• 四川郎酒股份有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度环保奖 2019-05-13
  • 银保监会新规剑指大企业多头融资和过度融资 2019-05-12
  • 韩国再提4国联合申办世界杯 中国网友无视:我们自己来 2019-05-11
  • 中国人为什么一定要买房? 2019-05-11
  • 十九大精神进校园:风正扬帆当有为 勇做时代弄潮儿 2019-05-10
  • 粽叶飘香幸福邻里——廊坊市举办“我们的节日·端午”主题活动 2019-05-09
  • 太原设禁鸣路段 设备在测试中 2019-05-09
  • 拜耳医药保健有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度企业奖 2019-05-08
  • “港独”没出路!“梁天琦们”该醒醒了 2019-05-07
  • 陈卫平:中国文化内涵包含三方面 文化复兴表现在其中 2019-05-06
  • 人民日报客户端辟谣:“合成军装照”产品请放心使用 2019-05-05
  • 【十九大·理论新视野】为什么要“建设现代化经济体系”?   2019-05-04
  • 聚焦2017年乌鲁木齐市老城区改造提升工程 2019-05-04
  • 【专家谈】上合组织——构建区域命运共同体的有力实践者 2019-05-03
  • 【华商侃车NO.192】 亲!楼市火爆,别忘了买车位啊! 2019-05-03
    • / 6
    • 下载费用:30 金币  

    重庆时时彩组六杀码技巧: 一种香榧芽体内源激素的检测方法.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201510092900.8

    申请日:

    2015.03.02

    公开号:

    CN104749383A

    公开日:

    2015.07.01

    当前法律状态:

    撤回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):G01N 33/74申请公布日:20150701|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/74申请日:20150302|||公开
    IPC分类号: G01N33/74 主分类号: G01N33/74
    申请人: 浙江农林大学
    发明人: 梅丽; 吴家胜; 黄坚钦; 刘颖坤
    地址: 311300浙江省杭州市临安市环城北路88号
    优先权:
    专利代理机构: 四川君士达律师事务所51216 代理人: 芶忠义
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201510092900.8

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2017.04.19|||2015.12.09|||2015.07.01

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的视为撤回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明提供了一种香榧芽体内源激素的检测方法,将香榧花芽用提取液浸提后过固相萃取柱,浓缩,在96孔酶标板中分别加入标准物、待测样和加有抗体的稀释液,每孔50μl,洗版4次,将加入酶标二抗的稀释液中加入酶标板,每孔加100μl,在湿盒内,37℃下,温育0.5h,洗板,称取邻苯二胺溶于底物缓冲液中溶解,并添加30%H202,在每孔中加100μl,放入湿盒内,显色适当后每孔加入50μl2mol/L硫酸终止反应,测定标准物各浓度和各样品490nm处的OD值,计算结果。本发明方法操作简单,准确度高,回收率高,且方便、快速、安全、成本低廉的特点,在植物激素测定方面具有推广使用价值。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种香榧芽体内源激素的检测方法,其特征在于:具体包括以下步骤:
    1)采集香榧花芽置于提取液中4℃过夜浸提,3500转/min离心15min,取上清液;
    2)上清液过C-18固相萃取柱,萃取液浓缩,除去甲醇用稀释液定容;
    3)在96孔酶标板中分别加入标准物、待测样和加有抗体的稀释液,每孔50μl;
    4)洗版4次,将加入酶标二抗的稀释液中加入酶标板,每孔加100μl,在湿盒内,置37℃下,温育0.5h,洗板;
    5)称取邻苯二胺溶于底物缓冲液中溶解,并添加30%H202,,在每孔中加100μl,放入湿盒内,显色适当后每孔加入50μl 2mol/L硫酸终止反应;
    6)在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品490nm处的OD值。

    2.  根据权利要求1所述的一种香榧芽体内源激素的检测方法,其特征在于:所述的提取液为将二叔丁基对甲苯酚的甲醇溶液,其中甲醇的浓度为80%,二叔丁基对甲苯酚的浓度为1mmol/L。

    3.  根据权利要求1所述的一种香榧芽体内源激素的检测方法,其特征在于:所述的稀释液通过在500ml PBS中加0.5ml Tween-20和0.5g明胶后加热制得。

    4.  根据权利要求1所述的一种香榧芽体内源激素的检测方法,其特征在于:所述的底物缓冲液为通过称取5.10g C6H8O7·H2O,18.43g Na2HPO4·12H2O,加1000ml蒸馏水和1ml Tween-20制得pH为5.0的溶液。

    说明书

    说明书一种香榧芽体内源激素的检测方法
    技术领域
    本发明属于植物激素提取技术领域,具体涉及一种香榧芽体内源激素的检测方法。
    背景技术
    植物激素是植物体内普遍存在的一系列微量有机化合物,它的主要功能是调节植物生长发育,主要包括生长素(IAA)、赤霉素(GA3)、细胞分裂素(CTK)、脱落酸(ABA)和乙烯(Eth)五大类,目前又发现寡糖素和油菜固醇内酯等化合物。这些植物激素与植物生长发育和代谢过程的调节控制密切相关,对生命活动、遗传育种、栽培及贮藏保鲜领域的研究具有重要的意义。要深入了解植物激素与植物生长发育的关系,必须检测激素在植物体内的分布及含量的变化。但激素含量甚微,通常为纳克级,研究人员对其分析测定经历了生物测定法、免疫分析法、物理化学分析法等阶段。早期的激素鉴定几乎全靠生物测定,因其灵敏性及专一性均不够高,已较少使用。
    免疫分析技术和高效液相色谱(HPLC)自20世纪70年代以来广泛应用在植物激素的检测中,植物激素的提取、纯化和分析方法。其中,高效液相色谱法(HPLC)一直以来受到国内外学者的推崇,是已广泛应用于除乙烯外激素的测定。高效液相色谱法灵敏度高、专一性强和重复性好,是较理想的植物内源激素分析方法,目前已被广泛应用于植物内源激素的测定。但是,HPLC法在实际运用中,受多种 因素限制,而且,在对于微量的激素和某些物种,检测起来仍然有难度。
    香榧(Torreya grandis cv.Merrillii)是红豆杉科(Taxaceae)榧树属(Torreya)榧树种(Torreya grandis.Fort.ex Lindl)中的自然变异类型经人工培育发展而成的优良品种,是我国特有的集果用、材用、药用、油用及生态观赏于一体的珍贵经济树种。香榧是裸子植物,切片分析表明,其花芽分化的时间分别是头年10月至次年4月。研究阐明香榧花芽分化的机理,并由此研究开发能促进香榧早成花的新技术将具有重要现实意义。香榧的花芽分化过程也受控于各类内源激素的相互作用,研究不同激素在花芽分化期的变化规律,探讨有效激素的平衡关系将有助于阐明香榧的花芽分化调控机理及研发调控技术。
    发明内容
    本发明的目的在于提供一种准确可靠,可用于常规的香榧植物激素检测的方法,该方法利用酶联免疫吸附分析法,具有灵敏性、特异性高,且方便、快速、安全、成本低廉的特点。
    本发明具体通过以下技术方案实现:
    一种香榧芽体内源激素的检测方法,具体包括以下步骤:
    1)采集香榧花芽置于提取液中4℃过夜浸提,3500转/min离心15min,取上清液;
    2)上清液过C-18固相萃取柱,萃取液浓缩,除去甲醇用稀释液定容;
    3)在96孔酶标板中分别加入标准物、待测样和加有抗体的稀释 液,每孔50μl;
    4)洗版4次,将加入酶标二抗的稀释液中加入酶标板,每孔加100μl,在湿盒内,37℃下,温育0.5h,洗板;
    5)称取邻苯二胺溶于底物缓冲液中溶解,并添加30%H202,在每孔中加100μl,放入湿盒内,显色适当后每孔加入50μl 2mol/L硫酸终止反应;
    6)在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品490nm处的OD值。
    所述的提取液为将二叔丁基对甲苯酚的甲醇溶液,其中甲醇的浓度为80%,二叔丁基对甲苯酚的浓度为1mmol/L。
    所述的稀释液通过在500ml PBS中加0.5ml Tween-20和0.5g明胶后加热制得。
    所述的底物缓冲液为通过称取5.10g C6H8O7·H2O,18.43gNa2HPO4·12H2O,加1000ml蒸馏水和1ml Tween-20制得pH为5.0的溶液。
    所述的显色适当为肉眼能看出标准曲线有颜色梯度。
    本发明的有益效果为:采用酶联免疫方法进行植物激素测定,经多次试验证明,其方法准确可靠,可用于常规的香榧植物激素检测,相对生物测定和HPLC分析,免疫测定植物激素优点是操作简单,准确度高,回收率高,且方便、快速、安全、成本低廉的特点,在植物激素测定方面具有推广使用价值。
    具体实施方式
    下面结合实施例对本发明做进一步的说明,以下所述,仅是对本发明的较佳实施例而已,并非对本发明做其他形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容,依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化,均落在本发明的?;し段?。
    实施例1
    本试验中测定的香榧植物激素包括:ABA,ZR,IAA,GA3。具体方法如下:
    1.材料:新鲜采集香榧花芽,准确称取0.5g(精确到1mg),液氮速冻半小时,-70℃超低温保存。
    2.仪器设备
    研钵,冷冻离心机,台式快速离心浓缩干燥器或氮气吹干装置,酶联免疫分光光度计,吸水纸,恒温箱,冰箱,酶标板(40孔或96孔),可调微量液体加样器(10μl,40μl,200μl,1000μl),带盖瓷盘(内铺湿纱布)。
    3.试剂
    1)磷酸盐缓冲液(PBS):称取8.0g NaCl,0.2g KH2PO4,2.96gNa2HPO4·12H2O,用量筒加1000ml蒸馏水,pH为7.5。
    2)样品稀释液:500ml PBS中加0.5ml Tween-20,0.5g明胶(稍加热溶解)。
    3)底物缓冲液:称取5.10g C6H8O7·H2O(柠檬酸),18.43g Na2HPO4·12H2O,用量筒加1000ml蒸馏水,再加1ml Tween-20,pH为5.0。
    4)洗涤液:1000ml PBS加1mlTween-20。
    5)终止液:2mol/L H2SO4。
    6)提取液:80%甲醇,内含1mmol/L BHT(二叔丁基对甲苯酚,分子量220.36D,为抗氧化剂,先用甲醇溶解BHT,再配成80%的浓度)。
    4.操作步骤
    1)样品中激素的提取
    a.称取0.5g新鲜植物材料,加2ml样品提取液,在冰浴下研磨成匀浆,转入10ml试管,再用2ml提取液分次将研钵冲洗干净,一并转入试管中,摇匀后放置在4℃冰箱中过夜浸提。
    b.取出样品,3500转/min离心15min,取上清液。沉淀中加1ml提取液,搅匀,置4℃下再提取1h,离心,合并上清液并记录体积,残渣弃去。
    c.上清液过C-18固相萃取柱。具体步骤是:80%甲醇(1ml)平衡柱—上样—收集样品。
    d.将过柱后的样品用旋转蒸干仪浓缩,除去提取液中的甲醇,用样品稀释液定容(一般1g鲜重用2ml左右样品稀释液定容,测定不同激素时还要稀释适当的倍数再加样)。
    2)样品测定
    以下用量按一块96孔板计算。
    竞争:即加标准物、待测样和抗体。
    加标样及待测样:取适量所给标样稀释配成:ABA的最大浓度为500ng/ml,IAA,ZR标准曲线的最大浓度为100ng/ml,GA的最大浓度为10ng/ml。然后再依次2倍稀释8个浓度(包括0ng/ml)。即ABA稀释浓度分别为:500ng/ml,250ng/ml,125ng/ml,62.5ng/ml,30ng/ml,15ng/ml,7.5ng/ml,0ng/ml。ZR稀释的浓度为:100ng/ml,50ng/ml,25ng/ml,12.5ng/ml,6.25ng/ml,3ng/ml,1.5ng/ml,0ng/ml,GA稀释的浓度为:10ng/ml,5ng/ml,2.5ng/ml,1.25ng/ml,0.6ng/ml,0.3ng/ml,0.15ng/ml,0ng/ml。将系列标准样加入96孔酶标板的前排,每个浓度加3孔,每孔50μl,其余孔加待测样,每个样品重复3孔,每孔50μl。
    加抗体:在5ml样品稀释液中加入一定量的抗体(按稀释倍数添加,如稀释倍数是1:2000,就要加2.5μl的抗体),混匀后每孔加50μl,然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。竞争条件37℃左右0.5h。
    洗板:将反应液甩干并在报纸上拍净。第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第二次。共洗涤四次。
    加二抗:将适当的酶标二抗,加入10ml样品稀释液中(比如稀释倍数1:1000就加10μl),混匀后,在酶标板每孔加100μl,然后将其放入湿盒内,置37℃下,温育0.5h。
    洗板:方法同竞争之后的洗板。
    加底物显色:称取10-20mg邻苯二胺(OPD)溶于10ml底物缓冲液中(小心勿用手接触OPD),完全溶解后加4μl 30%H202?;煸?, 在每孔中加100μl,然后放入湿盒内,当显色适当后(肉眼能看出标准曲线有颜色梯度,且100ng/ml孔颜色还较浅),每孔加入50μl2mol/L硫酸终止反应。
    比色:在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品490nm处的OD值。
    3)结果计算:
    用OD的倒数为自变量,标准浓度为应变量,作多元回归方程。以此方程,计算样品z中激素的浓度,对应样品的总体积,最终计算样品在组织中的含量(单位ng/g)。
    以雌雄同株的香榧盛花期的雌花芽、雄花芽、叶芽和叶片为材料,,在2013年4月7日采集称重并立即用液氮速冻,超低温保存,采用ELISA方法检测其内源激素含量。
    按照以上方法,测定激素后的结果分别为:ZR的多元回归方程为:y=1.3336x2+49.821x-25.811,R2=0.9971,ABA的多元回归方程为:y=25.669x2-7.6182x+1.1194,R2=0.9978,GA3的多元回归方程为:y=0.1633x2+3.7455x-1.6915,R2=0.9998,IAA的多元回归方程为:y=5.51x2-0.7488x+2.1519,R2=0.9879。以此计算的结果如表1:
    表1 计算结果


    如表1所示,雄花芽及叶芽均有较高含量ZT,其次是雌花芽,最后是叶片。ABA含量最高的是雄花芽,其次是叶片,最后是雌花芽和叶芽,IAA含量最高的是雄花芽,其次是雌花芽,叶芽和叶片。据此我们推测,细胞分裂素ZT和脱落酸ABA有利于雄花芽发育,高比例ABA/GA3有利于雌花芽的发育。经ELISA方法测定的激素,阴性对照获得的结果均为0,阳性对照获得结果平均得率为:96.35%。
    测定植物激素,首先要提取游离激素,但植物是复杂的生物体,样品中常含有许多激素类似物以及其他干扰物质影响测定,同时,激素常以各种结合态形式存在。因此在检测植物内源激素之前,要经过提取、分离和纯化等多项处理,并确定合理的提取程序,获得真实可靠的检测结果。采用ELISA方法,激素提取过程简单,测定过程稳定可靠易于实验者掌握。激素的粗提程序已经过众多试验验证而比较成熟,取高速冷冻离心后的上清液。提取液中激素类似物因植物材料而异,其他干扰物质在不同的植物中存在的数量和种类也不相同,因此应根据具体情况选择分离纯化的方法。C18胶柱仅吸附分子态IAA、ABA、ZT(玉米素)和GA3,可去除多种呈离子态的杂质。经过柱后用旋转蒸发浓缩,可大大提高提取效率。ELISA方法采用抗原抗体结合方法测定,特异性强,重复性好,稳定可靠。

    关 键 词:
    一种 香榧 体内 激素 检测 方法
      专利查询网所有资源均是用户自行上传分享,仅供网友学习交流,未经上传用户书面授权,请勿作他用。
    关于本文
    本文标题:一种香榧芽体内源激素的检测方法.pdf
    链接地址://www.4mum.com.cn/p-5894524.html
    关于我们 - 网站声明 - 网站地图 - 资源地图 - 友情链接 - 网站客服客服 - 联系我们

    [email protected] 2017-2018 www.4mum.com.cn网站版权所有
    经营许可证编号:粤ICP备17046363号-1 
     


    收起
    展开
  • 四川郎酒股份有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度环保奖 2019-05-13
  • 银保监会新规剑指大企业多头融资和过度融资 2019-05-12
  • 韩国再提4国联合申办世界杯 中国网友无视:我们自己来 2019-05-11
  • 中国人为什么一定要买房? 2019-05-11
  • 十九大精神进校园:风正扬帆当有为 勇做时代弄潮儿 2019-05-10
  • 粽叶飘香幸福邻里——廊坊市举办“我们的节日·端午”主题活动 2019-05-09
  • 太原设禁鸣路段 设备在测试中 2019-05-09
  • 拜耳医药保健有限公司获第十二届人民企业社会责任奖年度企业奖 2019-05-08
  • “港独”没出路!“梁天琦们”该醒醒了 2019-05-07
  • 陈卫平:中国文化内涵包含三方面 文化复兴表现在其中 2019-05-06
  • 人民日报客户端辟谣:“合成军装照”产品请放心使用 2019-05-05
  • 【十九大·理论新视野】为什么要“建设现代化经济体系”?   2019-05-04
  • 聚焦2017年乌鲁木齐市老城区改造提升工程 2019-05-04
  • 【专家谈】上合组织——构建区域命运共同体的有力实践者 2019-05-03
  • 【华商侃车NO.192】 亲!楼市火爆,别忘了买车位啊! 2019-05-03