,2H),7.90(m,6H),7.76(d,J=8.4Hz,2H), 2.14(m,4H),1.23-0.54(m,22H);
    13C NMR(150MHz,[D6]DMSO):δ167.10,151.49,144.49,140.24, 138.06,129.88,129.36,126.72,125.99,121.22,120.64,55.06, 40.45,31.03,28.99,28.35,28.33,23.21,21.91,13.74。
    实施例2:
    芴的小分子衍生物/DNA探针的设计与合成
    取实施例1中所得化合物5(100mg)和N-羟基琥珀酰亚胺 (91.25mg)溶于10mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中,然后缓慢 加入1,3-二环己基碳二亚胺(DCC,92.75mg)溶于5mL DMF的溶液, 加完后室温反应24h,薄层层析(TLC)检测反应结束后,反应液用二 氯甲烷萃取,减压除去溶剂,柱层析(石油醚:乙酸乙酯=3:1)分离 得浅黄色固体(化合物6),其核磁检测结果如下:
    1H NMR(600MHz,CDCl3):δ8.17(d,J=8.4Hz,4H),7.75(m, 6H),7.59(t,J=7.2Hz,2H),7.54(s,2H),2.87(s,8H),2.00 (m,4H),1.26-0.62(m,22H).
    将上述所得化合物6通过其两端的活性酯基与DNA的5’端氨基 相连,得到芴的小分子衍生物/DNA共价结合的荧光探针(FSM/DNA  probe),合成产物经高效液相色谱(HPLC)纯化。具体合成路线(参 见图2)。根据下面逻辑门构建的需要,FSM/DNA probe的核酸序列 如下:
    Probe1(P1):5’-FSM-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’
    Probe2(P2):5’-FSM-GGGTTAGGGTTA-3’
    Probe3(P3):5’-FSM-ACCTTCACCTGGGGGAGTATTGCGGAGGAAGGT-3’
    通过如下实施例对基于芴的小分子衍生物及芴的小分子衍生物 /DNA荧光探针的分子开关和逻辑门的构建作进一步的说明。
    实施例3:基于芴的小分子衍生物(化合物5)的分子开关构建
    将实施例1中的化合物5溶于DMSO中得到浓度为1.7×10-3M的 母液。将2mL超纯水用5M NaOH和12M HCl调节其pH值至1-14, 加入一定量的母液得到工作液。用移液枪混匀样品后进行紫外吸收光 谱检测和荧光发射光谱检测。同时,将实施例1中的化合物6(溶于 DMF)作为对照样品,按照上述方法平行操作。
    从附图3可以看到,化合物5在酸性条件下(pH1-6)紫外吸收 峰出现在350nm处;而随着pH值的升高,在中性及碱性(pH7-14) 条件下,紫外吸收峰发生10nm的蓝移,即吸收峰在340nm处。从 附图4荧光发射光谱上可以发现,向化合物5中加入氢氧化钠溶液使 溶液呈中性或碱性时,由于化合物5去质子化形成了羧酸阴离子 (COO-)而使其在404nm处具有很强的荧光发射。相反,向化合物5 中加入盐酸溶液使样品呈酸性时,化合物5以质子化形式存在,使其 荧光被很大程度的淬灭,并且峰位红移至420nm。由于质子化和去 质子化过程是可逆的,因此可以通过调节pH值来实现基于化合物5 的分子开关。
    本实施例选择pH4和pH8条件下对化合物5进行10次循环调 节,以此进行“ON-OFF”的荧光分子开关操作的说明。附图5是化合 物5在酸性(pH4)和碱性(pH8)循环调节下荧光变化图,从图可 以看出实现了开(荧光强)和关(荧光弱)的操作。当起始pH为4 时(附图5a,5b),反应体系在“开”和“关”状态下荧光强度变 化2.2倍以上;当起始pH为8时(附图5c,5d),反应体系在“开” 和“关”状态下荧光强度变化8.3倍以上。需要指出的是,溶液由酸 性到碱性再到酸性的反复调节中产生溶液稀释效应,导致荧光强度不 能完全恢复。图6表明本实施例的分子开关在一个小时内保持稳定。 为了证实化合物5的分子开关功能是基于末端羧酸基团的质子化和 去质子化过程,以不含有羧酸基的化合物6作为对照样品。从图7的 荧光发射光谱可以看出pH值对化合物6的荧光强度影响很小。
    实施例4:基于芴的小分子衍生物/DNA探针P1的“NOR”和“AND” 并行运算逻辑门构建
    将实施例2中的芴的小分子衍生物/DNA探针P1作为门链,与其 互补的DNA(DNAc:5’-AACTCTGCTCGACGGATT-3’)作为输入信号1, 绿色荧光染料SYBR GREEN I(SG I)作为输入信号2.根据输入信号 DNAc和SG I的四种不同组合方式:(0,0),(0,1),(1,0)和(1, 1)准备样品。反应体系含有20mM TrisHCl pH7.4,50mM MgCl2, 探针P1和DNAc的终浓度为0.02μM,含有输入信号2的样品中加入 400x SG I5μL。样品在室温下反应10分钟后测定荧光强度。如图 8所示,在340nm激发下,P1在404nm处有强荧光信号;当DNAc 存在时,它与P1杂交形成双链DNA,这使得芴的衍生物FSM荧光被 淬灭;另一方面,实验结果表明单链的P1的荧光还可以被SG I淬灭; 但是当DNAc和SG I同时存在时,SG I嵌入到双链DNA中,引起从 FSM到SG I的荧光能量共振转移,即FSM在412nm处的荧光减弱, SG I在526nm处荧光信号增强。因此,通过分别检测在340nm激 发下412nm和526nm处的荧光强度变化就可以实现“NOR”和“AND” 逻辑门的并行运算。
    实施例5:基于芴的小分子衍生物/DNA探针P2的“NOT”和“AND” 并行运算逻辑门构建
    将实施例2中的P2和oligo DNA S1(5’-TAAGGGATTGGG-3’) 作为门链,将K+和SG I分别作为输入信号1和2。将样品按照K+和 SG I的四种不同组合配制:(0,0),(0,1),(1,0)和(1,1)。 反应体系为:20mM TrisHCl pH7.4,50mM NaCl,50mM KCl,P2 和S1的终浓度为0.8μM。样品在37C下反应20分钟,缓慢地冷 却至室温(1小时)。将5μL400×SG I加入到(0,1)和(1,1) 组合的样品中室温反应5分钟。在380nm激发下测定样品的荧光发 射光谱。
    本实施例中门链P2和S1的特点是这两部分核酸序列分别是K+适配体的3’部分片段和5’部分片段。如图9所示,当没有K+存在 时,两条门链是以解离的单链状态存在的,此时没有从FSM到SG I 的荧光能量共振转移,FSM在380nm激发下在412nm处产生强的荧 光信号;当SG I存在时,它会使单链P2的荧光被SG I淬灭;当K+存在时P2和S1会形成G四链体结构,若此时再加入SG I,SG I会 嵌入到G四链体中并导致从FSM到SG I的荧光能量共振转移,即FSM 在412nm处的荧光减弱,SG I在526nm处荧光信号增强。由此可 以发现只要SG I存在,FSM在412nm处的荧光强度就减弱。因此, 通过分别检测412nm和526nm处的荧光强度变化就可以实现“NOT” 和“AND”逻辑门的并行运算。
    实施例6:基于芴的小分子衍生物/DNA探针P3的三输入“NOR” 逻辑门构建
    将实施例2中的P3作为门链,ATP、SG I和EB分别作为输入信 号1、2和3。将样品按照ATP、SG I和EB的八种不同组合配制:(0, 0,0),(0,0,1),(0,1,0),(0,1,1),(1,0,0),(1, 0,1),(1,1,0),(1,1,1)。反应体系为:10mM TrisHCl pH 7.4,50mM NaCl,P3,ATP和EB的终浓度分别为0.02μM,1mM,2.5μM, 含有输入信号2的样品中加入400×SG I5μL。室温反应5分钟后, 在340nm激发下测定样品的荧光发射光谱。
    根据实施例4和实施例5所述,芴的小分子衍生物/DNA探针以 单链状态存在时其荧光可以被SG I淬灭。在此实施例中,经过荧光 光谱测定,单链的P3还可以被EB淬灭。此外,本实施例中门链P3 含有ATP的适配体片段,当有ATP存在时P3可以与其形成三维空间 结构,这导致P3的荧光被淬灭。如图10所示,三个输入信号ATP、 SG I和EB中任何一个存在都使P3的荧光被很大程度的淬灭。因此, 通过检测412nm处的荧光强度变化就可以实现三输入“NOR”逻辑门 的运算。
    实施例7:
    基于芴的小分子衍生物/DNA探针P1的分子开关构建
    实施例3实现了基于芴的小分子衍生物(化合物5)的分子开关, 该化合物需要在有机溶剂(DMSO)中溶解后使用,而本实施例中使用 实施例2中的芴的小分子衍生物/DNA探针P1是水溶性的,可以在水 溶液中实现分子开关功能,避免了使用有机溶剂,降低了生物毒副作 用,更适合于进行生物学研究。由于FSM/DNA probe有一端携带羧基, 因此仍然可以通过调节pH值实现质子化和去质子化,在此基础上实 现分子开关功能。将P1溶于超纯水中(含20mM TrisHCl pH7.4), 用5M NaOH和12M HCl溶液来调节pH值。
    如图11所示,P1可以在pH4和pH8的循环调节下实现荧光强 (开)和弱(关)的操作。当起始pH为4时,反应体系在“开”和 “关”状态下荧光强度变化2.0倍以上;当起始pH为8时,反应体 系在“开”和“关”状态下荧光强度变化2.3倍以上。由于加入酸 碱溶液来调节溶液pH值产生了稀释效应,样品的荧光强度总体上呈 下降趋势。图12表明本实施例的分子开关在一个小时后仍然具有1.7 倍以上的荧光强弱变化。
    实施例8:芴的小分子衍生物/DNA探针P1的细胞毒性测试
    本实施例采用MTT法检测芴的小分子衍生物/DNA探针P1对人正 常肝细胞HL-7702体外增殖的影响。P1用超纯水配制成200μg/mL 的存储液,4℃保存。MTT检测浓度设置:25μg/mL、12.5μg/mL、 6.25μg/mL、3.125μg/mL、1.5625μg/mL。
    细胞培养具体步骤:
    细胞复苏
    1.调配37℃~40℃的温水,从液氮中取出冻存管,立即投入37 ℃~40℃温水中迅速晃动,直至冻存液完全解冻溶解;
    2.将细胞冻存悬液转移到离心管内,加入约5mL培养液,轻轻吹 打混匀;
    3.将细胞悬液经800~1000r/min离心5min,弃上层清夜;
    4.向沉淀的细胞内加入完全培养液(90%DMEM+10%FBS),轻 轻吹打混匀,将细胞悬液转移到培养瓶内,补足培养液进行培养。
    MTT法检测细胞增殖
    1.细胞消化、计数、配制成浓度为5×104个/mL的细胞悬液,96 孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液;
    2.将96孔细胞培养板置于37℃,5%CO2培养箱中培养24小时;
    3.弃去培养基,用磷酸盐缓冲溶液(PBS)清洗2次,用完全培 养基稀释药物P1至所需浓度,每孔加入200μL相应的含药培养基, 同时设立阴性对照组(不加P1的细胞培养液)和阳性对照组(10μ g/mL紫杉醇(PTX)与细胞共同培养);
    4.将96孔细胞培养板置于37℃,5%CO2培养箱中培养72小时;
    5.将96孔板进行MTT染色,λ=490nm,测定OD值;
    A.每孔加入20μL MTT(5mg/ml),在培养箱继续培养4小时;
    B.弃去培养基,每孔加入150μL DMSO溶解,摇床10分钟轻轻混匀; C.λ=490nm,酶标仪读出每孔的OD值;
    6.计算各组别细胞存活率(VR)。
    计算方法:VR=A/A0×100%其中A代表实验组的紫外吸收值, A0代表阴性对照组的紫外吸收值。
    图13表明芴的小分子衍生物/DNA探针P1在没有对细胞的增殖 产生明显的抑制作用,即本发明设计合成的探针无细胞毒性,适于生 物学研究。有趣的是,图13中细胞存活率大于100%,说明P1在低 浓度(1.56μg/mL-12.5μg/mL)范围内时反而对细胞生长有一定 的促进作用。
    实施例9:芴的小分子衍生物/DNA探针P1在细胞荧光成像中的应 用
    具体步骤:
    1.人正常肝细胞HL-770细胞消化、计数、配制成浓度为1.5× 106个/mL的细胞悬液,在预先放置盖玻片的6孔细胞培养板中每孔加 入2mL细胞悬液;
    2.将6孔细胞培养板置于37℃,5%CO2培养箱中培养24小时;
    3.将培养液去掉,PBS洗涤3次,加入不同PH值(4.0和8.0) 的HEPES缓冲液,然后加入P1使其终浓度为1μM,室温染色15分 钟;
    4.染色结束后弃去缓冲液,加入完全培养基;
    5.观察:激光共聚焦显微镜下观察细胞荧光表达情况,激发波长 为340nm,显微放大倍数为400X。
    图14表明P1在酸性(pH4)下荧光淬灭,细胞没有显示荧光标 记;而在碱性(pH8)下,细胞质被P1染上蓝色荧光(如图14d和 f)。这与实施例7所述P1在pH4条件下荧光淬灭,而在pH8条件 下荧光增强的结论相一致。

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    一种 荧光 分子 开关 及其 探针 应用
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