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    重庆时时彩彩乐乐投注: 抗MIF抗体的细胞迁移测定方法.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201380064094.2

    申请日:

    2013.12.05

    公开号:

    CN104884955A

    公开日:

    2015.09.02

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 专利权的转移IPC(主分类):G01N 33/50登记生效日:20170807变更事项:专利权人变更前权利人:巴克斯特国际公司变更后权利人:百深公司变更事项:地址变更前权利人:美国伊利诺伊州变更后权利人:美国伊利诺伊州变更事项:共同专利权人变更前权利人:巴克斯特保健股份有限公司变更后权利人:百深有限责任公司|||授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/50申请日:20131205|||公开
    IPC分类号: G01N33/50; G01N33/68 主分类号: G01N33/50
    申请人: 巴克斯特国际公司; 巴克斯特保健股份有限公司
    发明人: M·蒂塞尔; R·克西堡曼
    地址: 美国伊利诺伊州
    优先权: 61/734,845 2012.12.07 US; 61/778,141 2013.03.12 US
    专利代理机构: 上海市华诚律师事务所31210 代理人: 汤国华
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201380064094.2

    授权公告号:

    |||104884955B||||||

    法律状态公告日:

    2017.08.25|||2017.06.27|||2015.12.16|||2015.09.02

    法律状态类型:

    专利申请权、专利权的转移|||授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及一种稳定、精确和易于使用的用于抗-MIF抗体效价的测定方法。特别是,本发明公开了一种抗-MIF抗体-细胞迁移测定及其各自的方法和试剂盒。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种用于确定抗-MIF抗体的效价的测定方法,所述测定方法执行细胞迁移,且所述测定方法包括以下步骤:
    -将能够迁移的细胞提供至装置的第一部分,其中,所述细胞包含MIF,
    -将待测定的抗-(ox)MIF抗体添加至所述装置的第二部分,该第二部分被配置为与所述装置的第一部分相连接,使得允许细胞迁移和扩散,以及
    -计量迁移抑制。

    2.  根据权利要求1所述的测定方法,其中所述抗-MIF抗体是抗-oxMIF抗体,优选其中所述抗体选自于由RAB0、RAB4、RAB9、RAM0、RAM4和/或RAM9构成的组,尤其优选RAM9。

    3.  根据权利要求1或2所述的测定方法,其中,所述装置包括上室和下室,所述上室和下室通过具有孔的分离膜相连接,且细胞被添加至上室、抗体被添加至下室,其中优选该装置是双室的细胞迁移测定装置(改良的Boyden室测定装置),更优选Transwell细胞迁移测定装置。

    4.  根据上述任一项权利要求所述的测定方法,其中所述细胞是表达(ox)MIF的细胞,优选是在细胞表面表达(ox)MIF的细胞,优选其中所述细胞是来自疾病样本的细胞,更优选其中所述细胞是单核细胞、优选人单核细胞,更优选人永生化单核细胞,最优选U937细胞,或THP-1人单核细胞或替代实施例中的大鼠NR8383单核细胞。

    5.  根据上述任一项权利要求所述的测定方法,其中所述细胞以细胞悬浮液的方式提供于适宜的迁移介质中以允许其迁移。

    6.  根据权利要求5所述的测定方法,其中所述迁移介质不包含蛋白质。

    7.  根据上述任一项权利要求所述的测定方法,其中所述抗体被添加在非毒性的生物缓冲液中供至第二部分,如下室,如室的下室,所述生物缓冲液具有适度弱酸及其共轭碱,优选甘氨酸缓冲液、N-取代的?;撬峄撼逡?、或磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液。

    8.  根据上述任一项权利要求所述的测定方法,其中添加所述抗体直至在所述测定中的最终浓度为0.01-100nM,优选为0.02至50nM,优选0.04-30nM,优选作为系列稀释。

    9.  根据上述任一项权利要求所述的测定方法,所述测定装置例如所述室在添加细胞和抗体后培养6-20小时,优选8-12小时,优选在约37℃下培养,其中所述细胞是U937细胞,且其中所述膜具有约5μm的孔径。

    10.  根据上述任一项权利要求所述的测定方法,其中对已迁移的细胞进行计数,优选上述培养步骤之后、优选在下室中对已迁移的细胞进行计数,由此可获取被测抗体的效价信息,优选通过计算半-最大抑制抗体浓度(IC50值)来获取该信息。

    11.  根据上述任一项权利要求所述的测定方法,其中所述细胞在用于测定之前经受10至48小时,优选8-16小时,更优选10-12小时的血清饥饿。

    12.  根据上述任一项权利要求所述的测定方法,其中所述细胞来源于工作细胞库。

    13.  根据上述任一项权利要求所述的测定方法,其中,所述装置中不添加(ox)MIF。

    14.  一种测定试剂盒,其用于测定抗-(ox)MIF-抗体的效价,包括为了进行上述任一项或多项权利要求中所述的测定方法而必需的所有试剂,优选包含
    -表达MIF的细胞
    -抗体稀释缓冲液(例如,甘氨酸缓冲液)
    -迁移介质,和/或
    -两腔室细胞迁移系统。

    15.  药物或诊断组合物,其包含抗-(ox)MIF抗体,其中所述抗-(ox)MIF抗体的特征在于其已进行上述任一项权利要求中所述的效价测定。

    说明书

    说明书抗-MIF抗体的细胞迁移测定方法
    本发明涉及一种测定方法,其适用于测试抗-MIF抗体的效价。特别地,本发明涉及一种有利的且易于使用的细胞迁移测定方法。
    背景技术
    巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是一种细胞因子,最初基于其抑制结核菌素过敏豚鼠(含有巨噬细胞)的腹腔渗出细胞的体外随机迁移能力而被分离(Bloom等,Science 1966年,153,80-2;David等,PNAS 1966年,56,72-7)。今天,MIF作为在具有广谱活性先天性和获得性免疫应答的关键性上游调控子而被众所周知。1989年,人的MIF的cDNA被克隆(Weiser等,PNAS 1989,86,7522-6),其基因定位于22号染色体。人的MIF基因产物是具有114个氨基酸(N-末端蛋氨酸裂解后)且表观分子量大约为12.5kDa的蛋白质。MIF与任何其他的蛋白质没有显著的序列同源性。该蛋白质结晶为相同亚基的三聚体。每个单体包含两个反向平行的α-螺旋,α-螺旋堆集成四链的β-折叠。所述单体具有另外两个β链,该两β链与相邻亚单位的β-折叠相互作用从而形成单体之间的交界面。三个亚单位排布成一个包含亲溶剂通道的管道,该管道沿分子的三重轴向穿过蛋白质的中心(Sun等,PNAS 1996年,93,5191-5196)。
    据报道,低浓度的糖皮质激素可诱导巨噬细胞分泌MIF(Calandra等,Nature 1995年,377,68-71)。然而,MIF也反向调节糖皮质激素的作用并刺激其它细胞因子如肿瘤坏死因子TNF-α和白介素IL-1β的分泌(Baugh等,危重病急救医学2002,30,S27-35)。MIF还显示出,例如表现为促血管生成、促增殖和抗细胞凋亡的特性,从而促进肿瘤细胞的生长(米切尔,R.A.,细胞信号,2004.16(1):P.13-19;Lue,H.等,致癌基因2007.26(35):p.5046-59)。它也与例如淋巴瘤,黑素瘤和结肠癌的生长直接有关(Nishihira等,J干扰素因子细胞因子研究2000,20:751-62)。MIF是许多病理状况的中介体,因而与多种疾病相关,其包括但不限于炎症性肠病(IBD)、风湿性关节炎 (RA)、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、哮喘、血管球性肾炎、IgA肾病、心肌梗死(MI)、败血症和癌症。
    多克隆抗体和单克隆抗MIF抗体已被研发,用来抵抗重组的人MIF(清水等,二月快报1996;381,199-202;川口等,Leukoc生化学1986,39,223-232,和Weiser等。细胞免疫学1985,90,167-78)。
    已经有人建议抗MIF抗体用于治疗用途。据报道,Calandra等(J.Inflamm.(1995),47,39-51)使用抗MIF抗体?;ざ锸蛊涿庥诶醋允笛樾杂盏嫉母锢际弦跣院透锢际涎粜园苎孕菘?。这表明抗MIF抗体可用作一种治疗手段来调节感染性休克和其它炎性疾病状态中细胞因子的产生。
    美国专利6,645,493公开了来源于杂交瘤细胞的单克隆抗MIF抗体,其能够中和MIF的生物学活性。在动物模型中表明这些源于小鼠的抗MIF抗体在内毒素引起的休克的治疗上取得了有益的效果。
    美国专利200310235584公开了一种在动物中制备MIF高亲和性抗体的方法,其中MIF基因已经被纯合敲除。
    Galat等人描述了糖基化抑制因子(GIF)是一种蛋白质(欧洲生物化学,1994,224,417-21)。MIF和GIF现在被认为是相似的。Watari等(PNAS2000,97,13251-6)描述了与不同的GIF表位结合的多克隆抗体,来识别Ts细胞的经翻译后修饰的GIF的生化性质。同上,Watari等报告了体外GIF呈现出不同构象的同工型。一类异构体产生于单个半胱氨酸残基的化学修饰。该化学修饰导致了GIF蛋白内的构象变化。
    需要提供一种可靠且易于使用的测定方法来测试抗-MIF抗体的效价。在诊断和治疗用途上,能够明确给定抗-MIF抗体样本的效价的方法是非常重要的。。如果不能清楚显示出抗-MIF抗体的各自效价,则该方法不能用于任何诊断或治疗。
    对于MIF相关药物,尤其是抗-MIF抗体的效价评估的稳定的生物测定方法目前尚未知晓。
    虽然在较早的测试中,MIF蛋白表现出趋化因子样作用且这些功能可以被抗-MIF抗体阻断(例如,Bernhagen等,自然医学,2007),但是迄今为止并没有建立一种基于针对例如单核细胞的自分泌诱导细胞迁移进行抑制合格的稳定的MIF生物测定方法。
    因此,本发明的目的在于提供一种能够确定抗-MIF抗体的效价的测定方法。优选该测定方法以及各自的测定方法能够提供高灵敏度和可重复性的结果,并同时是易于使用的。
    本发明人着手于研究如何实现这个目标并由此完成了本发明。
    发明内容
    本发明涉及一种高度灵敏,可重复并且易于使用的测定方法,其用来确定抗-MIF抗体、特别是抗-oxMIF抗体的效价。
    本发明的测定方法是一种细胞迁移测定方法,对其限定如下:
    1、一种用于确定抗-MIF抗体的效价的测定方法,其中,所述测定方法执行细胞迁移且包括以下步骤:
    -提供能够迁移的细胞至装置的第一部分,其中,所述细胞表达MIF,
    -将待确定抗-(ox)MIF抗体添加至装置的第二部分,所述装置的第二部分配置为与
    所述装置的第一部分相连接,使得允许细胞迁移和扩散,以及
    -计量迁移抑制。
    本文中“效价”是指对药物活性的一种度量,其表示药物达到给定强度的效应所需要的含量。它优选表示为IC50值(半最大抑制)。
    本发明的测定是基于下述原则:抑制(ox)MIF的自分泌趋化反应,并由此抑制优选在其表面上表达MIF、尤其是oxMIF的细胞的迁移,例如某些单核细胞如U937单核细胞。本发明的细胞可内源性表达MIF或可被设计而重组表达MIF。该MIF需表达为oxMIF/转换为oxMIF。在一个优选的实施方式中,oxMIF被表达在这些细胞的表面上,但这并不必须是本发明的关键特征.
    本测定方法区别于典型的趋化性试验(如科技文献中所提及),所述典型的趋化性试验基于细胞朝向化学引诱物梯度的定向迁移。根据现有技术,该化学引诱物梯度本来是该装置中除了细胞之外所加入的(ox)MIF。本发明人令人惊奇地表明,有可能提供一种使用表达MIF的细胞的测定方法,由此可以提供一种不额外添加化学引诱物,即不添加(ox)MIF的测定方法。这些发现是特别有利的,因为结果分析表明ox-MIF与扩散是相互独立的,测定方法即扩散随着时间的推移不会影响结果,因此该测定不像现有技术中的测定般地对时间敏感???ox)MIF抗体能够抑制表达(ox)MIF的细胞的(ox)MIF运动(pro- migratory)功能,从而抑制随机细胞迁移(“化学激活”)(而不是抑制科技文献中提到的细胞趋化性)。
    附图说明
    通过附图进一步说明本发明。
    图1:本申请测定方法的一般设置。
    图2:U937单核细胞的oxMIF的FACS数据。
    图3:U937(人单核细胞)和NR8383(大鼠巨噬细胞)朝向不同浓度的RAM9(抗-oxMIF抗体;对数刻度)的两种迁移抑制曲线的示例图。FACS点图显示RAM9结合到这些细胞的细胞表面(黑线;细线:同型对照抗体)。
    具体实施方式
    本发明的一部分,其特征在于下述项:
    1.一种用于确定抗MIF抗体的效价的测定方法,其中,所述测定方法执行细胞迁移,且所述测定方法包括以下步骤:
    -提供能够迁移的细胞至装置的第一部分,其中,所述细胞表达MIF,
    -将待测定的抗(ox)MIF抗体添加至所述装置的第二部分,该第二部分配置为与所述装置的第一部分相连接,使得允许细胞迁移和扩散,以及
    -计量迁移抑制。
    2.根据项1的测定方法,其中所述抗-MIF抗体是抗-(ox)MIF抗体,优选其中所述抗体选自于由RAB0、RAB4、RAB9、RAM0、RAM4和/或RAM9构成的组,尤其优选RAM9。
    3.根据项1或2的测定方法,其中,所述装置包括上室和下室,所述上室和下室通过具有孔的分离膜相连接,且细胞被添加至上室,抗体被添加至下室,其中优选该装置是双室的细胞迁移测定装置(改良的Boyden室测定装置),更优选Transwell细胞迁移测定装置。
    在一个不同的实施方式中,该装置包括一个上室和一个下室,所述上室和下室通过具有孔的分离膜相连接,且细胞和抗体均被添加至上室,其中优选该装置是双室的细胞迁移测定方法(改良的Boyden室测定方法),更优选Transwell细胞迁移测定装置。
    4.根据上述任一项所述的测定方法,其中所述细胞是表达(ox)MIF的细胞,优选是在细胞表面表达(ox)MIF的细胞,优选其中所述细胞是来自疾病样本的细胞,更优选其中所述细胞是单核细胞、优选为人单核细胞、更优选为人永生化单核细胞、最优选为U937细胞或THP-1人单核细胞或在替代实施例中的大鼠NR 8383单核细胞。
    5.根据上述任一项所述的测定方法,其中所述细胞以细胞悬浮液的方式提供于适宜的迁移介质中以允许其迁移。
    6.根据项5的测定方法,其中所述迁移介质不包含蛋白质。
    7.根据上述任一项所述的测定方法,其中所述抗体被添加无毒的生物缓冲液中供至如室的第二部分,如下室,所述生物缓冲液具有适度弱酸及其共轭碱,优选甘氨酸缓冲液,N-取代的?;撬峄撼逡?、或磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液。
    在测定方法的优选实施方式中,基于常规稀释实验来确定要进行测试的抗体的浓度。在第一步骤中,确定预期的IC50,其中,所述IC50值应与KD值(亲和常数)在相同的范围内。通常,具有抗体的稀释系列在0.01-100nM的范围内被稀释成若干种浓度,例如6-10种浓度,从而确定预期的IC50值。在实际的测定中,该预期IC50将被用于作为稀释系列的固定中点,所述稀释系列通常具有至多5个低于IC50值的浓缩工序以及至多5个高于IC50值的浓缩工序。浓缩工序通常分别以3,4或5的指数指数性地增减。
    因此,假定在预备实验中确定的预期IC50为1nM,则测定中实际使用的浓度将为(使用5作为指数且包含三步):0.008、0.04、0.2、1、5、25和125nM。
    8.根据上述任一项所述的测定方法,其中添加所述抗体直至在所述测定中的最终浓度为0.01-100nM,优选为0.02至50nM,更优选0.04-30nM的稀释系列,优选作为系列稀释。
    在本测定方法的一个优选实施方式中,该测定培养一段时间直至本领域技术人员确定可以观察到合适的剂量反应曲线。取决于测定中使用的细胞,此培养期有所不同,同时也随着测定室中使用膜孔的大小而变化。较大的孔径将导致该细胞更快速地分布,从而培养时间较短,但可能会导致非特异性的效果。培养时间的调整可在预备试验中完成,其属于本领域技术人员的一般技术范围之内。
    9.根据上述任一项前述的测定方法,所述测定装置例如所述室在添加细胞和抗体后培养6-20小时,优选8-12小时,优选在约37℃下培养,其中所述细胞是U937细胞,且其中所述膜具有约5μm的孔径。
    10.根据上述任一项所述的测定方法,其中,对已迁移的细胞进行计数,优选在上述培养步骤之后,优选对下室中已迁移的细胞进行计数,由此可获取被测抗体的效价信息,优选通过计算半-最大抑制抗体浓度(IC50值)来获取该信息。
    11.根据上述任一项所述的测定方法,其中所述细胞在用于测定之前经受10至48小时,优选8-16小时,更优选10-12小时的血清饥饿。
    本文中的“血清饥饿”是指该细胞已在不含血清、优选不含胎牛血清的介质中培养了如上所述的一段时间。需要进行血清饥饿来确保实际的测定方法中不包含血清成分。如果实际的测定方法中包含了血清成分,其结果有可能为非特异性的,因为已知血清成分可以作用为强效的趋化因子(下述示例中同样使用了血清作为阳性对照)。
    12.根据上述任一项所述的测定方法,其中所述细胞来源于工作细胞库。
    13.根据上述任一项所述的测定方法,其中设备中不添加(ox)MIF。
    这避免了制备重组MIF蛋白的需要,从而成为本测定方法的优势之一。
    本测定方法借助于细胞数可以执行,所述细胞数可以基于本领域技术人员的公知常识来确定。
    该细胞数被定义为加入到各测定装置的各孔(优选上室)的细胞个数。
    14.一种测定试剂盒,其用于确定抗-(ox)MIF抗体的效价,包含为了进行前述任何一项或多项所述测定方法所必需的所有试剂,优选包含
    -表达MIF的细胞
    -抗体稀释缓冲液(例如,甘氨酸缓冲液)
    -迁移介质,和/或
    -两腔室细胞迁移系统。
    该试剂盒的优选组件将在下文中更详细阐述。
    15.药物或诊断组合物,其包含抗-(ox)MIF抗体,其中所述抗-(ox)MIF抗体的特征在于,它们已进行如上述任一项所限定的效价测定。
    根据本发明,首次能够可靠地提供药物和诊断组合物,其包含抗-(ox)MIF抗体,特别是RAM0、RAM4、RAM0、RAB9、RAB0和/或RAB4,最优选RAM9,其中所述的抗体的效价被确定。所得的抗体制剂与该抗体的效价一致。
    通常在各种疾病,特别是癌症发病后检测到升高的MIF水平,即总MIF水平。然而MIF也存在于健康受试者的血液循环中,这变得难以明显区分。与此相反,健康受试者中 不存在oxMIF,因此其对于MIF相关疾病是一种较强的诊断用标记物。如本发明人的早期研究显示,在疾病状态下oxMIF增加且在患者的样本如血浆、血液、血清和尿中是可检测的。
    巴克斯特抗体RAB9、RAB4和RAB0,以及RAM9、RAM4和RAM0分别特异性地结合至oxMIF(并且不能结合redMIF)。
    在由本发明人进行的早期实验显示,氧化过程如胱氨酸介导的氧化,GSSG(ox.谷胱甘肽)介导的氧化作用或用Proclin300或蛋白质交联剂(例如BMOE)培育后可以使得MIF与上述抗体的结合。
    本发明人取得了下述令人惊奇的结论:
    *重组MIF(人、小鼠、大鼠、CHO和猴子)的氧化还原调节(半胱氨酸/谷氨酸介导的轻度氧化)或Proclin300或者蛋白质交联剂处理重组MIF可以导致重组MIF与巴克斯特抗-MIF抗体RAB9、RAB4和RAB0的结合
    *oxMIF的还原会导致抗体的结合损失
    *oxMIF-亚型与生物抗体疗效相关联的特异性(体外/体内)。
    只有oxMIF水平,而不必是MIF水平与疾病状态相关联。
    上述抗体的特征在于它们的序列以及在大肠杆菌(TG1菌株)作为质粒保存,包括上述每个抗体RAB0、RAB4和RAB9,以及RAM0、RAM4和RAM9各自的重链或轻链。
    质粒的特征在于它们的DSM编号,DSM是根据布达佩斯条约在德国微生物保藏和细胞培养中心(DSMZ)(位于德国,布伦瑞克,Mascheroder WEG1b)保存时得到的官方编号。这些质粒分别保存在大肠杆菌菌株。
    编号为DSM25110的质粒包含抗-MIF抗体RAB4的轻链序列。
    编号为DSM25112的质粒包含抗-MIF抗体RAB4的重链(IgG4)序列。
    质粒DSM25110和DSM25112在适宜的宿主细胞内的共表达导致了优选的抗-MIF抗体RAB4的产生。
    编号为DSM25111的质粒包含抗MIF抗体RAB9的轻链序列。
    编号为DSM25113的质粒包含抗MIF抗体RAB9的重链(IgG4)序列。
    质粒DSM25111和DSM25113在适宜的宿主细胞内的共表达导致优选的抗-MIF抗体RAB9的产生。
    编号为DSM25114的质粒包含抗-MIF抗体RAB0的轻链序列。
    编号为DSM25115的质粒包含抗-MIF抗体RAB0的重链(IgG4)序列。
    质粒DSM25114和DSM25115在适宜的宿主细胞内的共表达导致优选的抗MIF抗体RAB0的产生。
    同样被保存的还有抗体RAM0、RAM9和RAM4;均按照布达佩斯谈判于2012年4月12日被保存于DSMZ(德国,布伦瑞克)。使用以下命名:
    RAM9-重链:大肠杆菌GA.662-01.pRAM9hc-DSM 25860。
    RAM4-轻链:大肠杆菌GA.906-04.pRAM4lc-DSM 25861。
    RAM9-轻链:大肠杆菌GA.661-01.pRAM9lc-DSM 25859。
    RAM4-重链:大肠杆菌GA.657-02.pRAM4hc-DSM 25862。
    RAM0-轻链:大肠杆菌GA.906-01.pRAM0lc-DSM 25863。
    RAM0-重链:大肠杆菌GA.784-01.pRAM0hc-DSM 25864。
    在本申请的文中,生物样本优选为要进行诊断的受试者的体液样本或组织或细胞样本。体液样本是本领域技术人员公知的任意体液样本。例如但不限于这些样本:血液、血浆、血清、唾液、尿液、鼻液、腹水、眼内液、羊水、房水、玻璃状液、泪液、考珀液、精液、组织液、淋巴液、乳汁、黏液(包括鼻涕和痰)、胸膜液、脓、月经、阴道润滑液、皮脂、脑脊液和滑液。进一步地,本申请文中的生物样品可以是(中空)的身体器官(例如支气管肺泡灌洗、胃灌洗和肠灌洗)灌洗液(洗涤物)。组织样品优选为组织活检,如针芯活检。
    在本申请的文中的一个替代实施例中,生物样品是在其上进行诊断的受试者的细胞样品,最优选来自循环系统或患病组织的细胞样品,更优选为单细胞悬浮液样品。
    术语“预防性”或“治疗性”治疗是本领域公认的并且是指对患者进行给药。如果在不希望病症(例如,疾病或其它如人或动物不希望的状态)的临床表现之前使用它,那么该治疗是预防性的,即其可以?;じ鎏迕庥诜⒄钩刹幌M淖刺?,而如果在不希望病症表现后给药,则该治疗是治疗性的(即它的目的是减少、减轻或维持现有的不希望病症或其副作用)。
    如本文所用的抗-(ox)MIF化合物是指减弱、抑制、对抗、抵消或降低(ox)MIF的生物活性的任意试剂???(ox)MIF化合物可以能够抑制或中和(ox)MIF活性的试剂,例如抗体,特别优选如本文中所述的抗体,更优选的分别是抗体RAB9、RAB4和/或RAB0或RAM9、RAM4和/或RAM0。
    定义和一般技术
    除非此处另有定义,与本发明相关的科学和专业词汇应当具有本领域中的技术人员共同理解的含义。通常,此处所用的与细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、基因学以及蛋白质和核酸化学相关的命名及其技术是本领域中为人所熟知的和被共同使用的。本发明的方法和技术通常是根据本领域中为人所熟知的常规方法来操作的,如本说明书中引用和讨论的各种一般的和更具体的参考文献中所描述的一样,除非另有陈述。例如,如Sambrook等的《分子克?。菏笛槭沂植帷?,第二版,美国冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约(1989),和Ausubel等的《当代分子生物学实验指南》,Greene出版协会(1992),以及Harlow和Lane的《抗体:实验室手册《,美国冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约(1990),并入此文以供参考。
    “MIF”或者“巨噬细胞迁移抑制因子”指的是蛋白质,其是已知的免疫和炎症反应中的关键的中介体,特别是作为糖皮质激素的反向调节剂。MIF包括哺乳动物MIF,特别是人MIF(Swiss-Prot最初登录号:P14174),其中单体形式被编码成具有115个氨基酸的蛋白质,但是由于初始的甲硫氨酸被切除,产生具有114个氨基酸的蛋白质?!癕IF”也包括“GIF”(糖基化抑制因子)及其它形式的MIF如MIF融合蛋白。MIF中氨基酸的编号起始于N末端甲硫氨酸(氨基酸1)并结束于C末端丙氨酸(氨基酸115)。
    根据本发明的目的,“氧化的MIF”或oxMIF被定义为MIF的异构体,其通过采用温和的氧化剂例如胱氨酸处理MIF得到。如本发明人在早期的研究中已经显示的,用这种方法处理的重组oxMIF包括MIF的异构体,该异构体和oxMIF共享结构的重排,oxMIF(例如)在动物感染细菌后在体内产生。。
    根据本发明的目的,redMIF定义为还原的MIF,其为不和RAB0、RAB9和/或RAB4结合的MIF。
    本发明所述的抗-oxMIF抗体能够区分oxMIF和red MIF,所述oxMIF和red MIF分别通过轻度氧化或还原得到???oxMIF抗体可用于特异性检测oxMIF。这些构象体之间的区别可通过如本领域中公知的酶联免疫吸附(ELISA)或表面等离子体共振进行评估。
    通过Biacore评估抗体的差异结合.
    使用Biacore3000系统,通过表面等离子体共振分析来检测oxMIF和redMIF与抗体RAB9和RAB0的结合动力学。所述抗体涂覆于CM5(=甲基葡聚糖)芯片,并且注射与0.2%Proclin300预培养的重组MIF蛋白。(Proclin300由氧化异噻唑酮构成,其能够通过 避免oxMIF转化到redMIF而稳定oxMIF结构)。在不添加ProClin300的天然HBS-EP缓冲液(=Biacore运行缓冲液)中,不能与RAB9、RAB0或相关抗体(不相关的同型对照抗体)的重组MIF蛋白用作阴性(背景)结合对照。
    在一个优选的实施方式中,oxMIF是与抗体RAB9、RAB4和/或RAB0或其抗原-结合片段差异性结合的MIF,这意味着这些抗体能与oxMIF结合,而redMIF不与这些抗体中的任何一个结合。
    在其他实施方式中,抗-oxMIF抗体,例如上述抗体或其结合oxMIF的抗原结合部分的KD值低于100nM,优选KD值低于50nM,更优选KD值低于10nM。特别优选本发明的抗体结合oxMIF的KD值低于5nM。
    (非)结合的抗体,例如RAB9,RAB4或RAB0(到oxMIF或redMIF)对于本领域技术人员来说是常识,实例是下列方法中的任何一个:用重组MIF差异性地结合至酶联免疫吸附ELISA,或用还原或氧化状态下的重组MIF差异性地结合至表面等离子共振,例如众所周知的上述的Biacore测定方法。
    抗体例如RAB9、RAB4或RAB0能否结合(例如oxMIF或redMIF)可以根据本领域技术人员已知的方法确定,举例而言可以是下述方法中的任何一个:使用还原态或氧化态的重组MIF的ELISA,或使用还原态或氧化态的重组MIF的表面等离子体共振,例如上述已知的Biacore实验。
    对于确定抗体与例如rec.(ox)MIF结合的一个优选方法是表面等离子体共振,在此的“结合”意味着KD值低于100nM、优选低于50nM、甚至更优选低于10nM,其中未结合redMIF,其特征在于KD值超过400nM?!敖岷稀焙汀疤匾煨越岷稀痹诒疚目山换皇褂?,定义如上所述。本申请文中的“差异性结合”是指一种化合物,尤其是如本文中所述的抗体,其能够结合至oxMIF(例如具有上述KD值)而不结合至redMIF(如上所述的未结合)。
    “抗体”指的是完整的抗体或者可与完整的抗体进行(特异性)结合竞争的抗原结合部分。通常参见《基础免疫学《,第7章(Paul,W.编著,第2版。Raven出版社,纽约(1989))(通过引用包含在本文)。术语抗体包括但不限于人抗体、哺乳动物抗体、分离的抗体和基因工程形式的抗体例如嵌合体、骆驼化或人源化抗体。
    术语抗体的“抗原结合部分”指的是抗体的有能力特异性地与抗原(如(ox)MIF)结合的一个或多个片段??乖岷喜糠挚梢酝ü刈镈NA技术或者通过酶法或化学法裂解 完整的抗体来生成??乖岷喜糠职ǖ幌抻诶缦率觯篎ab、Fab′、F(ab′)2、Fv和互补性决定簇区域(CDR)片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、多抗体和含有抗体的至少一部分的多肽,使得足以与特异性抗原相结合。从N末端至C末端,成熟轻链和重链可变区域两者都包含区域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。氨基酸至每个结构域的排列与下述文献中的一定保持一致:Kabat,参见“具有免疫性兴趣的蛋白序列”(国立卫生研究院,贝塞斯达,马里兰州(1987和1991)),Chothia等,J.Mol.Biol.196:901-917(1987),或者Chothia等,Nature.342:878-883(1989)??固寤蛘咂淇乖岷喜糠挚梢员谎苌蛘弑涣又亮硪桓龉δ苄苑肿?如另一种肽或蛋白质)。例如,抗体或者其抗原结合部分可以被功能性地连接至一个或多个其他分子实体比如另一个抗体(如双特异性抗体或者双抗体)、可检测的试剂、细胞毒素试剂、药物试剂和/或连接分子。
    按照本领域技术人员的公知常识,术语“KD”在这里是指,特定抗体相对于各自抗原的平衡解离常数。这种平衡解离常数可以测量较大个体(这里指oxMIF或red MIF复合物/抗体)的分离倾向,即分解成更小的成分(这里指oxMIF或redMIF和抗体)。
    术语“人的抗体”是指任何其中可变结构域和恒定结构域序列是人的序列的抗体。该术语包含具有来源于人类基因但却被改变过的序列的抗体,所述改变比如为了减少可能的免疫原性、增加亲和性、去除可能引起不良折叠的半胱氨酸等等。该术语包含了在非人类细胞中重组制备的抗体,其能够如给予人类细胞非典型的糖基化。
    术语“人源化抗体”是指包含人类序列及也包含非人类序列的抗体。
    术语“骆驼化抗体”是指抗体的结构或序列已改变成更接近于来自于骆驼的抗体,也被命名为骆驼抗体。骆驼化抗体的设计和生产方法对本领域技术人员来说是一般常识。
    术语“嵌合抗体”是指包含来自两种或以上的不同种类的区域的抗体。
    术语“分离的抗体”或者“其分离的抗原结合部分”指的是从抗体源比如使噬菌体展示文库或者B细胞谱中被识别和挑选的一种抗体或其抗原结合部分。
    本发明的抗-(ox)MIF抗体的制备包含采用基因工程生产重组DNA的任何方法,例如通过反向转录RNA和/或扩增DNA和将其克隆到表达载体中。在一些实施例中,所述载体是病毒载体,其中额外的DNA片段可以连接到病毒基因组中。在一些实施方式中,所述载体能够在被引入的宿主细胞中自主复制(例如,具有细菌复制起点的细菌载体和游离型 (episomal)哺乳动物载体)。在其他实施方式中,所述载体(例如非-游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞时可以整合进宿主细胞的基因组中,从而随着宿主基因组一起复制。此外,特定的载体能够引导与它们可操作地连接的基因的表达。这样的载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为,“表达载体”)。
    抗-(ox)MIF抗体可以通过常规的表达载体来制备,常规的表达载体例如为细菌载体(例如,pBR322中和其衍生物)或真核载体。编码所述抗体的那些序列可由调节宿主细胞的复制,表达和/或分泌的调控序列一起被提供。这些调控序列包括例如启动子(例如,巨细胞病毒CMV或SV40)和信号序列。表达载体还可以包括选择和扩增标记物,如二氢叶酸还原酶基因(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶和胸苷激酶。所用载体的组分例如选择标记物、复制子、增强子可以购买得到或通过常规方法制备。载体可以构建为在不同的细胞培养物中的表达,例如哺乳动物细胞例如CHO、COS、HEK293、NSO、纤维组织母细胞,昆虫细胞、酵母或细菌例如大肠杆菌。在一些情况下,使用允许给予所表达蛋白质最佳糖基化的细胞。
    抗-(ox)MIF抗体的轻链基因(s)和抗(ox)MIF抗体的重链基因(s)可以被插入到不同的载体或插入到同一表达载体中。所述抗体基因通过标准方法被插入到表达载体中,例如通过抗体基因片段和载体上的互补限制性位点的连接,或如果没有限制位点则通过平末端连接。
    抗-(ox)MIF抗体或其抗原结合片段的制备包括本领域已知的通过转染将重组DNA导入真核细胞的任何方法,例如通过电穿孔或显微注射。例如,抗-(ox)MIF抗体的重组表达可通过下述方式实现:将包含编码抗-(ox)MIF抗体的DNA序列的表达质粒通过适当的转染方法转入适当的宿主细胞株,所述序列受一种或多种调控序列例如强启动子的控制,从而得到所转入的序列已经稳定整合到基因组的细胞。脂转染法是根据本发明可使用的转染方法的一个例子。
    抗-(ox)MIF抗体的生产也可以包括本领域中已知的用于培养所述转化的细胞的任何方法,例如以连续或分批培养,及抗-(ox)MIF抗体的表达,例如组成性或诱导性表达。特别是进一步参考在WO 2009/086920中提及的抗-(ox)MIF抗体的生产。在一个优选的实施方式中,根据本发明产生的抗-(ox)MIF抗体可以结合oxMIF或其表位。根据本发明,特别优选的抗体是RAB 9、RAB4和/或RAB0以及RAM9、RAM4和/或RAM0。
    这些抗体的序列的一部分已经公开于WO2009/086920;本申请的其他序列如下所示:
    RAB9的轻链的氨基酸序列:SEQ ID NO:1

    RAB4的轻链的氨基酸序列:SEQ ID NO:2

    RAB0的轻链的氨基酸序列:SEQ ID NO:3

    RAB2的轻链的氨基酸序列:SEQ ID NO:4

    RAB9的重链的氨基酸序列:SEQ ID NO:5
    EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYSMNWVRQA PGKGLEWVSS IGSSGGTTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCAGSQ WLYGMDVWGQ GTTVTVSSAS TKGPSVFPLA PCSRSTSEST AALGCLVKDY  FPEPVTVSWN SGALTSGVHT FPAVLQSSGL YSLSSVVTVP SSSLGTKTYT CNVDHKPSNT KVDKRVESKY GPPCPPCPAP EFLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV VVDVSQEDPE VQFNWYVDGV EVHNAKTKPR EEQFNSTYRV VSVLTVLHQD WLNGKEYKCK VSNKGLPSSI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSQEEMTKNQ VSLTCLVKGF YPSDIAVEWE SNGQPENNYK TTPPVLDSDG SFFLYSRLTV DKSRWQEGNV FSCSVMHEAL HNHYTQKSLS LSLGK,
    RAB4的重链的氨基酸序列:SEQ ID NO:6
    EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS IYAMDWVRQA PGKGLEWVSG IVPSGGFTKY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVN VIAVAGTGYY YYGMDVWGQG TTVTVSSAST KGPSVFPLAP CSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTKTYTC NVDHKPSNTK VDKRVESKYG PPCPPCPAPE FLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SLGK,
    RAB0的重链的氨基酸序列:SEQ ID NO:7
    EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS WYAMDWVRQA PGKGLEWVSG IYPSGGRTKY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCARVN VIAVAGTGYY YYGMDVWGQG TTVTVSSAST KGPSVFPLAP CSRSTSESTA ALGCLVKDYF PEPVTVSWNS GALTSGVHTF PAVLQSSGLY SLSSVVTVPS SSLGTKTYTC NVDHKPSNTK VDKRVESKYG PPCPPCPAPE FLGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSQEDPEV QFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQFNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKGLPSSIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP SQEEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSRLTVD KSRWQEGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SLGK,
    RAB2的重链的氨基酸序列:SEQ ID NO:8

    RAM0hc的氨基酸序列:SEQ ID NO:9

    RAM0lc的氨基酸序列:SEQ ID NO:10

    RAM0lc的氨基酸序列:SEQ ID NO:11

    RAM9lc的氨基酸序列:SEQ ID NO:12

    RAM4hc的氨基酸序列:SEQ ID NO:13

    RAM4lc的氨基酸序列:SEQ ID NO:14


    本发明的抗MIF抗体优选分离的单克隆抗体。该抗MIF抗体可以是IgG、IgM、IgE、IgA、或IgD分子。在其他实施方式中,抗-MIF抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。在其他实施方式中,抗体是亚类IgG1或IgG4的任何一个。在其他实施方式中,抗体是亚类IgG4。在一些实施方式中,所述的IgG4抗体具有一个单独突变,其将丝氨酸(丝氨酸228,根据Kabat编号排列)改变为脯氨酸,因此,IgG4的Fc区的子序列CPSC亚序列变为IgG1的亚序列CPPC(Angal等,分子免疫学,1993,30,105-108)。
    此外,抗(ox)MIF抗体的制备可以包括本领域中已知的用于抗体纯化的任何方法,例如通过阴离子交换色谱法或亲和色谱法。在一个实施方式中,抗-(ox)MIF抗体可以通过体积排阻色谱法从细胞培养物上清液纯化而来。
    术语MIF的“中心区域”和“C末端区域”分别是指包含人类MIF氨基酸第35-68位和氨基酸第86-115位的区域,优选分别包含人类MIF氨基酸第50-68位和氨基酸第86到102位的区域。
    通过本发明测定的特别优选的抗体可以结合至人类MIF的氨基酸第50-68位或氨基酸第86-102位的任一区域。这也可以通过优选的抗体RAB0、RAB4、RAB2和RAB9的结合以及RAM4、RAM9和RAM0的结合来反映,上述结合如下所示:

    术语“表位”包括任何能够与免疫球蛋白或者抗体片段特异性地结合的任何蛋白决定簇??乖砦痪龆ù赝ǔS苫灾驶钤镜谋砻娣肿踊疟热绫┞兜陌被?、氨基糖或者其他碳水化合物侧链组成,并且通常有特定的三维结构特征以及特定的荷电特性。
    术语“载体”指的是能够转运另一个与之相连接的核酸的核酸分子。在一些实施方式中,载体是质粒,即附加的DNA片段可与之相连接的环状双链DNA环。
    术语“寄主细胞”指的是在引入表达载体后能够制备重组蛋白质的细胞系。术语“重组细胞系”指的是已经引入重组表达载体的细胞系。应当理解,“重组细胞系”不仅指特定 的个体细胞系,也指该细胞系的后代。由于突变或者环境影响,而在后代中可能出现某些修饰,所以其后代事实上可能和母细胞不一致,但是仍然被包括在此处使用的术语“重组细胞系”的范围中。
    根据本发明的宿主细胞的类型例如是COS细胞、CHO细胞或例如HEK293细胞,或本领域技术人员公知的任何其他宿主细胞,也包括例如细菌细胞,例如像大肠杆菌细胞。在一个实施方式中,抗-MIF抗体被表达在缺乏DHFR的CHO细胞系中,例如DXB11中,其中添加G418作为选择标志物。当将编码抗体基因的重组表达载体被引入到CHO宿主细胞时,通过将宿主细胞培养一段足够长的时间以使得抗体在宿主细胞中表达或抗体的分泌到宿主细胞生长的培养基中,从而制备抗体。
    可以使用标准蛋白质纯化方法将抗(ox)MIF抗体从培养基中回收。
    任何被生产的抗-(ox)MIF抗体均具有给定的效价。如果该抗体配制于诊断或药物制剂中,已知确保其效价是尤其重要的。因此,需要一个明确以及可靠的测定方法来测量和计算该效价,例如用IC50值来表示。
    本发明的优选的测定形式是一种改良的Boyden小室测定方法中,其包括两个腔室,其允许细胞迁移并允许检测完成之后计数迁移的细胞,优选下室中迁移的细胞。Boyden小室法和小室法两方均是本领域技术人员所熟知的。本领域用于细胞迁移测定的所有公知的设备原则上均可用于本发明的测定方法;唯一的先决条件是,具有(至少)两个腔室,向其中一个室(例如上室)中提供细胞,并向另一室(例如下室)提供抗体。但是也可以将抗体与细胞一起添加到上室。除了Boyden小室法,其他公知的测定方法都可以使用,例如多孔室,或邓恩室(排列在载玻片上的同心环)。腔室必须相互连接以允许相关细胞的扩散和特定的迁移。这是通过提供各自具有孔的连接膜来实现的??拙兜难≡袢【鲇诓舛ㄖ惺褂玫南赴嘈?,这在本领域中是公知的。作为其实例,但绝不限制于该实例,本发明的测定方法中通常选用以下孔径,例如Boyden小室法中:


    对于本发明中优选使用的迁移介质没有特别限制;迁移介质是本领域的公知技术。在一个优选的实施方式中,介质不含蛋白质和血清。一个实例是无血清RPMI-介质:具有10mM的Hepes、1mM的丙酮酸钠、4.5g/L葡萄糖的RPMI 1640(Gibco,目录号:11835)。
    作为示例性的对照组,用含有10%FBS的培养基来诱导细胞迁移(RPMI-培养基:RPMI 1640(Gibco公司,目录号:11835),含已灭活的10%FBS、10mM的Hepes、1mM的丙酮酸钠、4.5g/L的葡萄糖、0.05mM的β-巯基乙醇。
    本发明的测定方法中优选的细胞是那些能够迁移的细胞。对于本发明来说特别重要的是这些细胞是可以表达(ox)MIF。所述细胞可表达内源性(ox)MIF或(ox)MIF可基因工程化地改造到这些细胞中从而被其表达。这尤其实现了细胞的迁移;也就是说,细胞通过表达(ox)MIF而刺激自身迁移,该表达优选在细胞表面上。已经证实这些细胞在其迁移中特别活跃,而如果抗-(ox)MIF抗体与这些细胞的(ox)MIF进行接触时,这些细胞则在此迁移行动中受到抑制(如减慢)。这种接触主要发生在如具有孔的膜上,其划分出两腔室。如果相关抗体具有高效价,则与其低效价时相比更能够减慢细胞的迁移动作。实际上通过分隔如孔而从上室迁移到下室的细胞的数量作为抗体效力的一个指标。较多的细胞迁移到下室则相当于低效价(即迁移抑制低),而较少的细胞迁移到下室则相当于高效价(即迁移抑制高)。
    通常满足这些标准的细胞对于本领域技术人员是已知的,然而在本申请的方式中,特别优选使用单核细胞,如(人类)U937细胞(ATCC目录号:CRL-1593.2)。如果抗-oxMIF抗体的效价由需要表达(ox)MIF的细胞确定,如表达在细胞表面上,这可以通过本领域技术人员众所周知的如FACS(荧光激活细胞分选)来确定。它们可以重组性地表达MIF或内源性地表达MIF,例如来自疾病样本的细胞,例如癌症样本,如本发明的发明人先前研究所显示的,oxMIF仅由疾病状态下的细胞表达出。而上述优选细胞符合该标准。
    在进一步优选的实施方式中,该抗体在缓冲体系中提供?;撼逄逑涤叛∥薅厩叶愿每固寰哂辛己萌芙庑缘?。更优选该缓冲体系包括一种适度的弱酸及其共轭碱,该弱酸及其共轭碱为本领域技术人员公知的如PBS(磷酸缓冲盐水)或N-取代的?;撬峄撼寮?。一种特别优选的实施方式使用了甘氨酸缓冲液(例如100-350mM,更优选200-300mM,最优选约250mM,pH4.5-5.5,优选pH约为5.0的甘氨酸缓冲液)。
    该测定的优选温度为37℃或其左右。
    本发明通过下列实施例作进一步说明,但是这些实施例并不限定本发明的范围,本发明范围由随附的权利要求来限定。
    具体实施方式
    实施例
    实施例1
    抗MIF抗体RAM9化学激活测定方法;基于细胞的测定方法
    预期目的:
    设立该测试的目的是测试甘氨酸缓冲抗-MIF RAM9制剂的功能(=测试项目)抑制单核细胞的随机迁移(=化学激活)。经本发明人证实,该测定方法以及各个方法可以用作对最终的药物产品(FDP)的处理工序中的质量控制测试。
    1)原理:
    MIF组成性地表达在U397(和其他癌性)单核细胞上且oxMIF存在于这些细胞的表面(FACS数据,参见图2),其支持支持迁移功能。使用内源或外源性地表达(ox)MIF的细胞是本发明的重要特征,所述细胞为例如来自疾病样本的细胞。这个原理是基于本发明人的先前研究发现:健康细胞或组织上不存在oxMIF。U397细胞系是进行本发明的优选实施例。它是来自癌组织的永生细胞系,而不是原代细胞系。
    测试方法的原理:
    抗-MIF抗体的抑制人单核细胞的随机迁移(化学激活)能力在测定方法(相当于Boyden小室测定方法)中进行测定。图1中显示该测试方法的常规设定。针对该目的,将血清饥饿的单核细胞(细胞系:U937)接种到多孔(5μm)培养室(即“上室”)中并测定细胞朝不同浓度的抗-MIF抗体RAM9(=下室的测试项)的迁 移。IC50由迁移的细胞相对于RAM9(对数标度)的浓度的非线性回归方程(4-参数逻辑)来确定:Y-(Ymax-Ymin)/(1+(X/IC50)Expslope+Ymin.
    测试方法详情:
    材料与设备


    2)其他信息:
    样品应用:
    施用各抗体稀释液6次(n=6)。其平均值用于进一步的计算。
    使用最小体积为5μl的吸管
    对照:每个板都有阴性和阳性对照
    该测试方法均进行一式两份(每批测试两个板)。
    3)布局(在下图中显示):
    RAM9和对照抗体样本不使用边缘孔(96孔ELISA板)以提高可靠性(边缘孔仅用于缓冲对照和阳性对照)。

    p.c.=阳性对照(血清)
    b.c.=背景对照(缓冲)
    4)流程:
    第1天:
    a.计数U937细胞
    b.将适量的细胞悬浮液在室温下以800rpm离心5分钟。
    c.弃去上清液,将细胞重新悬浮于预热的迁移介质(洗涤)中。
    d.在室温下以800rpm进行5分钟的进一步离心步骤。
    e.弃去上清液。
    f.此后,将细胞重新悬浮在预热的迁移介质至1×106个细胞/ml。
    g.将细胞悬浮液在培养箱中培养24小时。
    第2天:
    a.通过如下步骤平衡所述平板:
    在平板的所有孔中施用235μl预热的迁移介质。把培养室置于板上并于培养室中添加100μl的预热迁移介质。在所述细胞培养孵化器中培养至少1小时。
    b.通过如下步骤制备抗体:
    RAM9在下层孔的最终浓度:
    30nM、10nM、3,33nM、1,11nM、0,37nM、0,12nM、0,04nM(用6,7nM来计算1μg/ml的IgG)
    的下层孔的最终浓度:
    30nM、10nM、3,33nM(用6,7nM来计算1μg/ml的IgG)
    通过加入相同体积的抗体稀释缓冲液调整样本体积。因为高度推荐执行通过使用稀释板和多通道移液器的预稀释步骤,从而提高了样品的混合,进行预稀释步骤对本领域技术人员同样是是熟知的。
    c.通过如下步骤制备细胞:
    对细胞计数并在室温下以800rpm离心5分钟。弃去上清液,将细胞用预热的迁移介质洗涤一次。以800rpm离心5分钟的另一个离心步骤。
    弃去上清液并将沉淀重悬浮至细胞数为1×106个细胞/ml。
    d.通过如下步骤制备平板:
    弃去平衡步骤中的培养基(来自于孔和培养室的)。避免接触培养室的膜且培养室以底部朝上的方式被放置在层流净化罩中(避免膜的空气干燥)
    e.添加220μl预热迁移介质(或10%的全HG介质=阳性对照)。在不使用的孔中添加235μl的迁移介质??固宓募尤胪ü缦虏街柰瓿桑?
    用多通道移液器将15μl预稀释的抗体施加到平板的孔中。避免孔中产生气泡。
    f.通过如下步骤添加细胞:
    所述培养室小心地附着在板并用多通道移液器将100μl所制备的细胞悬浮液加至(1×106个细胞/ml)到每一个培养室。
    →培养室的最终细胞数:1×105个细胞/孔。
    不能用移液器尖端触及该培养室的膜。
    g.平板在细胞培养孵育器中培养过夜(约16小时)。
    第3天:
    a.废弃该培养室;该板用于细胞计数。
    b.通过使用多通道移液器上下抽吸数次将细胞分离。
    c.除去气泡。
    d.允许细胞在测量前在孔中下沉至少30分钟。
    e.通过使用Cellavista系统(通过细胞融合的操作者设定来进行THP-1AK的参数设置)计数细胞。
    通过本领域技术人员公知的技术,如通过非线性回归模型来完成评估(IC50值的计算):所述非线性回归模型具有4参数拟合且使用下述等式:
    Y=(Ymax-Ymin)/(1+(X/IC50)Expslope+Ymin
    RAM9的可接受的IC50-值的例示范围:≥0.1nM and≤4nM
    在这方面,“可接受的”是指,如果每块平板经计算的IC50不在该范围内,则必须重复测试。如果重复试验的IC50是不在此范围内,则RAM9抗体未通过测试。
    注意:
    对RAM9的IC50的计算,其曲线拟合应包括例如至少五个连续的浓度(和合适的值)。(在所示的例子中,6种浓度(0.04nM-10nM的抗体)已被用于计算)。






    5)结论:该方法有资质实现其预期目的,也就是说,它可以成功地用于测试抗-=(ox)MIF抗体的效价。特别是,它非常适合临床阶段的I+II材料的测试。
    实施例2
    原则上,该相同的测定方法可用于测定抗体是否可以与细胞一起被提供至上室。
    小结:
    细胞迁移测试:HTS Transwell板(Coming):5μm
    *细胞:U937(第10代),过夜饥饿
    *RAM9抗体:30nM-0.04nM,移液至培养室
    *甘氨酸:30nM;10nM;3,3nM移液至培养室
    *阴性对照:甘氨酸;阳性对照:FBS(胎牛血清)
    *培养:2平板,16小时
    *用于结果的计算
    结果:
    平板1
    抗体浓度(nM)测量值拟合01997,6 0,042452,72498,30,122490,82388,40,372019,22106,01,11642,01621,23,31179,61115,510688,0810,830753,7685,7最大值=A2555斜率=B1,0IC50=C1,2最小值=D620sumxmy2 44358
    拟合:I%=(A-D)/(1+(X/C)ExpB+D(=S型曲线)
    平板2
    CKonc.抗体(nM)测量值拟合02183,1 0,042562,82646,50,122685,22575,90,372354,22357,31,11872,51939,53,31621,21527,4101263,31323,0301266,71256,2最大值=A2674斜率=B1,2IC50=C1,1最小值=D1230sumxmy2 35893
    拟合:I%=(A-D)/(1+(X/C)ExpB+D(=S型曲线)
    结论:
    该测定方法仍然适用于预期目的。
    本测定方法设置了一个关于测试抗变换性和精度的新的(工业)标准,使得允许按照FDA生物测定指南来测试MIF特异性抗体/药物的效价;实际的测定是合格的测试,其足以检测抗-MIF最终药物产品批次直到临床III期。通过应用来自其它物种的单核细胞(如大鼠),该测定方法也可用于支持MIF抑制抗体/分子的物种比较研究,而不需要使用重组的MIF。
    该测定易于使用,并且不需要使用重组的MIF蛋白。根据其作用机制,该生物测定被FDA接受用于在炎性疾病的背景下对抗MIF抗体的效价评估。其它测定原理/格式可以由监管机构决定以适应于抗-MIF抗体/药物在其他适应症(如癌症)中的效价评估。










































    PCT/RO/134表








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    MIF 抗体 细胞 迁移 测定 方法
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