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    重庆时时彩后2计划: 血流量的评价或间接测定方法.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201410563850.2

    申请日:

    2014.10.21

    公开号:

    CN104777306A

    公开日:

    2015.07.15

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/68申请日:20141021|||公开
    IPC分类号: G01N33/68 主分类号: G01N33/68
    申请人: 株式会社芳珂
    发明人: 榎本有希子; 池田麻里子
    地址: 日本神奈川县横滨市中区山下町89番地1
    优先权: 2014-002663 2014.01.09 JP
    专利代理机构: 北京连和连知识产权代理有限公司11278 代理人: 李钦鹏
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201410563850.2

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2018.05.01|||2017.01.18|||2015.07.15

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明的课题在于提供不是外科摘取皮肤而对皮肤带来刺激等的方法,而是可简便且确实地测定或评价血流状态的使用生物化学指标的新颖的测定或评价方法。一种皮肤血流量的间接测定或评价方法,其特征在于,以皮肤角质层中的白细胞介素-1受体拮抗剂及/或白细胞介素-1α的表达量作为指标。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种皮肤血流量的间接测定或评价方法,其特征在于,以皮肤角 质层中的白细胞介素-1受体拮抗剂及/或白细胞介素-1α的表达量作为指 标。

    2.  根据权利要求1所述的方法,其特征在于,用于测定或评价方法 的皮肤角质层通过胶带剥离法进行采集。

    3.  一种方法,其特征在于,从基于预先测定的血流量与皮肤角质层 中的白细胞介素-1受体拮抗剂及/或白细胞介素-1α的表达量的相关性制 作的相关式来间接测定皮肤的血流量。

    4.  一种皮肤血流量的间接测定法,其特征在于,由以下工序构成:
    采集角质层的采集工序、
    测定所述采集工序中所采集的角质层中的白细胞介素-1受体拮抗剂、 白细胞介素-1α的表达量的测定工序,和
    将所述测定工序中所测定的白细胞介素-1受体拮抗剂、白细胞介素-1 α的表达量通过下述回归式换算成皮肤血流量的工序,所述回归式为从预 先测定的集体角质层中的白细胞介素-1受体拮抗剂、白细胞介素-1α的表 达量分布求出的得到血流量相关的回归式。

    5.  一种皮肤血流量的评价方法,其特征在于,与基于预先测定的血 流量与皮肤角质层中的白细胞介素-1受体拮抗剂及/或白细胞介素-1α的 表达量的相关性制作的散点图进行对比来评价。

    6.  一种皮肤血流的评价方法,其特征在于,由以下工序构成:
    采集角质层的采集工序、
    测定所述采集工序中所采集的角质层中的白细胞介素-1受体拮抗剂、 白细胞介素-1α的表达量的测定工序,和
    将所述测定工序中所测定的白细胞介素-1受体拮抗剂、白细胞介素-1 α的表达量与预先测定的集体角质层中的白细胞介素-1受体拮抗剂、白细 胞介素-1α的表达量分布进行对比的对比工序。

    说明书

    说明书血流量的评价或间接测定方法
    技术领域
    本发明涉及肌肤血流量的水平评价或间接测定方法。
    背景技术
    作为肌肤老化现象的原因之一,可列举血液循环不良所导致的肤色红 润度的降低。该肌肤红润度的降低现象在明显时作为“肌肤暗沉”出现, 是通过化妆难以弥补的现象。其次,可以说通过改善肌肤的血流,可期待 提高透明性及明亮度且促进皮肤组织的代谢活性、激活细胞,作为其结果, 可应对以暗沉的原因为主的肌肤各种老化现象的原因。
    肌肤组织因血流量增加而代谢被促进从而除去废物。例如,开发了通 过照射根据化学发光的包含近红外线的光来改善肌肤血流的技术(专利文 献1:WO2005/077458号公报)。在专利文献1中使用激光多普勒血流仪 来测定肌肤血流量的变化。
    这样,为了评价肌肤的健康状态,需要测定皮肤的血流量。与所述的 激光多普勒式血流仪同样,使用激光的多通道式血流仪(专利文献2:日 本专利第3783491号公报)、加压式血流仪(专利文献3:日本特开平 11-285476号公报)也被用于肌肤的血流测定。然而,在测定时需要直接 用血流量计测定受试者,为了测定远方受试者的肌肤血流量,除非将测定 装置设置在受试者的住处附近或者受试者直接借调到测定装置的设置场 所,否则就不可能测定。
    现有技术文献
    专利文献
    专利文献1WO2005/077458号公报
    专利文献2日本专利第3783491号公报
    专利文献3日本特开平11-285476号公报
    发明内容
    如上所述,为了能够间接地评价远方受试者的血流状态,期望使用从 受试者采集的角质层来间接地测定或评价血流量。
    本发明的课题在于提供不是外科摘取皮肤而对皮肤带来刺激等的方 法,而是可简便且确实地测定或评价血流状态的使用生物化学指标的新颖 的测定或评价方法。
    本发明为以下的构成。
    (1)一种皮肤血流量的间接测定或评价方法,其特征在于,以皮肤角 质层中的白细胞介素-1受体拮抗剂及/或白细胞介素-1α的表达量作为指 标。
    (2)根据(1)所述的方法,其特征在于,用于测定或评价方法的皮 肤角质层通过胶带剥离法进行采集。
    (3)一种方法,其特征在于,从基于预先测定的血流量与皮肤角质层 中的白细胞介素-1受体拮抗剂及/或白细胞介素-1α的表达量的相关性制 作的相关式来间接测定皮肤的血流量。
    (4)一种皮肤血流量的间接测定法,其特征在于,由以下工序构成: 采集角质层的采集工序、测定所述采集工序中所采集的角质层中的白细胞 介素-1受体拮抗剂、白细胞介素-1α的表达量的测定工序和将所述测定工 序中所测定的白细胞介素-1受体拮抗剂、白细胞介素-1α的表达量通过下 述回归式换算成皮肤血流量的工序,所述回归式为从预先测定的集体角质 层中的白细胞介素-1受体拮抗剂、白细胞介素-1α的表达量分布求出的得 到血流量相关的回归式。
    (5)一种皮肤血流量的评价方法,其特征在于,与基于预先测定的血 流量与皮肤角质层中的白细胞介素-1受体拮抗剂及/或白细胞介素-1α的 表达量的相关性制作的散点图进行对比来评价。
    (6)一种皮肤血流的评价方法,其特征在于,由以下工序构成:采集 角质层的采集工序、测定所述采集工序中所采集的角质层中的白细胞介素 -1受体拮抗剂、白细胞介素-1α的表达量的测定工序和将所述测定工序中 所测定的白细胞介素-1受体拮抗剂、白细胞介素-1α的表达量与预先测定 的集体角质层中的白细胞介素-1受体拮抗剂、白细胞介素-1α的表达量分 布进行对比的对比工序。
    根据本发明的方法,皮肤血流的测定或评价可通过测定角质层中的白 细胞介素-1受体拮抗剂或白细胞介素-1α的表达量来间接地测定或评价。
    此外,由于本发明的方法可通过胶带剥离法等简便的操作方法来采集 评价试样,所以受试者的负担少,无论谁均可简单地进行评价。
    由于特别是使用从远方受试者采集的样品,例如,通过胶带剥离法的 角质层可简便间接地评价肌肤血流量或者血流的状态,所以不需要受试者 直接来试验场所。这样的话,成为血流量测定对象的适用范围广,可简便 地诊断或评价皮肤的状态。
    进而,不需要用血流量计直接测定受试者,即使为远方的受试者只要 可得到角质层就可简便地测定或评价皮肤血流量。
    进而,根据本发明的方法可客观地评价肌肤状态、化妆品等的效果。
    附图说明
    图1为将皮肤角质层中的白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1RA)和与皮 肤血流量成比例的相对输出量(relative output amount)(V)的测定结果制 成散点图并求出了回归直线的图。
    图2为将皮肤角质层中的白细胞介素-1α(IL-1α)和与皮肤血流量成 比例的相对输出量(V)的测定结果制成散点图并求出了回归直线的图。
    具体实施方式
    本发明为涉及皮肤血流量的间接测定或评价方法的发明,其特征在于, 以皮肤角质层中的白细胞介素-1受体拮抗剂及/或白细胞介素-1α的表达 量作为指标。
    以下,关于本发明进行详细说明。
    本发明的血流量的测定或评价方法的特征在于,以皮肤角质层中的白 细胞介素-1受体拮抗剂(以下,叫做IL-1RA。)或白细胞介素-1α(以下, 叫做IL-1α。)的表达量作为指标。
    本发明中的血流量是指用激光多普勒血流量计测定的皮肤毛细血管内 的血流量。发现用激光多普勒血流量计测定的血流量与皮肤角质层中的 IL-1RA或IL-1α的表达量相关。因此,通过测定IL-1RA或IL-1α的皮肤 角质层中的表达量,可间接地对皮肤血流量或皮肤血流状态进行评价。
    IL-1RA是单核细胞、巨噬细胞等产生的抗炎症性的细胞因子,炎症时 增加并使皮肤正?;?。IL-1RA拮抗性地阻碍白细胞介素-1的功能。在细胞 水平IL-1RA增加时,作为分解并片段化胶原蛋白的酶的基质金属蛋白酶-1 减少。
    IL-1α是单核细胞、巨噬细胞等产生的促炎症性的细胞因子,活化淋 巴细胞、巨噬细胞并引起炎症。IL-1RA拮抗性地阻碍白细胞介素-1的功能。 已知IL-1α增加时,作为分解并片段化胶原蛋白的酶的基质金属蛋白酶-1 增加。
    角质层是位于皮肤最上层的组织,具有?;てし舨皇芾醋蕴逋獾囊煳?、 刺激的功能。
    本发明中的测定或评价对象部位只要是可取得角质层的部分,则还可 包含任意部位,作为主要的部位,可列举面部、颈部、上臂部??筛菀?往的方法得到来自上述部位皮肤的角质层。然而,如前所述,由于外科摘 取皮肤等的方法会给使用者带来负担,所以优选胶带剥离法、刮擦等可简 便地得到角质层的方法。特别优选胶带剥离法。
    这样准备的各试样中的IL-1RA或IL-1α的表达量可用以往已知的方 法进行测定。例如,可使用基于与IL-1RA或IL-1α的抗体进行反应的酶 联免疫测定法、放射免疫测定法、蛋白质印迹测定法等的方法。这样的测 定手段已有市售,作为代表性的IL-1RA的酶联免疫测定试剂盒,可例示 R&D Systems制的Human IL-1RA/IL-1F3Quantikine ELISA Kit、Life  Technologies公司制的IL-1RA Human ELISA Kit。
    另外,作为代表性的IL-1α的酶联免疫测定试剂盒,可例示R&D  Systems制的Human IL-1α/IL-1F1Quantikine ELISA Kit、Thermo Scientific 公司制的Human IL-1alpha ELISA Kit。
    从各试样中将IL-1RA、IL-1α经过其自身已知的生物化学方法,例如 冻融法、超声波破碎法、均质法等作为可溶性组分进行提取。提取后迅速 地进行测定。
    由于皮肤血流量多的人的角质层中的IL-1RA表达量高于皮肤血流量 少的人的角质层中的IL-1RA表达量,所以可将角质层中的IL-1RA表达量 的多寡作为指标,简便地测定或评价皮肤血流量的多寡。
    另外,由于皮肤血流量多的人的角质层中的IL-1α表达量低于皮肤血 流量少的人的角质层中的IL-1α表达量,所以可将角质层中的IL-1α表达 量的多寡作为指标,简便地评价皮肤血流量的多寡。
    本发明所使用的角质层可通过胶带剥离法这样的用角质层胶带仅采集 角质层的表层部分的简单方法进行采集。因此不会给受试者带来负担,可 测定受试者的皮肤血流量或评价皮肤的血流状态。
    本发明的皮肤血流量的测定方法由以下工序构成:采集角质层的采集 工序、测定所述采集工序中所采集的角质层中的IL-1RA、IL-1α的表达量 的测定工序和将所述测定工序中所测定的IL-1RA、IL-1α的表达量通过下 述回归式换算成皮肤血流量的工序,即从预先测定的集体角质层中的 IL-1RA、IL-1α的表达量分布求出的得到血流量相关的回归式。
    本发明的皮肤血流量的评价方法由以下工序构成:采集角质层的采集 工序、测定所述采集工序中所采集的角质层中的IL-1RA、IL-1α的表达量 的测定工序和将所述测定工序中所测定的IL-1RA、IL-1α的表达量与预先 测定的集体角质层中的IL-1RA、IL-1α的表达量分布进行对比的对比工 序。受试者的IL-1RA表达量与预先测定的集体角质层中的IL-1RA表达量 分布相比,当表达量多时,判定为皮肤的血流量大,当表达量少时,判定 为皮肤的血流量小。受试者的IL-1α表达量与预先测定的集体角质层中的 IL-1α表达量分布相比,当表达量多时,判定为皮肤的血流量小,当表达 量少时,判定为皮肤的血流量大。
    以下,关于具体的实施例进行说明,但本发明不限定于下述实施例。
    实施例
    试验例1
    受试集体的皮肤血流量的测定结果与IL-1RA表达量测定结果的分布 相关。
    <受试者>
    将75名健康女性脸颊的角质层通过胶带剥离法进行采集。
    <角质层样品提取方法、蛋白质定量>
    在受试者的脸颊贴上角质层测试片(ASAHIBIOMED公司制)来采集角 质层。从角质层测试片用珠磨法(在容器中加入受试物、直径约2mm的 玻璃珠和提取液进行振荡提取的方法)使用500μl的T-PER提取缓冲液 (Tissue Protein ExtRAction Reagent Thermo Scientific制(product#78510) 来进行角质层蛋白质的提取。各样品的蛋白质量通过Pierce BCA protein  Assay Kit(Thermo Scientific#23225)进行测定。测定时,在10μl所述角质 层蛋白质提取液中加入200μl Pierce BCA protein Assay Kit的反应试剂液, 在60℃孵育30分钟后,测定562nm处的吸光度。同时,用BSA(牛血清 白蛋白)制作标准曲线,从吸光度的值计算蛋白质量。
    <角质层中的IL-1RA的表达量测定>
    同样地将从胶带提取的角质层蛋白质提取液中的IL-1RA表达量使用 R&D systems的ELISA试剂盒[Human IL-1RA/IL-1F3Quantikine ELISA  Kit]进行测定。首先,在costar制的96孔板(#3590)中将成为初次抗体 的固相化抗体用试剂盒指定的浓度在20℃过夜进行固相化。接着,用 1%BSA在37℃下放置1小时来封闭培养板,并用0.01%Tween-PBS洗净 培养板后,将各100μl成为标准曲线的标准品及样品进行加样,在25℃ 孵育2小时。用0.01%Tween-PBS洗净培养板后,将2次抗体用试剂盒指 定浓度在25℃下孵育2小时。进而,用0.01%Tween-PBS洗净培养板后, 将Streptavidin-HRP用试剂盒指定浓度在25℃下孵育30分钟。最后,用 0.01%Tween-PBS洗净培养板后,按照100μl/well加入作为显色基质的 TMB solution(Promega,G7431)),经过试剂盒指定的时间后,加入100μl 终止液(0.5M硫酸),测定450nm处的吸光度来计算IL-1RA的表达量。
    <皮肤血流量的测定>
    使用激光多普勒血流量计(Lisca Ab制PIMII Laser Doppler Perfusion  Imager)测定与受试者脸颊的血流量成比例的相对输出量(V)。
    <结果>
    X轴为IL1-RA表达量、Y轴为与血流量成比例的相对输出量(V) 将测定结果制成散点图,以该散布数据为基础求出直线回归式。散点图及 回归直线、相关系数、相关式如图1所示。
    X轴为IL1-RA值、Y轴为与血流量成比例的相对输出量(V)时, 回归式表示Y=0.005110+0.4434、R2=0.0703、相关系数0.27的直线回归。
    可从图1所示的回归直线或回归式将测定的IL1-RA换算成与血流量 成比例的相对输出量(V)。此外,从散点图判明与标准的皮肤血流量成 比例的相对输出量(V)的分布。只要基于该散点图及回归式,通过测定 皮肤角质层中的IL-1RA的表达量,皮肤的血流量即可知,而且从分布可 评价受试者的血流量是否正常。
    试验例2
    与受试集体的皮肤血流量成比例的相对输出量(V)的测定结果和IL-1 α的表达量测定结果的分布相关。
    <受试者>
    将73名健康女性脸颊的角质层通过胶带剥离法进行采集。
    <角质层样品提取方法、蛋白质定量>
    与IL-1RA的测定同样地进行测定。
    <角质层中的IL-1α的测定>
    与试验例1同样地将从胶带提取的角质层蛋白质提取液中的IL-1α表 达量使用R&D systems的ELISA试剂盒[Human IL-1α/IL-1F1Quantikine  ELISA Kit]进行测定。首先,在costar制的96孔板(#3590)中将成为初 次抗体的固相化抗体用试剂盒指定的浓度在20℃过夜进行固相化。接着, 用1%BSA在37℃下放置1小时来封闭培养板,并用0.01%Tween-PBS洗 净培养板后,将各100μl成为标准曲线的标准品及样品进行加样,在25 ℃孵育2小时。用0.01%Tween-PBS洗净培养板后,将2次抗体用试剂盒 指定浓度在25℃下孵育2小时。进而,用0.01%Tween-PBS洗净培养板后, 将Streptavidin-HRP用试剂盒指定浓度在25℃下孵育30分钟。最后,用 0.01%Tween-PBS洗净培养板后,按照100μl/well加入作为显色基质的 TMB solution(Promega,G7431),经过试剂盒指定的时间后,加入100μl终 止液(0.5M硫酸),测定450nm处的吸光度并计算表达量。
    <皮肤血流量的测定>
    与试验例1同样,使用激光多普勒血流量计(Lisca Ab制PIMII Laser  Doppler Perfusion Imager)测定与受试者脸颊的血流量成比例的相对输出量 (V)。
    <结果>
    X轴为IL-1α表达量、Y轴为血流量将测定结果制成散点图,以该散 布数据为基础求出直线回归式。散点图及回归直线、相关系数、相关式如 图2所示。
    X轴为IL-1α值、Y轴为与血流量成比例的相对输出量(V)时,回 归式表示Y=-0.1873X+0.5681、R2=0.0912、相关系数0.30的负的直线 回归。
    可从图1所示的回归直线或回归式将测定的IL-1α换算成血流量。此 外,从散点图判明了标准的皮肤血流量的分布。只要基于该散点图及回归 式,通过测定皮肤角质层中的IL-1α的表达量,皮肤的血流量即可知,而 且从分布可评价受试者的血流量是否正常。

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    血流 评价 间接 测定 方法
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