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    重庆时时彩后三杀号技巧qq: 一种白塞氏病检测的生物标志物及其用途.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201510169222.0

    申请日:

    2015.04.10

    公开号:

    CN104777300A

    公开日:

    2015.07.15

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/558申请日:20150410|||公开
    IPC分类号: G01N33/558; G01N33/532 主分类号: G01N33/558
    申请人: 中国医学科学院北京协和医院
    发明人: 李永哲; 胡朝军; 朱衡; 宋光; 吴子燕; 陈思; 张奉春
    地址: 100032北京市西城区大木仓胡同41号
    优先权:
    专利代理机构: 北京智为时代知识产权代理事务所(普通合伙)11498 代理人: 王加岭; 杨静
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201510169222.0

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2016.06.22|||2015.08.12|||2015.07.15

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明提供RNA聚合酶II亚基A C-末端结构域的磷酸酶(CTDP1)或其片段在制备用于诊断白塞氏病的试剂中的用途。本发明的CTDP1或其片段在BD患者中的阳性率显著高于正常对照,Western blot验证结果显示BD患者血清中可检测到抗CTDP1抗体,证明CTDP1或其片段可用作BD的检测标志物。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  RNA聚合酶II亚基AC-末端结构域的磷酸酶(CTDP1)或其片 段在制备用于诊断白塞氏病的试剂中的用途。

    2.  如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述诊断包括:测 定获自呈现白塞氏病症状的患者的生物样品中对RNA聚合酶II亚基 AC-末端结构域的磷酸酶(CTDP1)或其片段的反应性的抗体的水平; 任选地,
    与对照数据比较所述生物样品中抗体的水平,其中相对于所述对 照数据所述样品中对CTDP1为反应性的抗体的可检测的提高表明白 塞氏病的可能性。

    3.  如权利要求1或2所述的用途,其中,所述生物样品为血清 样品。

    4.  如权利要求1或2所述的用途,其中,CTDP1抗体的水平通 过以下步骤来测量,包括:
    a.使来自患者的样品与CTDP1或其片段接触;
    b.在样品中存在的抗体与CTDP1或其片段之间形成抗体-蛋白 质复合物;
    c.洗涤来除去任何未结合的抗体;
    d.添加被标记的并且对来自样品的抗体为反应性的检测抗体;
    e.洗涤来除去任何未结合的标记的检测抗体;和
    f.将所述标记物转化为可检测信号;其中可检测信号的存在表明 所述患者中CTDP1的可能性。

    5.  如如权利要求4所述的用途,其中,所述的CTDP1或其片段 沉积或固定在固相支持物上。

    6.  权利要求5的用途,其中,所述支持物是乳胶珠子或多孔平 板的形式。

    7.  如权利要求4所述的用途,其中,所述检测抗体通过共价连 接到酶、具有荧光化合物或金属的标记物、或具有化学发光化合物的 标记物来标记。

    8.  一种用于鉴定来自患者的样品中对CTDP1为反应性的抗体的 存在或水平的设备,包括:
    a.至少一种CTDP1蛋白质或其片段;和
    b.至少一种固相支持物,其中所述CTDP1蛋白质或其片段沉积 在所述支持物上。

    9.  如权利要求8所述的设备,进一步包括检测抗体,其中所述 检测抗体特异于所述患者的样品中对CTDP1为反应性的抗体,并且 所述检测抗体产生可检测信号。

    10.  如权利要求9所述的设备,其中,所述患者的样品为血清样 品。

    说明书

    说明书一种白塞氏病检测的生物标志物及其用途
    技术领域
    本发明属于生物检测领域,具体涉及一种白塞氏病检测的生物标 志物及其用途。
    背景技术
    白塞氏病(Behcet's disease,BD)又称贝赫切特综合征(Behcet  syndrome,BS),是一种病因不明、高发病率、复发性、大小血管 炎并存的常见系统性自身免疫性疾病。1937年Hulusi Behcet首次描 述了口腔和生殖器溃疡、前房积脓和葡萄膜炎复杂三联症状的三名 患者。随后的研究表明该病是一种多系统受累,临床表现复杂多变 的系统性自身免疫病?;颊叱34嬖诜锤吹目谇缓蜕称骼Q?、关 节炎、葡萄膜炎、皮肤病变、血栓性静脉炎、以及胃肠道和中枢神 经系统受累。BD可见于全世界,而主要好发于位于北纬30度到45 度之间的中东和地中海国家,而少见与美洲大陆,大洋洲和非洲撒 哈拉以南地区,因其分布与古老的“丝绸之路”一致,故又称为 “丝绸之路疾病”,该疾病分布明显的地域性表明该病与特定的易 感基因相关。
    白塞病好发年龄为16-50岁,以口腔溃疡、生殖器溃疡、眼 炎,进而引起感染、失明、动脉瘤等严重后果主要特征。各国学者 经过多年的深入研究,BD领域的研究取得了许多重要的成果,既往 认为BD是一种少见的自身免疫性疾病,近年来随着自身免疫性疾病 知识普及、临床医生认识能力的提高以及环境因素的恶化,诊断为 BD的患者不断增加。白塞病的发病是遗传因素与环境因素共同作用 的结果。调查研究结果显示BD在西方国家的发病率远低于亚洲国 家,如美国BD的发病率为8.6/百万、英国为0.64/百万、西班牙为 6.4/百万、德国为4.2/百万、法国为7.2/百万。而在土耳其BD的发病 率为20-421/百万、伊朗为80/百万、以色列为120/百万。遗传因素 中,HLA B51被认为是与BD关系最为密切,而且MHC Ⅰ连锁相关 基因A(MIC-A)与HLA-B51存在显著的连锁不平衡。最新的研究资 料表明BD患者HLA-B51/B5与临床表现密切相关。研究表明,我国 白塞病患者有自身的遗传特点,BD在我国的发病率明显高于其他地 区,为美洲地区发病率的14倍。BD的发病机制至今仍没有完全阐 明。虽然该病具有遗传易感性,但环境因素和免疫异常在发病中也 起到关键作用。在环境因素中,各种病原体感染等通过分子模拟机 制使机体免疫耐受瓦解,导致抗原特异性T细胞活化产生异常免疫 反应导致机体损伤,白塞病患者体内发现升高的Th1相关细胞因 子,如IFN-γ,IL-12以及肿瘤坏死因子(TNF)-α。
    白塞病最常见的临床表现为反复的口腔溃疡占,该临床症状可 出现在98%的BD患者,而且列入白塞病的诊断指南中。反复口腔溃 疡往往比其他临床表现早出现,但是该症状也可出现在其他疾病患 者,而并非白塞病的特异性临床症状。生殖器溃疡也是BD的常见症 状,通常发生在男性阴囊,而龟头上罕见。而且白塞病患者与Reiter 综合症和性病患者不同,BD患者并不伴随尿道炎或排尿困难。对于 女性患者,溃疡往往同时发生在大小阴唇。眼睛受累也是白塞病常 见的临床表现,发生率高达30%-70%,而且往往影响患者视力,25% 的患者甚至导致失明的严重后果。皮损在BD患者的发生率达到 38-99%,神经系统受累为5-10%,受累患者往往死亡率较高。白塞 病患者的血管受损常同时累计动静脉,而且静脉受损更为常见。白 塞病患者胃肠道受累发生率为3-26%,包括厌食,呕吐,消化不 良,腹泻,腹痛。针刺反应是临床用于诊断BD病患者的一个常用试 验,其实质为皮肤非特异性过敏反应,即针刺后12-48h开始出现米 粒大小的红色斑丘疹,继而发展为水疱、脓疱和结痂,约1-2周消退。 针刺反应在白塞病中的阳性率57.9%-70%,高于正常人群,在男性明 显高于女性。与病情活动有一定相关性,病情重时阳性率高,程度 重。
    由于白塞病缺乏特异性的临床表现,各国学者近年来对白塞病 血清标志物的研究不断深入??鼓谄は赴固迨前兹』颊叱<?自身抗体,其在BD患者的阳性率13%,但该抗体也可出现其他多种 血管受损的自身免疫性疾病患者,在正常人其阳性率也可达5%???内皮细胞抗原阳性常与BD患者的肺动脉高压存在一定联系。随着研 究的深入,研究者不断在BD患者中鉴定出针对内皮细胞上多种靶抗 原的相关自身抗体。Lee等采用双向凝胶电泳和质谱联用技术对BD 患者血清进行研究,在AECA阳性BD患者中鉴定出靶抗原为α烯醇 化酶??功料┐蓟缚固逶贐D患者的阳性率为45%,在韦格纳肉芽 肿(Wegener's granulomatosis,WG)等其他免疫病患者也存在较高阳 性率,WG(100%),RA(16.7%)。Cho等对BD患者研究,发现 抗核不均一核蛋白A2/B1抗体(hnRNP-A2/B1),IgA型抗核不均 一核蛋白A2/B1抗体在BD患者的阳性率为83.3%,在SLE患者的 阳性率为13.3%,在RA患者的阳性率为26.7%,TA患者的阳性率为 30%,正常人中的阳性率为20%。因此,抗核不均一核蛋白A2/B1 抗体对BD的诊断价值有限,临床意义不大。2007年,Federica等在 BD患者中发现抗Sip-1抗体,其在BD患者中的阳性率,IgG型为 20%,IgM型为41%,IgA型为17%。该抗体在SLE、SSc、IBD、葡 萄膜炎患者中少见,但是在原发性血管炎患者IgM型阳性率高达 45%??筍ip-1抗体是内皮细胞活化和炎症反应的标志,其在BD患 者中的诊断价值有限。Paola采用人脐静脉内皮细胞cDNA文库技术 在内皮细胞抗体阳性BD患者血清中鉴定出RLIP-76为BD患者靶抗 原,其IgG型自身抗体的阳性率为30%,该抗体在在SS中的阳性率 为17%,在SLE中的阳性率为25%,该抗体的出现与内皮细胞损伤 有关。Yiping等采用人脐静脉内皮细胞裂解物进行双向凝胶电泳和 质谱联用技术在BD患者中发现抑制素(prohibitin)为BD的靶抗 原。ELISA结果显示抗抑制素抗体在BD患者的阳性率为28%,在 SLE患者的阳性率6%。Peng采用人脐静脉内皮细胞裂解物进行双向 凝胶电泳和质谱联用技术在BD患者中鉴定出BD靶抗原热休克蛋白 27(HSP27),抗原热休克蛋白27抗体在BD患者阳性率57%,SLE 患者阳性率24%,RA患者阳性率72%,SS患者阳性率36%,其临 床诊断价值较低。该研究团队采用相似的研究技术在BD患者中还发 现了抗膜联蛋白A2抗体,在BD患者其阳性率为34%,在SLE患者 为7%,SS患者为8%。由此可见,内皮细胞抗体及其相关靶抗原对 应的自身抗体并非BD患者特异性自身抗体,这类抗体的出现与患者 的血管损伤相关,可出现于各种血管受损的自身免疫病患者,如 RA、SLE、SS、SSc等。
    除了内皮细胞相关自身抗体外,各国研究者采用各种不同的研 究技术在BD患者中还发现了许多针对其他靶抗原的自身抗体。 Okunuki等学者采用经典的双向凝聚电泳技术对BD并发葡萄膜炎患 者血清进行血清标志物研究,经质谱鉴定后,在BD患者发现3种 BD相关自身抗体:抗α-烯醇酶S-抗原抗体,抗硒相关蛋白(SBP) 抗体,其中抗SBP抗体为新发现的血清标志物,是一个视网膜自身 抗原,其在BD患者的阳性率为16%。Yu Lu等学者利用cDNA文库 筛选BD相关自身抗体,研究发现抗kinectin抗体在BD患者的阳性 率高达23%。但随后的研究发现该抗体在其他自身免疫病pSS、 SLE、MCTD、和RA患者中的阳性率达到12.5%到25%,除此之 外,该抗体在肿瘤患者如肝细胞癌患者中存在较高的阳性率。2014 年,Morishima采用包含9000个人类基因编码蛋白的蛋白芯片技术 对BD患者血清进行筛查研究,研究结果显示BD患者中存在抗紧密 连接蛋白-1抗体,由于该研究涉及的研究标本量不足,尚不能明确 该抗体在BD患者的阳性率及临床应用价值。
    血管损伤是BD患者重要的临床表现,研究发现在BD患者存在 抗氧化修饰低密度脂蛋白抗体。因此该抗体的的出现与血管内皮细 胞受损和功能障碍密切相关,参与了在BD患者发生动脉粥样硬化的 病理过程,在BD患者血管受损过程中起到一定作用。虽然血管受损 是BD患者常见的临床表现,但并非其特异性临床表现,因此,抗氧 化修饰低密度脂蛋白抗体也广泛出现于其他血管受损的SLE、SV患 者,该抗体的出现仅是与特定临床表现相关,而并非BD的特异性自 身抗体。Bassyouni采用ELISA法在BD患者中检测抗C1q抗体,其 阳性率为18%,而且在血管损伤的BD患者其阳性率高达42%,远高 于无血管损伤的BD患者。血栓形成是BD患者常见的临床症状,但 Aslan的研究结果表明抗膜联蛋白Ⅴ抗体在BD并发血栓形成组和单 纯BD患者组间并无显著性差异,由此表明抗抗膜联蛋白Ⅴ抗体在 BD患者血栓形成中意义较小。
    除了研究用于BD临床诊断相关的自身抗体,还有学者对BD治 疗相关的自身抗体进行研究。IFN-α2a是治疗BD患者的常用药物, 但是在使用该药物治疗的过程中约26.6%的患者会产生抗IFN-α2a 抗体,该抗体的发生率与IFN-α2a的使用剂量无相关性。同时,产 生抗IFN-α2a抗体的BD患者产生其他自身抗体的可能性也较高。
    由于BD患者缺乏特异性的临床表现和实验室诊断指标,目前 BD的诊断仍旧基于临床经验的诊断,因此临床上对于BD的诊断和 鉴别诊断常常非常困难。BD患者如不积极有效地治疗会造成极大痛 苦,严重影响患者生活质量,甚至引起感染、失明、动脉瘤等严重 后果,眼、中枢神经系统及大血管受累者预后不佳,已引起临床工 作者的高度关注。BD给患者带来巨大的痛苦,随着对BD的研究不 断深入,各种全新的治疗BD的有效药物不断出现,BD的治疗模式 由无药可治逐渐转变为多种治疗方案的优化选择、由晚期的对症治 疗逐渐转变为防止严重后果、提高患者生活质量的早期治疗,因此 临床早期诊断积极治疗可让BD患者获益匪浅,使BD患者的生活质 量近年来得到极大的提高。
    BD发病机制不明,临床早期诊断积极治疗可让BD患者获益匪 浅。BD发病机理不明,虽然具有遗传易感性,但环境因素和免疫异 常在发病中也起到关键作用。BD患者虽然HLA-B*51和血清抗内皮 细胞抗体阳性,但并不特异,因此目前临床尚无可靠的诊断BD的血 清学指标,BD的诊断主要靠并无特异性的临床表现,需要与多种自 身免疫性疾病鉴别。许多BD患者得不到及时正确诊断和治疗。而且 BD缺乏病情评估的指标。这些临床存在的问题和面临的挑战都是目 前需要对BD进行不断深入研究逐步解决。
    白塞病是一种慢性全身性血管炎症性疾病,主要表现为复发性 口腔溃疡、生殖器溃疡、眼炎及皮肤损害,也可累及血管、神经系 统、消化道、关节、肺、肾、附睾等器官,大部分患者预后良好, 眼、中枢神经系统及大血管受累者预后不佳。目前由于白塞病的诊 断缺乏特异性实验室检查指标,BD患者的诊断主要依靠1989年制 定的临床标准。虽然BD患者HLA-B*51和血清抗内皮细胞抗体阳 性,但并不特异,这些指标在其他自身免疫性疾病患者也有相似的 阳性率。因此,白塞病的诊断主要依靠临床表现,如口腔溃疡、生 殖器溃疡、眼炎及皮肤损害,但是这些临床特征并不特异,而且有 时患者需经历数年甚至更长时间才相继出现这些临床特征,因此, 由于缺乏特异性的临床表现和特异性的实验室诊断指标,白塞病的 临床诊断非常困难,许多白塞病患者得不到及时正确的诊断,延误 病情给患者造成不可逆转的损伤和痛苦。
    自身抗体是指由免疫系统产生的针对个体自身组织、器官、细 胞及细胞成分的抗体的总称。一般情况下,机体自身不产生(或仅产 生低滴度的)针对自身抗原的抗体。当机体遭受感染、损伤或其他理 化因素影响,使自身抗原暴露、变性、损伤、移位导致免疫识别紊 乱,免疫功能失调,免疫耐受瓦解时,机体会产生针对自身抗原成 分的抗体,若造成免疫性病理损伤或功能障碍,则称为自身免疫性 疾病。高滴度的特异性自身抗体常常是自身免疫性疾病的血清学特 征之一,于是自身抗体检测已成为自身免疫性疾病诊断不可或缺的 有效手段之一,并已列入多种自身免疫性疾病的诊断指南,成为多 种自身免疫性疾病的诊断标准之一。自身抗体检测结果也是自身免 疫性疾病病情评估和疾病预后判断的有效指标。
    血清抗体标志物在自身免疫性疾病的发病过程中产生,而且往 往会在疾病具有典型临床表现和任何实验室或影像学检测异常前数 年甚至10余年前出现,自身抗体在体内的出现早于自身免疫性疾病 临床症状的出现。现有的研究结果表明自身抗体是自身免疫性疾病 的早期标志物。多种自身免疫性疾病患者体内,自身抗体的出现往 往早于患者临床症状的出现,如PBC患者体内的AMA-M2可以在患 者任何临床症状或其他实验室检测指标异常前10年出现,SLE相关 自身抗体可以在SLE患者出现临床症状前平均9.4年检测到,RA相 关抗CCP抗体可以在RA患者出现临床症状前平均4.5年检测到。由 于自身免疫性疾病的发病及疾病发展是一个相对缓慢的过程,许多 自身免疫性疾病都存在较长的亚临床期。处于亚临床期的自身免疫 性疾病患者,除了能检测到疾病相关的自身抗体外无任何典型临床 症状和任何实验室其他检测指标异常。因此,临床常?;岢鱿忠欢?比例的就诊人群某些自身抗体检测结果阳性而患者没有临床症状或 者没有任何其他检测结果异常。随着自身免疫性疾病治疗的迅速发 展,自身免疫性疾病的早期诊断和早期治疗极大地提高了患者的生 活质量和疾病预后。由于自身抗体可以在自身免疫性疾病患者典型 临床症状出现前若干年检测到,因此,自身抗体筛查在自身免疫性 疾病的早期诊断过程中显得至关重要,自身抗体的研究对自身免疫 性疾病的早期诊断是近年来自身免疫病临床及基础研究的重点和热 点。
    因此血清自身抗体检测有助于自身免疫性疾病的早期正确诊 断。既往由于研究技术的限制,认为白塞病为血清阴性的自身免疫 病,但是随着研究的不断深入,不断有学者在白塞病患者血清中发 现自身抗体,如抗内皮细胞抗体、抗C1q抗体、抗异质核核糖核蛋 白A2/B1抗体、抗羧基末端亚基SIP1抗体和抗kinectin抗体等。由 此可以见白塞病患者并非真正血清阴性的自身免疫性疾病,而是由 于既往研究技术的限制,尚未发现有价值的白塞病血清诊断标志 物。这些自身抗体中,临床应用于BD辅助诊断的血清标志物仅抗内 皮细胞抗体,但是随着各种临床疾病研究的深入,逐渐发现抗内皮 细胞抗体并不是BD的特异性抗体,广泛存在于ANCA相关血管 炎、系统性红斑狼疮、系统性硬化症等多种自身免疫性疾病,特别 在血管炎性损伤的患者中,抗内皮细胞抗体的阳性率高达50%。因 此很多即使抗内皮细胞抗体阳性的BD患者仍得不到早期诊断,更不 用说高达50%以上的抗内皮细胞抗体阴性的BD患者诊断更加困 难。
    白塞病的早期病变一般属于临床治疗可逆转期或部分可逆转 期,治疗效果较好;而后期或终末期属于临床治疗不可逆转期,致 残致死,愈后不佳,后果严重。随着各国学者对BD研究的不断深 入,许多新的治疗药物不断用于白塞病的治疗并取得了较好的效 果,引起了BD治疗的新一轮革命。只有不断重视BD的早期认识早 期诊断和治疗,才能使白塞氏病的致残率和死亡率逐渐改善。但 是,研究证实目前各种手段仅能使部分的BD患者得到及时的诊断和 治疗,只有早期及时治疗才能使BD患者病情得到缓解,有效阻止疾 病发展,防止致残,提高生活质量。BD的早期及时正确诊断在BD 的诊疗过程中显得至关重要。但是BD发病隐匿,目前的检测手段很 难及时正确的早期诊断BD,目前临床诊断的BD患者往往血管和视 力已经开始受损,错过了最佳治疗时期。因此,BD的早期诊断已成 为BD治疗环节的重要瓶颈,严重制约着BD诊疗水平的提高。由于 BD患者的治疗有别于其他疾病,而ANCA相关血管炎疾病在人群中 的发生率较高,目前对BD的发病机制也不明确,BD患者的临床表 现非常复杂而且并不特异,因此,在临床诊疗中要及时完全准确地 把BD患者从这类人群中区分出来显得十分困难但又非常重要。随着 现在对本病的认识提高,发现现有的手段对于BD的诊治有很多局限 性(如针刺反应试验和抗内皮细胞抗体)。目前研究表明如果依靠临 床症状、影像检查以及患者血清自身抗体检查仅能发现并及时正确 诊断部分BD患者,BD的诊断显得仍旧并不十分完善。血清抗体标 志物在自身免疫性疾病的发病过程中产生,对自身免疫病的早期正 确诊断非常重要,因此彻底要做到实际意义上对BD进行早期诊断以 及有效早期治疗,以发病机制中处于重要地位的血清抗体标志物作 为整体,进一步全面系统研究BD的抗体标志物全貌,找到用于诊断 与治疗相关的BD标志物是目前BD的研究重点及临床急待解决的问 题。
    发明内容
    为了解决上述问题,本发明提供一种BD生物标志物,用于检测 BD。
    首先,本发明提供RNA聚合酶II亚基AC-末端结构域的磷酸酶 (CTDP1)或其片段在制备用于诊断白塞氏病(BD)的试剂中的用途。
    在本发明一个实施方案中,所述所述诊断包括:测定获自呈现白 塞氏病症状的患者的生物样品中对RNA聚合酶II亚基AC-末端结构 域的磷酸酶(CTDP1)或其片段的反应性的抗体的水平;任选地,
    与对照数据比较所述生物样品中抗体的水平,其中相对于所述对 照数据所述样品中对CTDP1为反应性的抗体的可检测的提高表明白 塞氏病的可能性。
    其中,所述生物样品为血清样品。
    在本发明一个实施方案中,CTDP1抗体的水平通过以下步骤来 测量,包括:
    a.使来自患者的样品与CTDP1或其片段接触;
    b.在样品中存在的抗体与CTDP1或其片段之间形成抗体-蛋白 质复合物;
    c.洗涤来除去任何未结合的抗体;
    d.添加被标记的并且对来自样品的抗体为反应性的检测抗体;
    e.洗涤来除去任何未结合的标记的检测抗体;和
    f.将所述标记物转化为可检测信号;其中可检测信号的存在表明 所述患者中CTDP1的可能性。
    其中,所述的CTDP1或其片段沉积或固定在固相支持物上。
    其中,所述支持物优选为乳胶珠子或多孔平板的形式。
    在本发明一个实施方案中,所述检测抗体通过共价连接到酶、具 有荧光化合物或金属的标记物、或具有化学发光化合物的标记物来标 记。
    进一步的,本发明还提供一种于鉴定来自患者的样品中对 CTDP1为反应性的抗体的存在或水平的设备,包括:
    a.至少一种CTDP1蛋白质或其片段;和
    b.至少一种固相支持物,其中所述CTDP1蛋白质或其片段沉积 在所述支持物上。
    在本发明设备的一个实施方案中,进一步包括检测抗体,其中所 述检测抗体特异于所述患者的样品中对CTDP1为反应性的抗体,并 且所述检测抗体产生可检测信号。
    其中,所述患者的样品为血清样品。
    本发明采用包含47616蛋白点的高通量蛋白芯片技术对40例BD 患者,15例自身免疫病对照患者和20例正常对照进行BD相关自身 抗体靶抗原的筛查,对筛查结果进行统计分析,确定36个BD相关 自身抗体。为了确认这些BD相关自身抗体的敏感性和特异性及临床 应用价值,随后采用36个BD相关自身抗体对应靶抗原构建制备BD 相关自身抗体靶抗原蛋白芯片对130例BD患者,自免病对照患者 103例(包括大动脉炎患者40例,ANCA相关血管炎患者40 例和SS患者23例)和正常对照110例血清进行临床扩大样本验证。 研究结果显示抗CTDP1抗体[RNA聚合酶II亚基AC-末端结构域的 磷酸酶(RNA polymerase II subunit A C-terminal domain phosphatase)] 在BD患者中的阳性率为23.85%(31/130)显著高于自身免疫病对照 组4.85%(5/103)(X2=15.87,P=6.79x10-5)和正常对照6.4%(7/110) (X2=13.67,P=0.000218)中的阳性率,结果差异具有显著性。 Western blot验证结果显示BD患者血清中可检测到抗CTDP1抗体, 该标志物的蛋白芯片检测结果可靠,具有可靠的方法学重复性。
    附图说明
    图1所示为BD组与自免疾病对照组和正常对照组平均阳性蛋白 点数。
    图2所示为BD患者、自身免疫病对照和正常对照血清在高密度 蛋白芯片上反应的典型结果。
    图3BD相关自身抗体靶抗原芯片上各研究组血清标本与CTDP1 杂交典型图。
    图4部分研究对象血清与CTDP1的免疫印迹检测结果。
    具体实施方式
    以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
    下述实施例中所用的研究对象和材料。
    研究对象来源于2012年2月至2014年1月北京协和医院门诊及 住院BD患者170例,其中男性91例,女性79例,年龄范围14~66 岁,平均年龄(37.1±11.6)岁。入组标准:所有患者均符合1989 年国际白塞病委员会(ISG)确定的BD分类诊断标准,所有BD患者除 外其他自身免疫性疾病(如系统性红斑狼疮、炎性肠病、类风湿关节 炎、糖尿病、强直性脊柱炎等)。疾病对照组包括:大动脉炎患者40 例,其中男性6例,女性34例,年龄范围14~52岁,平均年龄 (29.4±8.8)岁;入组标准:采用1990年美国风湿病学学会的大动 脉炎分类标准。ANCA相关血管炎患者40例,其中男性21例,女性 29例,年龄范围17~85岁,平均年龄(54.9±16.0)岁,所有患者 的诊断满足1993年ANCA相关血管炎Chapel Hill诊断共识;SS患 者28例,其中男性0例,女性28例,年龄范围14~76岁,平均年 龄(50.8±15.2)岁;正常对照组130例,来源于北京协和医院体检 中心,其中男性89例,女性41例,年龄范围21~70岁,平均年龄 (37.6±9.0)岁;
    严格按蛋白质组学研究要求留取样本,采集外周静脉血,2小时 内分离血清后分装,-80℃冻存备用。
    实施例1 高密度蛋白芯片筛选BD相关自身抗体
    高密度蛋白芯片上所有的蛋白质抗原N端均带有用于蛋白纯化 的GST标签。首先使用兔抗GST单克隆抗体与芯片蛋白杂交验证 芯片质量。接着选取40份BD患者血清、15例自身免疫病患者对照 血清和20例健康对照血清与75张高密度蛋白芯片芯片杂交,通过 信号采集及数据分析鉴定候选BD相关自身抗原。
    1、高密度蛋白芯片扫描数据的提取
    采用GenePix 4000 B芯片扫描仪扫描高通量蛋白芯片,获得 TIFF格式灰度图像,根据GenePix Pro 6.0软件的操作手册,按照 高通量芯片上样点矩阵参数,由软件自动完成每个蛋白点信号像素 分割,同时人工逐一检查芯片上所有蛋白点的信强度,手工调整避 开杂质、划痕等人为因素造成的蛋白信号点位置及大小的偏移,最 后完成每张高通量蛋白芯片上各抗原蛋白质点信号强度的提取并生 成数据文档备后续分析使用。
    2、高密度蛋白芯片检测质量评估
    使用抗GST抗体杂交高密度蛋白芯片后的灰度图像,完成芯片 每个蛋白点信号强度采集后,当芯片上探针的两平行点的信噪比 (Signal to Noise Ratio,SNR)同时大于2时才认为芯片上该蛋白点 可被检测。然后计算芯片上可被检测的蛋白质点的比例及每个蛋白 两个平行点之间信号强度的相关性。
    3、高密度蛋白芯片检测血清自身抗体
    用于高密度蛋白芯片检测的血清标本包括BD患者40例,自免 病对照患者15例,正常对照20例。相关资料见表1,具体操作步骤 如下:
    表1 用于高密度蛋白芯片检测的血清标本
    分组 例数 男女比例 年龄范围 平均年龄 BD 40 26/14 15-66 40.0±12.2 自免病对照组 15 1/14 32-65 45.0±9.7 正常对照组 20 12/8 23-67 41.5±11.9
    4、BD相关自身抗体靶抗原的确定
    将GenePix Pro 6.0软件采集到的每张高密度蛋白芯片上所有蛋 白点的信号强度信息导入Excel表格中。用每个蛋白点的前景信号 强度(F635median)除以该蛋白点周围背景信号强度(B635median) 作为该蛋白点的信号值。即Iij=F635median/B635median(Iij代表 block j中的蛋白质i点的信号值)。蛋白质抗原蛋白点的信号值越 趋近于1,说明血清中相应的自身抗体浓度越低,该抗体越不容易被 检测到。信号值越高说明血清标本中该自身抗体的结合靶抗原蛋白 质的能力越强。将同一个蛋白不同两个点信号强度的平均值作为该 蛋白点在该芯片上的信号强度。当该平均值≥2时,认为该蛋白点为 阳性。然后统计每份血清与高密度蛋白芯片上各蛋白质抗原免疫反 应阳性率的信息。采用高通量芯片生物信息分析技术中常用的基因 芯片显著性分析(SAM)方法对BD患者组、自免病对照组及正常对 照组进行数据分析,以Q值<35%入选为BD候选相关自身抗原。BD 患者血沉增高组与血沉正常组直接的比较,以Q值<5%入选为BD候 选相关自身抗原。为了确保筛选的BD候选自身抗原具有临床价值, 所有入选制备BD相关自身抗体靶抗原的阳性率阳性率>25%。
    结果:
    采用包含47616蛋白点的高密度蛋白芯片对40份BD患者血清、 15例自身免疫病患者对照血清和20例健康对照血清进行筛选BD相 关自身抗体。研究结果显示,所有血清标本只能与高密度蛋白芯片 上少数蛋白发生抗原抗体特异性反应,BD组的平均阳性蛋白点数为 244.05±206.05,自免病对照组的平均阳性蛋白点数为261.45± 249.2,正常对照组的平均阳性蛋白点数为220.6±265.4(图1)。蛋 白阳性反应点总数在三组间无显著性差异(F=0.139,P=0.87>0.05)。
    在各研究组标本阳性蛋白点确认的基础上,采用高通量芯片生 物信息分析技术中常用的基因芯片显著性分析(SAM)方法对BD患 者组、自免病对照组及正常对照组进行数据分析,以Q值<35%入选 为BD候选相关自身抗原。BD患者血沉增高组与血沉正常组之间的 比较,以Q值<5%入选为BD候选相关自身抗原。为了确保筛选的 BD候选自身抗原具有临床价值,所有入选制备BD相关自身抗体靶 抗原的阳性率>25%。经分析确认的BD相关靶抗原共计36个,这些 靶抗原将纳入到BD相关抗体靶抗原小芯片制备,详见表2。高密度 蛋白芯片筛选的BD相关抗体典型图如图2:
    表2 制备BD相关自身抗体靶抗原蛋白芯片的蛋白


    实施例2 BD相关自身抗体靶抗原蛋白质芯片的构建与血清筛选验证
    自身免疫病患者由于遗传背景的不同以及环境影响因素的差 异,不同患者个体之间的所产生的自身抗体阳性率差异较大。为了 确认采用高密度蛋白芯片进行小样本筛选出的BD相关自身抗体是否 具有临床意义和应用价值,以及这些抗体对BD患者诊断的敏感性和 特异性,本研究将高密度蛋白芯片筛选出的BD相关自身抗体靶抗原 制备成BD相关自身抗体靶抗原蛋白质芯片进行临床扩大样本验证。
    用于BD相关自身抗体靶抗原蛋白芯片进行临床大样本验证检测 的血清标本包括BD患者130例,自免病对照患者103例,正常对照 110例。相关资料见表3。
    表3 临床大样本验证检测的血清标本

    对BD相关自身抗体靶抗原蛋白芯片进行的130例BD患者,103 例自免病对照患者和110例正常对照检测结果进行分析。BD相关自 身抗体靶抗原芯片上36种靶抗原的检测结果详见表4。36种靶抗原 的检测结果显示CTDP1在BD组的阳性率为23.85%,高于自身免疫 病对照组4.85%(X2=15.87,P=6.79x10-5)和健康对照组6.36% (X2=13.67,P=0.000218),结果差异具有显著性。BD相关自身抗体 靶抗原芯片上各研究组血清标本与CTDP1杂交典型图如图3。其余 35种高密度蛋白芯片筛出的BD相关靶抗原通过在小芯片上扩大样 本检测验证后,结果显示在BD组、自身免疫病对照组和健康对照组 间阳性率无显著性差异。
    进一步分析CTDP1在高密度蛋白芯片上的阳性情况,CTDP1的 阳性率为在BD组为22.5%(9/40),在自身免疫病对照组的阳性率 为6.67%(1/15),在健康对照组的阳性率为5.0%(1/20)。该结果 与其在小芯片上的结果非常相似。
    表4 BD相关自身抗体靶抗原芯片上检测结果


    实施例3 新发现的BD自身抗体免疫印迹验证
    为了验证BD自身抗体靶抗原芯片临床大样本筛选确认的检测结 果是否能在其他检测方法中得到重复结果,我们采用蛋白质组学研 究方法中最常用的免疫印迹方法对BD患者血清中抗CTDP1抗体进 行检测。免疫印迹检测结果显示采用BD自身抗体靶抗原芯片大样本 筛选确认的抗CTDP1抗体能在WB检测中得到很好的重复,BD患 者血清中存在与CTDP1特异性反应的自身抗体,其反应信号强度高 于自身免疫病对照组和正常人对照组。免疫印迹检测的结果如图4。
    以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领 域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以 做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的?;し段?。

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    一种 白塞氏病 检测 生物 标志 及其 用途
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