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    重庆时时彩输了30W: 鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条及其制备方法.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201510100964.8

    申请日:

    2015.03.09

    公开号:

    CN104749362A

    公开日:

    2015.07.01

    当前法律状态:

    驳回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):G01N 33/569申请公布日:20150701|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/569申请日:20150309|||公开
    IPC分类号: G01N33/569; G01N33/531 主分类号: G01N33/569
    申请人: 中国农业科学院特产研究所; 长春市衡达科技有限公司
    发明人: 杨艳玲; 郭健; 郭利; 李春义; 杨福合
    地址: 130112吉林省长春市净月经济开发区聚业大街4899号
    优先权:
    专利代理机构: 长春菁华专利商标代理事务所22210 代理人: 王丹阳
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201510100964.8

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2017.11.24|||2015.07.29|||2015.07.01

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的驳回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条及其制备方法,涉及人畜共患传染病病原体检测领域,解决了现有检测方法不能快速检测鹿布鲁氏菌病的问题。包括塑料卡、装在塑料卡中的PVC底板、依次粘帖在PVC底板上的样品垫、金标结合垫、带有检测线和质控线的NC膜、吸水纸,所述NC膜的检测线和质控线上分别点样有抗原和二抗;所述抗原为1.50mg/mL的重组布鲁氏菌BCSP31蛋白,所述二抗为0.75mg/mL的兔抗鹿IgG;通过将胶体金标记抗体蛋白(兔抗鹿IgG)后得到的纯化的金标抗体溶液滴加到结合垫上形成金标结合垫。本发明用于快速筛查鹿血清或鹿全血中布鲁氏菌病抗体,对鹿布鲁氏菌病做出快速诊断,便于养殖场技术人员和兽医人员现场操作。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条,包括塑料卡、装在塑料卡中的PVC底板、依次粘帖在PVC底板上的样品垫、金标结合垫、带有检测线和质控线的NC膜、吸水纸,所述NC膜的检测线和质控线上分别点样有抗原和二抗;其特征在于,所述抗原为1.50mg/mL的重组布鲁氏菌BCSP31蛋白,所述二抗为0.75mg/mL的兔抗鹿IgG。

    2.  根据权利要求1所述的鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条,其特征在于,所述金标结合垫通过以下方法制备:
    (1)用pH9.0的硼酸盐缓冲液将初始浓度2.45mg/mL的抗体蛋白稀释至终浓度1.0mg/mL,用0.1M的K2CO3溶液调节胶体金的pH为9.0,胶体金粒径大小为30nm;以每1mL胶体金加40μg抗体蛋白的比例,逐滴加入抗体蛋白,搅拌均匀后,常温下静止30min;加入10%BSA至终浓度为1%,继续搅拌15min;加入3%PEG2000至终浓度为0.1%,继续搅拌15min,获得金标抗体溶液;
    (2)将步骤(1)获得的金标抗体溶液在4℃下,1500rpm离心20min,去除沉淀,得上清液;将上清液在4℃下,8000rpm离心30min,弃上清,取流动的暗红色沉淀,重悬于上清液初始体积1/10的储存液中,获得纯化的金标抗体溶液,4℃保存;
    (3)将结合垫浸入0.01M的PBS缓冲液中,10min后取出,室温晾干,4℃保存;将步骤(2)获得的纯化的金标抗体溶液滴加到上述结合垫上,直至结合垫饱和,37℃下干燥1h,获得金标结合垫。

    3.  根据权利要求2所述的鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条,其特征在于,步骤(1)中,所述抗体蛋白为兔抗鹿IgG。

    4.  根据权利要求1所述的鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条,其特征在于,所述抗原和二抗的点样用量均2μL/1cm。

    5.  制备权利要求1所述的鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条的方法,其特征在于,包括以下步骤:
    (1)用pH9.0的硼酸盐缓冲液将初始浓度2.45mg/mL的抗体蛋白稀释至终浓度1.0mg/mL,用0.1M的K2CO3溶液调节胶体金的pH为9.0,胶体金粒径大 小为30nm;以每1mL胶体金加40μg抗体蛋白的比例,逐滴加入抗体蛋白,搅拌均匀后,常温下静止30min;加入10%BSA至终浓度为1%,继续搅拌15min;加入3%PEG2000至终浓度为0.1%,继续搅拌15min,获得金标抗体溶液;
    (2)将步骤(1)获得的金标抗体溶液在4℃下,1500rpm离心20min,去除沉淀,得上清液;将上清液在4℃下,8000rpm离心30min,弃上清,取流动的暗红色沉淀,重悬于上清液初始体积1/10的储存液中,获得纯化的金标抗体溶液,4℃保存;
    (3)将结合垫浸入0.01M的PBS缓冲液中,10min后取出,室温晾干,4℃保存;将步骤(2)获得的纯化的金标抗体溶液滴加到上述结合垫上,直至结合垫饱和,37℃下干燥1h,获得金标结合垫;
    (4)以1.50mg/mL纯化后的重组布鲁氏菌BCSP31蛋白为抗原,以0.75mg/mL兔抗鹿IgG为二抗,以2μL/1cm分别点样于NC膜的检测线和质控线上,室温固定2h;将点样后的NC膜浸入到0.01M的PBS缓冲液中,37℃下封闭30min后,再用0.01M的PBS缓冲液漂洗NC膜表面,37℃下烘干,获得带有重组布鲁氏菌BCSP31蛋白和兔抗鹿IgG的NC膜;
    (5)将步骤(4)获得的带有重组布鲁氏菌BCSP31蛋白和兔抗鹿IgG的NC膜粘贴于PVC底板上,将步骤(3)获得的金标结合垫粘帖在NC膜左端,叠加2mm;将样品垫粘帖在金标结合垫左端,叠加2mm;将吸水纸粘帖在NC膜右端,叠加2mm;用塑料卡固定后即获得胶体金检测试纸条。

    6.  根据权利要求5所述的鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述抗体蛋白为兔抗鹿IgG。

    7.  根据权利要求5所述的鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条的制备方法,其特征在于,步骤(2)中,所述储存液为含有1%BSA和0.05%PEG2000的PBS缓冲液,浓度为0.01M,pH为8.5~9.0。

    8.  根据权利要求5所述的鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,所述PBS缓冲液中含有5%蔗糖和0.05%吐温-20。

    9.  根据权利要求5所述的鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条的制备方法, 其特征在于,步骤(4)中,所述PBS缓冲液中含有1%BSA。

    10.  根据权利要求5所述的鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条的制备方法,其特征在于,所述金标结合垫为玻纤膜,型号为GL0194,长×宽=6mm×5mm;所述NC膜的型号为Vivid170,长×宽=25mm×5mm;所述PVC底板的长×宽=60mm×5mm;所述样品垫为玻纤膜,型号为GL0194,长×宽=20mm×5mm;所述吸水纸的型号为H5076,长×宽=15mm×5mm。

    说明书

    说明书鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条及其制备方法
    技术领域
    本发明涉及人畜共患传染病病原体的检测技术领域,具体涉及一种鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条及其制备方法。
    背景技术
    布鲁氏菌表面蛋白31(Brucella cellsurface protein 31ku,BCSP31)基因于1988年被克隆测序和体外表达,它编码了大小为31ku具有免疫原性的可溶性细胞表面蛋白质,除了绵羊附睾布鲁氏菌外,在其他6种布鲁氏菌中均可检测到BCSP31蛋白的表达。布鲁氏菌BCSP31基因在8株不同属来源的布鲁氏菌菌株中同源性达99.3%,是布鲁氏菌种属特异性基因,具有高度保守性。
    目前,已有学者利用真核表达的方法表达了BCSP31蛋白,并利用其真核表达产物免疫小鼠,研究其在小鼠体内的抗布鲁氏菌感染的能力;也有学者利用原核表达载体pGEX4p-1表达了BCSP31蛋白,并研制了BCSP31蛋白的单克隆抗体。
    胶体金是一种常用的标记技术,是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术,有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能例用到。
    目前,采用布鲁氏菌BCSP31蛋白作为抗原用于鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条的研制还未见报道。
    发明内容
    本发明的目的是提供一种鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条及其制备方法,用于快速筛查鹿血清或鹿全血中布鲁氏菌抗体。
    本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下:
    本发明提供的一种鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条,包括塑料卡、装在塑料卡中的PVC底板、依次粘帖在PVC底板上的样品垫、金标结合垫、带有检测线和质控线的NC膜、吸水纸,所述NC膜的检测线和质控线上分别点样有 抗原和二抗;所述抗原为1.50mg/mL的重组布鲁氏菌BCSP31蛋白,所述二抗为0.75mg/mL的兔抗鹿IgG。
    进一步的,所述金标结合垫通过以下方法制备:
    (1)用pH9.0的硼酸盐缓冲液将初始浓度2.45mg/mL的抗体蛋白稀释至终浓度1.0mg/mL,用0.1M的K2CO3溶液调节胶体金的pH为9.0,胶体金粒径大小为30nm;以每1mL胶体金加40μg抗体蛋白的比例,逐滴加入抗体蛋白,搅拌均匀后,常温下静止30min;加入10%BSA至终浓度为1%,继续搅拌15min;加入3%PEG2000至终浓度为0.1%,继续搅拌15min,获得金标抗体溶液;
    (2)将步骤(1)获得的金标抗体溶液在4℃下,1500rpm离心20min,去除沉淀,得上清液;将上清液在4℃下,8000rpm离心30min,弃上清,取流动的暗红色沉淀,重悬于上清液初始体积1/10的储存液中,获得纯化的金标抗体溶液,4℃保存;
    (3)将结合垫浸入0.01M的PBS缓冲液中,10min后取出,室温晾干,4℃保存;将步骤(2)获得的纯化的金标抗体溶液滴加到上述结合垫上,直至结合垫饱和,37℃下干燥1h,获得金标结合垫。
    进一步的,步骤(1)中,所述抗体蛋白为兔抗鹿IgG。
    进一步的所述抗原和二抗的点样用量均为2μL/1cm。
    本发明还提供了上述鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条的制备方法,该方法包括以下步骤:
    (1)用pH9.0的硼酸盐缓冲液将初始浓度2.45mg/mL的抗体蛋白稀释至终浓度1.0mg/mL,用0.1M的K2CO3溶液调节胶体金的pH为9.0,胶体金粒径大小为30nm;以每1mL胶体金加40μg抗体蛋白的比例,逐滴加入抗体蛋白,搅拌均匀后,常温下静止30min;加入10%BSA至终浓度为1%,继续搅拌15min;加入3%PEG2000至终浓度为0.1%,继续搅拌15min,获得金标抗体溶液;
    (2)将步骤(1)获得的金标抗体溶液在4℃下,1500rpm离心20min,去除沉淀,得上清液;将上清液在4℃下,8000rpm离心30min,弃上清,取流动的暗红色沉淀,重悬于上清液初始体积1/10的储存液中,获得纯化的金标抗体溶液,4℃保存;
    (3)将结合垫浸入0.01M的PBS缓冲液中,10min后取出,室温晾干,4℃保存;将步骤(2)获得的纯化的金标抗体溶液滴加到上述结合垫上,直至结合垫饱和,37℃下干燥1h,获得金标结合垫;
    (4)以1.50mg/mL纯化后的重组布鲁氏菌BCSP31蛋白为抗原,以0.75mg/mL兔抗鹿IgG为二抗,以2μL/1cm分别点样于NC膜的检测线和质控线上,室温固定2h;将点样后的NC膜浸入到0.01M的PBS缓冲液中,37℃下封闭30min后,再用0.01M的PBS缓冲液漂洗NC膜表面,37℃下烘干,获得带有重组布鲁氏菌BCSP31蛋白和兔抗鹿IgG的NC膜;
    (5)将步骤(4)获得的带有重组布鲁氏菌BCSP31蛋白和兔抗鹿IgG的NC膜粘贴于PVC底板上,将步骤(3)获得的金标结合垫粘帖在NC膜左端,叠加2mm;将样品垫粘帖在金标结合垫左端,叠加2mm;将吸水纸粘帖在NC膜右端,叠加2mm;用塑料卡固定后即获得胶体金检测试纸条。
    进一步的,步骤(1)中,所述抗体蛋白为兔抗鹿IgG。
    进一步的,步骤(2)中,所述储存液为含有1%BSA和0.05%PEG2000的PBS缓冲液,浓度为0.01M,pH为8.5~9.0。
    进一步的,步骤(3)中,所述PBS缓冲液中含有5%蔗糖和0.05%吐温-20。
    进一步的,步骤(4)中,所述PBS缓冲液中含有1%BSA。
    进一步的,所述金标结合垫为玻纤膜,型号为GL0194,长×宽=6mm×5mm。
    进一步的,所述NC膜的型号为Vivid170,长×宽=25mm×5mm。
    进一步的,所述PVC底板的长×宽=60mm×5mm。
    进一步的,所述样品垫为玻纤膜,型号为GL0194,长×宽=20mm×5mm。
    进一步的,所述吸水纸的型号为H5076,长×宽=15mm×5mm。
    本发明的有益效果是:本发明的鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条由样品垫、金标结合垫、NC膜、吸水纸、PVC底板和塑料卡组成,将样品垫、金标结合垫、NC膜和吸水纸依次固定在PVC底板上,然后整体装在塑料卡中。通过将胶体金标记抗体蛋白(兔抗鹿IgG)后得到的纯化的金标抗体溶液滴加到结合垫上形成金标结合垫;以布鲁氏菌BCSP31蛋白为抗原,以兔抗鹿IgG为二抗,将浓度为1.50mg/mL的布鲁氏菌BCSP31蛋白和浓度为0.75mg/mL的兔抗 鹿IgG分别以2μL/1cm点样于NC膜上,即将布鲁氏菌BCSP31蛋白喷涂在检测线(T线)上,将兔抗鹿IgG喷涂在质控线(C线)上。
    本发明的鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条是基于间接胶体金免疫层析技术实现的,检测时,样品中的布鲁氏菌抗体与胶体金包被的抗体蛋白结合形成抗体复合物,并沿着试纸流向NC膜的另一端,当该抗体复合物流到NC膜上的T区时,固定在膜上的特异性抗原即布鲁氏菌BCSP31蛋白捕获该复合物并逐渐凝集成一条可见的检测线(T线),质控线(C线)出现则表明免疫层析发生,即试纸有效;检测线(T线)出现则表明样品中含有布鲁氏菌抗体。
    本发明的鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条用于快速筛查鹿血清或鹿全血中布鲁氏菌抗体,对鹿布鲁氏菌病做出快速诊断,便于养殖场技术人员和兽医人员现场操作,如果肉眼观测到检测线(T线)和质控线(C线)都显示深色条带,说明是布鲁氏菌阳性动物,如果只有C线显示深色条带,说明是布鲁氏菌阴性动物,如果检测线(T线)和质控线(C线)均无明显深色条带出现,说明试纸条失效或操作失败。相比现有的虎红平板凝集试验和间接ELISA方法检测鹿布鲁氏菌病,本发明的鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条检测的阳性率高于高于虎红平板凝集试验的阳性率5.48%,阳性符合率为100%,高于虎红平板凝集试验的阳性符合率91%,同时也高于间接ELISA方法的阳性符合率95%。
    附图说明
    图1为布鲁氏菌BCSP31基因的PCR扩增结果图,图中:M5为羊种布鲁氏菌疫苗株M5(B.melitensis M5)的基因组DNA,544A为牛种布鲁氏菌标准菌株544A(B.abortus 544A)的基因组DNA,16为羊种布鲁氏菌标准菌株16M(B.melitensis 16M)的基因组DNA,M为DNA marker。
    图2为SUMO-BCSP31重组质粒在大肠杆菌BL21中的诱导表达结果图,图中:M为蛋白Marker,1、2、3和4均为诱导表达的重组BCSP31蛋白。
    图3为诱导的SUMO-BCSP31重组蛋白在细胞上清中的表达结果图,图中:1和2均为细胞上清产物,3和4均为细胞沉淀产物。
    图4为布鲁氏菌BCSP31蛋白与HIS标签单抗的免疫印迹分析结果图。
    图5为重组蛋白SUMO-BCSP31经镍柱纯化结果图,图中:M为蛋白Marker, 1、2和3均为镍柱洗脱产物,4为镍柱结合后剩余产物。
    图6为布鲁氏菌BCSP31蛋白与牛布鲁氏菌病阳性血清的免疫印迹分析结果图,图中:M为蛋白Marker,1为山羊抗牛IgG,2为牛布鲁氏菌病阳性血清。
    图7为小鼠血清抗体效价检测结果图。
    图8为布鲁氏菌BCSP31蛋白与免疫小鼠血清的免疫印迹分析结果图,图中:M为蛋白Marker,1为布鲁氏菌BCSP31蛋白可溶性表达产物,2为布鲁氏菌BCSP31蛋白纯化产物。
    图9为小鼠血清亚型IgG1和IgG2a ELISA检测结果图。
    图10为小鼠血清细胞因子IFN-γ的ELISA检测结果图。
    图11为为小鼠血清细胞因子IL-2的ELISA检测结果图。
    图12为采用本发明的鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条检测待测样品的结果图。图12a中待测样品为PBS缓冲液;图12b中待测样品为阴性样品;图12c中待测样品为阳性样品。
    具体实施方式
    以下结合实施例对本发明作进一步详细说明。
    实验材料:羊种布鲁氏菌标准菌株16M(B.melitensis 16M)、羊种布鲁氏菌疫苗株M5(B.melitensis M5)及牛种布鲁氏菌标准菌株544A(B.abortus 544A)均购自中国兽药监察所;IPTG购自Sigma公司,货号为16758;BSA(牛血清白蛋白)购自sigma公司;Blunt载体和T4连接酶均购自NEB公司;SUMO载体购自Invitrogen公司;大肠杆菌DH5α感受态细胞和大肠杆菌BL21购自北京全式金公司,保存在-80℃冰箱中;山羊抗牛IgG、兔抗鹿IgG、胶体金均购自上海杰一。
    实施例1布鲁氏菌BCSP31蛋白的表达和纯化
    (1)布鲁氏菌BCSP31基因的克隆测序
    ①根据GenBank公布的牛种布鲁氏菌BCSP31蛋白基因序列设计引物:
    上游引物P1:5’-TGACCTGCTAGTAGGTATGAAATTCGGAAGCA-3’,
    下游引物P2:5’-TGTCTAGATTATTTCAGCACGCCCGCT-3’,
    上述上下游引物均由Invitrogen生物技术有限公司基因部合成。
    ②分别以羊种布鲁氏菌标准菌株16M(B.melitensis 16M)、羊种布鲁氏菌疫苗株M5(B.melitensis M5)及牛种布鲁氏菌标准菌株544A(B.abortus 544A)的基因组DNA为模板,PCR扩增BCSP31基因片段;反应条件是:94度,变性5min,94度变性30s,60度退火1min,72度延伸1min,35个循环,最后72度延伸10min。
    ③将PCR产物纯化后连于Blunt载体上进行克隆转化,获得BCSP31克隆质粒,由吉林省库美生物技术公司进行测序。结果显示:如图1所示,布鲁氏菌BCSP31蛋白在羊种布鲁氏菌标准菌株16M(B.melitensis 16M)、羊种布鲁氏菌疫苗株M5(B.melitensis M5)及牛种布鲁氏菌标准菌株544A(B.abortus544A)均得到了特异性扩增,目的片段大小为990bp,获得的BCSP31克隆质粒与GenBank上公布的牛种布鲁氏菌BCSP31蛋白基因(GenBank:M20404.1)同源性为100%。
    (2)SUMO-BCSP31重组表达质粒的构建及诱导表达
    ①选择SUMO载体为表达载体,用BfuAI和XbaI分别酶切测序比对正确的BCSP31克隆质粒和SUMO空载体质粒,SUMO空载体质??梢愿咝У挠盏伎扇苄员泶?,增加表达量,表达后的蛋白全部是可溶性的蛋白。
    ②回收酶切产物,用T4连接酶连接,16℃过夜,构建SUMO-BCSP31重组表达质粒。
    ③将获得的SUMO-BCSP31重组表达质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,获得阳性克隆质粒。
    ④将阳性克隆质粒转入大肠杆菌BL21进行诱导表达,同时表达SUMO空载体质粒作为阴性对照,待重组菌培养至A600nm=0.4~0.6时,加入终浓度1mmol/L的IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷),30℃下诱导表达6h,冰浴30min后离心收集菌体,用冰PBS洗菌体2次,5000rpm离心收集菌体,加入20ml Binding Buffer重悬菌体,分别加入1%Triton-100和100mg/ml溶菌酶,37℃作用30min,加入蛋白酶抑制剂1片,冰浴超声15min(2s/2s),12000rpm离心30min,收取上清和沉淀,分别进行SDS-PAGE分析(聚丙烯酰氨凝胶电泳),检测可溶性蛋白的表达,SDS-PAGE分析结果如图2所示,1、2、3和4均为诱 导表达的重组BCSP31蛋白,可溶性蛋白的表达结果如图3所示,所表达的BCSP31蛋白在细胞上清中。
    (3)重组布鲁氏菌BCSP31蛋白的western-blotting验证
    利用半干转印法将BCSP31蛋白经SDS-PAGE分离后转印到PVDF膜上,转印条件为20V、15min;转印完成后分别用HIS标签单抗作为一抗(1:8000),羊抗小鼠IgG作为二抗(1:10000)进行免疫印迹分析,检测BCSP31蛋白的表达情况正确与否。结果如图4所示,在53kDa左右出现特异性条带,说明带有HIS标签的BCSP31蛋白正确表达。
    (4)重组布鲁氏菌BCSP31蛋白的纯化
    将上述细胞上清经镍柱(GE-Healthcare 1ml His trap PP)纯化,用5ml binding buffer冲洗柱,以1ml/min的流速加入细胞上清溶液,用5ml elution buffer洗脱蛋白,SDS-PAGE检测蛋白的纯化结果,细胞上清经镍柱纯化的结果如图5所示,在53kDa处得到单一目的条带,将纯化后的重组布鲁氏菌BCSP31蛋白采用0.45μm滤膜过滤,-80℃冻干保存备用。
    实施例2重组布鲁氏菌BCSP31蛋白免疫原性的检测及分析
    (1)BCSP31蛋白与牛布鲁氏菌病阳性血清免疫印迹分析
    将临床上检测的牛布鲁氏菌病阳性血清(可以通过虎红平板和试管凝集反应确定为阳性)作为一抗,按照1:400的浓度孵育PVDF膜,用山羊抗牛IgG作为二抗,以1:5000的浓度孵育PVDF膜,经TMB显色,检测BCSP31蛋白与牛布鲁氏菌病阳性血清的特异性反应。结果如图6所示:布鲁氏菌BCSP31蛋白能够与牛布鲁氏菌病阳性血清发生特异性反应,说明该重组的BCSP31蛋白在布鲁氏菌阳性动物血清中能够产生特异性抗体。
    (2)BCSP31蛋白免疫小鼠
    将20只雄性BALB/c(白变种实验室老鼠)平均分成4组,每组5只,即第一组每只小鼠免疫5*107SUMO-BCSP31表达菌BL21,第二组每只鼠免疫5*107转化SUMO空载体BL21,第三组每只小鼠免疫5*105羊种布鲁氏菌疫苗株M5,第四组每只小鼠免疫200ul PBS作为对照。均采取腹腔注射,共免疫3次,每次间隔21天。最后一次免疫后21天拉颈处死小鼠,摘眼球采血,吸取 血清,分别进行western-blotting,血清效价和细胞因子的检测。
    ①小鼠血清ELISA检测特异性抗体的检测
    分别用纯化的BCSP31蛋白包被96孔板,采用间接ELISA方法检测待测免疫小鼠血清,加羊抗小鼠IgG-HRP(1:5000)反应,加底物OPD显色,置酶标仪测490nm吸光度(A)值,测定抗体的滴度;将免疫后小鼠每隔7天尾尖采血,直到免疫后第8周,收集血清,间接ELISA方法检测免疫后小鼠血清抗体效价,结果如图7所示,表达有免疫重组菌SUMO-BCSP31的大肠杆菌BL21从免疫后第7天开始,血清效价逐渐上升,直到免疫后第8周还没有下降,最高血清效价为1︰5600。
    ②小鼠血清Western-blotting分析
    为了检测SUMO-BCSP31表达菌BL21免疫小鼠后血清中能否产生BCSP31蛋白的特异性抗体,将免疫SUMO-BCSP31表达菌BL21的小鼠血清作为一抗,与布鲁氏菌BCSP31蛋白可溶性表达产物和纯化产物分别进行Western-blotting分析,结果如图8所示,免疫小鼠血清能够与BCSP31蛋白在53bp处出现明显的免疫反应,说明该SUMO-BCSP31表达菌BL21免疫小鼠后获得了BCSP31蛋白的特异性抗体。
    ③小鼠血清IgG亚型的检测
    利用现有的ELISA检测试剂盒检测小鼠血清IgG1和IgG2a的表达量,结果如图9所示,免疫重组菌SUMO-BCSP31的小鼠诱导产生的IgG亚型是以IgG1为主,说明该重组菌SUMO-BCSP31诱导了TH2型免疫反应,以血清抗体免疫为主,羊种布鲁氏菌疫苗株M5则同时诱导产生IgG1和IgG2a,说明布鲁氏菌弱毒疫苗株能够同时刺激机体产生细胞免疫反应和体液免疫反应,而PBS对照组则无明显的IgG1和IgG2a产生。
    ④小鼠血清IFN-γ和IL-2的检测
    利用现有的小鼠IFN-γ和IL-2ELISA检测试剂盒检测小鼠血清中特异性IFN-γ和IL-2的表达量,结果如图10和图11所示,免疫SUMO-BCSP31重组菌小鼠血清无明显的IFN-γ和IL-2产生。
    实施例3金标抗体溶液的制备
    (1)胶体金标记抗体蛋白
    采用pH为9.0的硼酸盐缓冲液将初始浓度为2.45mg/mL的抗体蛋白稀释至终浓度为1.0mg/mL;采用浓度为0.1M的K2CO3溶液调节胶体金的pH为9.0,商品化的胶体金粒径大小为30nm;以每1mL胶体金加40μg抗体蛋白的比例,逐滴加入抗体蛋白,搅拌均匀后,常温下静止30min;加入10%BSA至终浓度为1%,继续搅拌15min;加入3%PEG2000至终浓度为0.1%,继续搅拌15min,得到金标抗体溶液。
    上述的抗体蛋白为兔抗鹿IgG,对应获得的金标抗体即为胶体金标记兔抗鹿IgG。
    (2)金标抗体溶液的纯化
    将上述获得的金标抗体溶液在4℃下,以1500rpm的转速离心20min,去除胶体金颗粒聚集产生的沉淀,得到上清液;将上清液在4℃下,以8000rpm的转速离心30min,弃上清,取管底可流动的暗红色沉淀,重悬于初始体积1/10的储存液中(也就是说初始体积指的是上清液的体积,上清液与储存液的体积比为10:1),得到纯化的金标抗体溶液,4℃下保存备用。
    上述的储存液为含有1%BSA和0.05%PEG2000的PBS缓冲液,浓度为0.01M,pH为8.5~9.0。
    实施例4金标结合垫的制备
    将结合垫浸入浓度为0.01M的PBS缓冲液(含有5%蔗糖和0.05%吐温-20)中,10min后取出,室温晾干后4℃下储存备用;将上述纯化后的金标抗体溶液滴加到经上述处理的结合垫上,直至结合垫饱和,37℃下干燥1h,得到金标结合垫(玻纤膜,型号GL0194,长×宽=6mm×5mm)。
    实施例5 NC膜的预处理
    以实施例1获得的纯化后的重组布鲁氏菌BCSP31蛋白为抗原,以兔抗鹿IgG为二抗,将浓度为1.50mg/mL的布鲁氏菌BCSP31蛋白和浓度为0.75mg/mL的兔抗鹿IgG分别以2μL/1cm点样于NC膜(型号为Vivid170,长×宽=25mm×5mm)上,具体的是将布鲁氏菌BCSP31蛋白喷涂在检测线(T线)上,将兔抗鹿IgG喷涂在质控线(C线)上,室温固定2h;将点样后的NC膜浸入到浓 度为0.01M的PBS缓冲液(含有1%BSA)中,37℃下封闭30min;取出后,再用浓度为0.01M的PBS缓冲液(含有1%BSA)漂洗NC膜表面,37℃下烘干,得到带有以重组布鲁氏菌BCSP31蛋白为抗原、以兔抗鹿IgG为二抗的NC膜。
    实施例6胶体金检测试纸条的组装
    将实施例5获得的带有以重组布鲁氏菌BCSP31蛋白为抗原、以兔抗鹿IgG为二抗的NC膜粘贴于PVC底板(长×宽=60mm×5mm)上,NC膜左端边缘距离PVC底板左端边缘22mm,NC膜右端边缘距离PVC底板右端边缘13mm;将实施例4获得的金标结合垫粘帖在NC膜左端上表面,叠加长度为2mm;将样品垫(玻纤膜,型号为GL0194,长×宽=20mm×5mm)粘帖在金标结合垫左端上表面,叠加长度为2mm;将吸水纸(型号为H5076,长×宽=15mm×5mm)粘帖在NC膜右端上表面,叠加长度为2mm;装上塑料卡固定后即完成胶体金检测试纸条的组装,得到的胶体金检测试纸条的尺寸为:长×宽=60mm×5mm。
    实施例7鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条的使用方法
    (1)采集待测样品,待测样品采集完后需要立即检测,如不能立即检测,需要放置在4℃下冷藏或低温冷冻保存,待测样品为鹿全血(抗凝)1ml或鹿血清500ul。
    (2)将完好的鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条取出后恢复至室温,放置在水平位置。
    (3)采用吸管吸取待测样品1滴缓慢滴入预先准备好的2滴PBS缓冲液中,混匀稀释后向试纸条的加样孔中缓慢滴入2~3滴。
    (4)5分钟判断结果,10分钟后的结果无效。
    (5)结果判定:
    如图12a所示,质控线(C线)和检测线(T线)不显示深色条带或者是质控线(C线)不显示深色条带而检测线(T线)显示深色条带,均判为无效;如图12b所示,质控线(C线)显示深色条带,检测线(T线)不显示深色条带,判为阴性;如图12c所示,质控线(C线)和检测线(T线)均显示深色条带,判为阳性。
    实施例8临床样品检测
    分别采用本发明的鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条、虎红平板凝集试验和间接ELISA方法对临床上420只鹿进行鹿布鲁氏菌病检测。
    对比分析鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条、虎红平板凝集试验和间接ELISA方法的阳性率。结果如表1所示:本发明的鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条的阳性率为9.05%,高于虎红平板凝集试验的阳性率5.48%,而低于间接ELISA方法的阳性率12%。
    对比分析鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条、虎红平板凝集试验和间接ELISA方法的阳性符合率。结果如表2所示,本发明的鹿布鲁氏菌病胶体金抗体检测试纸条的阳性符合率为100%,高于虎红平板凝集试验的阳性符合率91%,同时也高于间接ELISA方法的阳性符合率95%。
    表1
    检测方法数量(头)阳性(头)阴性(头)阳性率(%)胶体金检测试纸条420383829.05虎红平板凝集试验420233975.48ELISA4204737312
    表2
    检测方法阳性(头)符合数(头)符合率(%)胶体金检测试纸条3838100虎红平板凝集试验232191ELISA473695

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    布鲁氏菌 胶体 抗体 检测 试纸 及其 制备 方法
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