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    重庆时时彩统计分析: 一种基于选择性剔除技术的中药效应物质辨识方法.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201510008084.8

    申请日:

    2015.01.07

    公开号:

    CN104698097A

    公开日:

    2015.06.10

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||著录事项变更IPC(主分类):G01N 30/02变更事项:发明人变更前:林航 开钧 尚冠雄 唐于平 王林艳 段金廒变更后:唐于平 瞿城 王林艳 金益 段金廒|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 30/02申请日:20150107|||公开
    IPC分类号: G01N30/02 主分类号: G01N30/02
    申请人: 南京中医药大学
    发明人: 林航; 开钧; 尚冠雄; 唐于平; 王林艳; 段金廒
    地址: 210029江苏省南京市汉中路282号
    优先权:
    专利代理机构: 南京经纬专利商标代理有限公司32200 代理人: 杨海军
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201510008084.8

    授权公告号:

    |||||||||

    法律状态公告日:

    2016.08.17|||2016.02.10|||2015.07.08|||2015.06.10

    法律状态类型:

    授权|||著录事项变更|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种基于选择性剔除技术的中药效应物质辨识方法,该方法选取中药材,经提取得到提取物,利用制备液相色谱剔除中药提取物中的主要成分,以中药材功效作为相关评价指标,然后分别对剔除的主要成分和剔除主要成分后的样品进行多指标效应评价,分析得出中药材主要效应成分对中药材功效的贡献度,并对不同效应成分进行主次区分与排序,以达到对中药效应物质基础的定量评价。本发明提供的技术方案,从中药整体作用特点出发,可阐明红花等中药材的效应物质基础,该方法可操作性强,工艺设计合理,为评价红花等中药材的活性物质基础和活性物质作用机理提供科学依据,可为红花等中药材在中药复方配伍中提供重要依据,具有重要的应用价值。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种基于选择性剔除技术的中药效应物质辨识方法,其特征在于,包括以下步骤:选取中药材,经提取得到提取物,然后利用制备液相色谱剔除中药提取物中的主要成分,以中药材功效作为相关评价指标,然后分别对剔除的主要成分和剔除主要成分后的样品进行多指标效应评价,进而比较分析得出中药材各指标的主要效应物质及各成分对中药材功效的贡献度。

    2.  根据权利要求1所述的中药复杂成分配伍相互作用研究方法,其特征在于,所述的主要成分包括黄酮类、三萜类、苯丙素类、蒽醌类、香豆素类、木质素类、有机酸或生物碱类。

    3.  红花中药材复杂成分配伍相互作用研究方法,其特征在于,它包括以下步骤:
    (1)红花提取物的制备
    称取红花药材,用乙醇提取1~3次,每次各60~120min,合并提取液,减压浓缩,得红花提取物;
    (2)剔除成分的样品制备
    称取上述步骤(1)红花提取物适量,用甲醇溶解,13000~15000r/min,离心10~20min,取上层离心液上制备液相系统进样,进样体积为500μL;流动相:A相为水,-B相为甲醇;流速为20mL/min;检测波长270nm;根据不同成分确定不同的洗脱程序,各成分的最佳洗脱程序如下表1所示;依据保留时间分别收集目标成分1~13,10mL/管,同时分别收集剔除目标成分1~13后的样品液,然后减压回收收集管及样品液中溶剂后,分别得到目标成分C1~C13和分别剔除目标成分后的样品部分HH1-HH13;
    表1 各成分最佳梯度洗脱条件


    (3)HPLC分析条件
    取上述步骤(2)剔除目标成分前后样品HH及HH1-HH13和剔除到目标成分C1-C13适量,用甲醇溶解,13000~15000r/min,离心10~20min,,取上清液进HPLC分析,色谱条件为:柱温:30℃,进样体积10μL,流动相为A相0.5%乙酸水-B相甲醇,流速为0.8mL/min,梯度洗脱程序:0min,5%B—10min,10%B—25min,25%B—40min,30%B—55min,45%B—75min,90%B;PAD检测器,波长扫描范围:210-450nm;
    (4)HPLC-Q-TOF-MS分析鉴定条件
    色谱条件与步骤(3)HPLC一致;
    质谱检测条件ESI源,扫描方式:ESI+、ESI-模式,毛细管电压:3.0kV,锥孔电压:40V,萃取电压:2.0V,离子源温度:100℃,脱溶剂气温度:250℃,锥孔气流量:50L·h-1,脱溶剂气流量:600L·h-1,离子能量:1V,每0.2s采集1次图谱;准确质量测定采用亮氨酸-脑啡肽(ESI+:m/z 556.2771,ESI-:m/z 554.2615)溶液为锁定质量溶液,质量扫描范围:100~1500m/z;
    对剔除成分C1~C13分别进行结果鉴定,共鉴定11个成分,分别为胞苷(C1)、腺苷(C2)、羟基红花黄色素A(C3)、6-羟基山柰酚-3,6-二氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷(C4)、6-羟基山柰酚-3,6,7-三氧葡萄糖苷(C5)、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷(C6)、6-羟基山柰酚-3,6-二氧葡萄糖苷(C7)、6-羟基山柰酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷的混合物(C8)、脱水红花黄色素B(C9)、6-羟基山柰酚-3-氧芸香糖苷(C10)和山柰酚-3-氧芸香糖苷(C11)。
    (5)选取抗血小板聚集活性、抗凝血活性、总抗氧化活性和对卵巢颗粒细胞增殖活性作为红花功效到相关评价指标,结合多指标综合指数法,分别考察制备液相分离得到到目标成分C1~C13、分别剔除目标成分后的样品部分HH1-HH13及未剔除目标成分的红花提取物的抗血小板聚集活性、抗凝血活性、总抗氧化活性和对卵巢颗粒细胞增殖活性进行多指标效应评价,进而比较分析得出红花中各主要成分对红花功效的贡献度。

    4.  根据权利要求3所述的红花中药材复杂成分配伍相互作用研究方法,其特征在于,抗血小板聚集活性测定包括凝血酶时间,凝血酶原时间和纤维蛋白原转化时间测定。

    5.  根据权利要求3所述的红花中药材复杂成分配伍相互作用研究方法,其特征在于,红花中药材中活血效应的主要活性成分为羟基红花黄色素A、脱水红花黄色素B、6-羟基山柰酚-3-氧芸香糖苷、6-羟基山柰酚-3,6-二氧葡萄糖苷和6-羟基山柰酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷的混合物。

    6.  根据权利要求3所述的红花中药材复杂成分配伍相互作用研究方法,其特征在于,红花中药材中抗氧化活性的主要活性成分为胞苷、脱水红花黄色素B、6-羟基山柰酚-3-氧芸香糖苷、山柰酚-3-氧芸香糖苷、6-羟基山柰酚-3,6-二氧葡萄糖苷和6-羟基山柰酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷的混合物。

    7.  根据权利要求3所述的红花中药材复杂成分配伍相互作用研究方法,其特征在于,红花中药材中促进卵巢颗粒细胞增殖的主要活性成分为C1、C4、C5、C6、C8和C11。

    说明书

    说明书一种基于选择性剔除技术的中药效应物质辨识方法
    技术领域
    本发明涉及一种中药活性效应物质成分的研究方法,具体涉及一种利用制备液相选择性 剔除技术的中药效应物质辨识方法。
    背景技术
    作为世界上最古老的传统医药之一,中草药已经具有几千年的历史,主要用于慢性病的 治疗,疗效确切,现如今已被广泛地使用于许多发达国家和发展中国家。中药发挥疗效的是 中药所含的复杂物质基础,然而,中药多成分、多靶点的特点为其药效物质的阐明带来了很 大困难,从而限制了中药现代化的进程。
    长期以来,国内中药有效成分研究主要是借鉴国外对天然药物研究的两种基本策略:一 是在系统分离、结构鉴定基础上,结合药效学评价(从整体动物、离体器官、细胞亚细胞和 分子生物学角度),研究得到的单体成分的活性;二是应用一个或多个药理模型对中药分离部 位进行评价,并对活性部位进行系统分离和结构鉴定。多年来这样的研究方法发现了一些中 药中的活性成分,如麻黄、黄连、人参等。但是,国内外学者在研究中也慢慢发现,临床上 对某些疾病很有疗效的中药,在某个动物试验或体外模型上却未能验证出特定的活性成分。 另外,许多中药粗提物随着逐步分离纯化,活性却越来越弱,最后却未能得到有活性的纯化 合物。同时,研究者们越来越多地认可中药中存在着复杂的成分间相互作用??杉?,传统的 中药有效成分研究模式不能全面反映中药多成分、多靶点的特点和相互影响的整体作用。
    近年来,随着现代色谱学、细胞分子生物学、计算机科学等学科的发展以及多种先进科 学技术的联合应用,中药药效物质基础研究思路和方法取得了长足的进展,如基于谱效关系 的中药药效物质研究、基于药代动力学的中药药效物质研究、基于血清药物化学和血清药理 学相结合的中药药效物质研究、基于整合效应关联分析的中药药效物质研究以及基于计算机 虚拟筛选技术的中药药效物质研究。但这些研究方法除存在固有的缺点外,也难以真正地阐 明中药物质基础及其相互作用。
    因此,很有必要在现有技术的基础之上,建立一种基于选择性剔除和活性评价相结合的 普遍适用的在整体水平上辨识中药药效物质的方法。
    发明内容
    发明目的:本发明的目的是为了解决现有技术的不足,提供一种可操作性强,适用范围广泛, 可全面阐明中药活性效应物质基础到基于选择性剔除技术的中药效应物质辨识方法。本发明 采用制备液相色谱技术将目标成分选择性剔除,进而对其进行药效活性评价,根据目标成分 剔除前后活性的变化与否及其变化程度,判定所剔除成分在中药效应表达中的贡献,进而对 该中药中不同效应成分进行主次区分与排序,以达到对中药效应物质基础的定量评价,可充 分阐明中药效应物质基础。
    技术方案:为了实现以上目的,本发明所采取的技术方案为:
    一种基于选择性剔除技术的中药效应物质辨识方法,包括以下步骤:选取中药材,经提取 得到提取物,然后利用制备液相色谱剔除中药提取物中的主要成分,以中药材功效作为相关 评价指标,然后分别对剔除的主要成分和剔除主要成分后的样品进行多指标效应评价,进而 比较分析得出中药材各指标的主要效应物质及各成分对中药材功效的贡献度。
    作为优选方案,以上所述的中药复杂成分配伍相互作用研究方法,所述的主要成分包括 黄酮类、三萜类、苯丙素类、蒽醌类、香豆素类、木质素类、有机酸或生物碱类??梢杂糜?评价和分析各种中药材到活性效应物质。
    红花中药材复杂成分配伍相互作用研究方法,其它包括以下步骤:
    (1)红花提取物的制备
    称取红花药材,用乙醇提取1~3次,每次各60~120min,合并提取液,减压浓缩,得红 花提取物;
    (2)剔除成分的样品制备
    称取上述步骤(1)红花提取物适量,用甲醇溶解,13000~15000r/min,离心10~20min, 取上层离心液上制备液相系统进样,进样体积为500μL;流动相:A相为水,-B相为甲醇; 流速为20mL/min;检测波长270nm;根据不同成分确定不同的洗脱程序,各成分的最佳洗 脱程序如下表1所示;依据保留时间分别收集目标成分1~13,10mL/管,同时分别收集剔除 目标成分1~13后的样品液,然后减压回收收集管及样品液中溶剂后,分别得到目标成分 C1~C13和分别剔除目标成分后的样品部分HH1-HH13;
    表1各成分最佳梯度洗脱条件


    (3)HPLC分析条件
    取上述步骤(2)剔除目标成分前后样品HH及HH1-HH13和剔除到目标成分C1-C13适 量,用甲醇溶解,13000~15000r/min,离心10~20min,,取上清液进HPLC分析,色谱条件 为:柱温:30℃,进样体积10μL,流动相为A相0.5%乙酸水-B相甲醇,流速为0.8mL/min, 梯度洗脱程序:0min,5%B—10min,10%B—25min,25%B—40min,30%B—55min,45%B—75 min,90%B;PAD检测器,波长扫描范围:210-450nm;
    (4)HPLC-Q-TOF-MS分析鉴定条件
    色谱条件与步骤(3)HPLC一致;
    质谱检测条件ESI源,扫描方式:ESI+、ESI-模式,毛细管电压:3.0kV,锥孔电压: 40V,萃取电压:2.0V,离子源温度:100℃,脱溶剂气温度:250℃,锥孔气流量:50L·h-1, 脱溶剂气流量:600L·h-1,离子能量:1V,每0.2s采集1次图谱;准确质量测定采用亮氨酸- 脑啡肽(ESI+:m/z 556.2771,ESI-:m/z 554.2615)溶液为锁定质量溶液,质量扫描范围: 100~1500m/z;
    对剔除成分C1~C13分别进行结果鉴定,共鉴定11个成分,分别为胞苷(C1)、腺苷(C2)、 羟基红花黄色素A(C3)、6-羟基山柰酚-3,6-二氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷(C4)、6-羟基 山柰酚-3,6,7-三氧葡萄糖苷(C5)、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷(C6)、6- 羟基山柰酚-3,6-二氧葡萄糖苷(C7)、6-羟基山柰酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷的混合物(C8)、 脱水红花黄色素B(C9)、6-羟基山柰酚-3-氧芸香糖苷(C10)和山柰酚-3-氧芸香糖苷(C11)。
    (5)选取抗血小板聚集活性、抗凝血活性、总抗氧化活性和对卵巢颗粒细胞增殖活性作 为红花功效到相关评价指标,结合多指标综合指数法,分别考察制备液相分离得到到目标成分 C1~C13、分别剔除目标成分后的样品部分HH1-HH13及未剔除目标成分的红花提取物的抗血 小板聚集活性、抗凝血活性、总抗氧化活性和对卵巢颗粒细胞增殖活性进行多指标效应评价, 进而比较分析得出红花中各主要成分对红花功效的贡献度。
    本发明所述的红花中药材复杂成分配伍相互作用研究方法,抗血小板聚集活性测定包括 凝血酶时间,凝血酶原时间和纤维蛋白原转化时间测定。
    本发明所述的红花中药材复杂成分配伍相互作用研究方法,红花中药材中活血效应的主 要活性成分为羟基红花黄色素A、脱水红花黄色素B、6-羟基山柰酚-3-氧芸香糖苷、6-羟基 山柰酚-3,6-二氧葡萄糖苷和6-羟基山柰酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷的混合物。
    本发明所述的红花中药材复杂成分配伍相互作用研究方法,红花中药材中抗氧化活性的主 要活性成分为胞苷、脱水红花黄色素B、6-羟基山柰酚-3-氧芸香糖苷、山柰酚-3-氧芸香糖苷、 6-羟基山柰酚-3,6-二氧葡萄糖苷和6-羟基山柰酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷的混合物。
    本发明所述的红花中药材复杂成分配伍相互作用研究方法,红花中药材中促进卵巢颗粒 细胞增殖的主要活性成分为C1、C4、C5、C6、C8和C11。
    本发明利用现代制备液相色谱高效的分离性能及收集触发功能,用于进行中药中成分或 化学特征部位的剔除。通过回收剔除成分后溶液,可对剔除前后样品进行多种活性的比较评 价。进而可准确辨识其主要药效物质成分,还可评价各活性成分的贡献度大小。
    有益效果:本发明提供的基于选择性剔除技术的中药效应物质辨识方法和现有技术相比 具有以下优点:
    本发明提供的基于选择性剔除技术的中药效应物质辨识方法,具有可操作性强,应用范 围广泛等优点,本发明采用制备液相色谱技术将目标成分选择性剔除,进而对其进行药效活 性评价,根据目标成分剔除前后活性的变化与否及其变化程度,判定所剔除成分在中药效应 表达中的贡献,进而对该中药中不同效应成分进行主次区分与排序,以达到对中药效应物质 基础的定量评价。本发明提供的技术方案,从中药整体作用特点出发,可阐明中药效应物质 基础的相互作用原理,为阐明中药材活性物质基础具有重要意义。
    本发明根据大量实验筛,尤其筛选出制备液相条件和药理活性实验分析方法,可阐明红 花中药材的效应物质基础,该方法可操作性强,工艺设计合理,为评价红花的活性物质相互 作用原理和作用机理提供科学依据,同时为红花在中药复方配伍中提供重要依据。
    附图说明
    图1为红花中各目标成分到高效液相色谱图。
    图2为红花提取物的正、负总离子流图。
    具体实施方式
    下面结合具体实施例,进一步阐明本发明,应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围,在阅读了本发明之后,本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修 改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。
    实施例1红花中药材复杂成分配伍相互作用研究方法,包括以下步骤:
    1.实验材料
    1.1.药材
    红花为菊科植物红花(Carthamus tinctorius L.)的干燥花,购自于安徽丰原铜陵中药饮片 有限公司。
    1.2.仪器
    旋转蒸发仪(BUCHI labortechnikAG,瑞士);SH2-95A型循环水式多用真空泵(河南巩 义市英峪予华仪器厂);超纯水仪(南京易普易达科技发展有限公司)。Waters 2695-2998PDA, Hypersil ODS2分析色谱柱(4.6*250mm,5μm)。Waters自动纯化系统(2545二元高压梯度 泵,2767自动进样及收集器,泵控制器,2489双波长检测器;FractionlynxTM工作站), XBridgeTM C18OBDTM制备柱(30*150mm,5μm)。BrukerAVance AV500/300型核磁共振仪 (TMS为内标)。
    1.3.药物及试剂
    胞苷(99%,阿拉丁),腺苷(99%,Sigma),羟基红花黄色素A(92.5%,江苏省食品药 品检验所)。超纯水自制,色谱纯甲醇(中国汉邦),其他试剂均为分析纯。
    2.方法与结果
    2.1.样品制备
    称取红花药材400g,精密称定,分别用24倍和20倍量30%乙醇(v/v),80℃下温浸 两次,每次各60min,趁热过滤,60℃以下减压浓缩至约1g生药/mL,此即为红花提取物样 品(HH)。
    2.2.样品制备
    称取上述红花提取物样品适量,10%甲醇溶解,浓度约为300mg/mL,13000r/min,离 心10min,上制备液相系统进样,进样体积为500μL;流动相为水(A)-甲醇(B);流速为 20mL/min;检测波长270nm(各剔除成分在此波长下均有较强吸收);根据不同活性成分确 定不同的洗脱程序,各成分的最佳洗脱程序见表1。依据保留时间分别收集目标成分C1-C13, 10mL/管,同时收集废液。60℃一下减压回收收集管及废液中溶剂后即得到目标成分(C1-C13) 和分别剔除目标成分后的部分(HH1-HH13)。
    表1各成分最佳梯度洗脱条件


    2.3.剔除结果分析与成分鉴定
    2.3.1.HPLC分析条件
    上述剔除前后样品(HH及HH1-HH13)和剔除成分(C1-C13)适量,10%甲醇溶解, 13000r/min,离心10min,取上清作进HPLC分析,柱温:30℃,进样体积10μL,流动相为 0.5乙酸水(A)-甲醇(B),流速为0.8mL/min,梯度洗脱程序:0min(5%B)—10min(10%B)—25 min(25%B)—40min(30%B)—55min(45%B)—75min(90%B)。PAD检测器波长扫描范围: 210-450nm。
    2.3.2.HPLC-Q-TOF-MS分析条件
    色谱条件与2.3.1.HPLC分析条件。
    质谱检测条件:ESI源,扫描方式:ESI+、ESI-模式,毛细管电压:3.0kV,锥孔电压:40V, 萃取电压:2.0V,离子源温度:100℃,脱溶剂气温度:250℃,锥孔气流量:50L·h-1,脱溶 剂气流量:600L·h-1,离子能量:1V,每0.2s采集1次图谱;准确质量测定采用亮氨酸-脑啡 肽(1eucine-enkephalin,ESI+:m/z 556.2771,ESI-:m/z 554.2615)溶液为锁定质量溶液。质 量扫描范围:100~1500m/z。
    3.实验结果
    3.1.制备液相剔除结果分析
    从红花中剔除13个成分(图1),用分析型HPLC检验剔除结果,用全波长扫描分析结 果显示,纯度均达到80%以上,比较分析剔除前后的色谱图,可以看出,13个成分均分别从 红花中被基本剔除。用该方法共获得28个样品,分别是分别剔除十三个成分外的剔除后样品 (HH1-HH13)以及剔除的十三个目标成分(C1-C13),其它均作为后续活性评价用的样品。
    根据紫外图谱将剔除成分分为三类,即黄酮类成分、醌式查尔酮类以及其它类。按照上 述建立的HPLC-Q-TOF-MS条件,对红花提取物进行分析,测得该供试品正、负总离子流图 (图2)。
    基于紫外和质谱数据、对照品对照以及现有研究文献对照,对剔除成分分别进行结果鉴 定,结果共鉴定了11个成分分别为:胞苷(C1)、腺苷(C2)、羟基红花黄色素A(C3)、 6-羟基山柰酚-3,6-二氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷(C4)、6-羟基山柰酚-3,6,7-三氧葡萄糖苷 (C5)、6-羟基芹菜素-6-氧葡萄糖-7-氧葡萄糖醛酸苷(C6)、6-羟基山柰酚-3,6-二氧葡萄糖 苷(C7)、6-羟基山柰酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷的混合物(C8)、脱水红花黄色素B(C9)、 6-羟基山柰酚-3-氧芸香糖苷(C10)和山柰酚-3-氧芸香糖苷(C11)。
    实施例2红花不同成分及剔除前后活性评价
    1.实验材料
    1.1.动物
    新西兰长耳兔,体重2.0-2.5kg,雄性,南京市江宁区青龙山动物养殖场提供,生产许可 证号:SCXK(苏)2012-0008。。
    1.2.仪器
    LG-PABER-I型半自动凝血分析仪(北京世帝科学仪器公司);TDL-80-2B低速离心机(上 海安亭科学仪器厂)MS-205、ML-204、ML303电子天平(Mettler Toledo上海有限公司); Enspire型多功能酶标仪(美国PerkinElmer公司
    1.3.药品和试剂
    二磷酸腺苷(ADP)(北京中勤世帝科学仪器公司,ADP粉剂,ADP缓冲液)、血小板活 化因子(PAF,sigma)。FeSO4·7H2O,水杨酸,过氧化氢(H2O2)购买于无锡市亚盛化工有 限公司;DPPH(1,1-di-phenyl-2-picryhydrazyl)购自于ALDRICH Chemistry,ABTS (2,2’-azinobis-3-ethyl-benzothiazolin-6-sulfonic acid)、三吡啶三嗪(2,4,6-tripyridyl-s-triazine, TPTZ)购自于sigma公司。
    1.4.实验药物样品
    实施例1制备得到的剔除目标成分后到样品(HH1-HH13)以及剔除的十三个目标成分 (C1-C13)和原始红花提取物。
    2.实验方法
    2.1.样品的制备
    精密称取各剔除前后样品适量,精密称定,配成0.7g生药·mL-1和0.5g生药·mL-1的浓 度。前者作为PAF诱导的血小板聚集、TT和PT测定的样品,后者用于测定抗ADP诱导的 血小板聚集活性和APTT。
    精密称取各剔除前后样品适量,精密称定,配成5mg生药·mL-1的浓度,并取适量稀释 成0.156mg生药·mL-1。前者作为DPPH自由基清除率测定和FRAP法测定的样品,后者用于 测定ABTS自由基清除率。
    精密称取各剔除前后样品适量,精密称定,配成4mg生药·mL-1的浓度,作为大鼠卵巢 颗粒细胞增殖实验研究用样品,加样前,用0.22μm灭菌滤膜过滤除菌。
    2.2.体外抗血小板聚集活性研究
    雄性新西兰大耳白兔1只,禁食8h后,3%戊巴比妥钠麻醉(30mg/kg),颈总动脉取血, 3.8%枸橼酸钠(1﹕9)抗凝,800r/min离心10min,取上层富血小板血浆(PRP),剩余部分 轻轻混匀后3000r/min离心10min,取贫血小板血浆(PPP)。各测试杯中加入搅拌珠和受试 药物10μL、PRP 280μL,对照组加入样品溶剂10μL、PRP 280μL,37℃温育3min后,放 入测试通道,加10μL诱导剂(AA、ADP或PAF),测定6min内最大聚集率,随时用PPP 调零,每个样品平行4个,按下述公式计算血小板聚集抑制率:

    2.3.体外凝血功能(TT、PT、APTT)的测定
    抗凝血活性主要是通过凝血酶时间(TT),凝血酶原时间(PT),纤维蛋白原转化时间 (APTT),操作步骤按试剂盒所述操作要求进行,简述如下:
    TT的测定:测试杯中加入搅拌珠、待测药物(对照组加入等量溶剂)10μL、待测血浆 50μL,37℃温育3min后,加入50μL pH7.4 Tris-HCL缓冲液稀释的10U·mL-1凝血酶溶液, 测定凝血时间,并按以下公式计算凝血时间延长率:

    PT的测定:测试杯中加入搅拌珠、待测药物(对照组加入等量溶剂)10μL和待测血浆 50μL,37℃温育5min后,加入100μL PT试剂后测定凝血时间PT,计算公式与TT一致;
    APTT的测定:测试杯中加入搅拌珠、待测药物(对照组加入等量溶剂)10μL、待测血 浆50μL和APTT试剂50μL,37℃温育3min后,加入已37℃预温的20mM CaCl2溶液100 μL后测定凝血时间APTT,计算公式与TT一致。
    2.4.总抗氧化活性研究
    DPPH清除率的测定:分别用移液枪移取上述供试品溶液0.1mL于96孔板中,每列8个复 孔加入同一个样品,5个复孔加入0.1mL DPPH溶液,3个复孔加入0.1mL无水乙醇扣除药物本 底颜色对实验的影响,待各溶液加入完毕,避光反应30min后在517nm波长下用酶联免疫检 测仪测定其吸光度,溶剂空白加DPPH后的吸光度为A0,溶剂空白加无水乙醇后的吸光度为 A0',供试品加DPPH后的吸光度为A1,供试品加无水乙醇后的吸光度为A1',按下述公式计算 各供试品对DPPH自由基的清除能力[7-10]。组间比较采用t检验,以P<0.05为具有统计学意义。

    ABTS清除率的测定:用去离子水将ABTS和K2S2O8(过二硫酸钾)分别溶解并混合,使 其终浓度分别为7mmol·L-1和2mmol·L-1,在室温、避光条件下静置12~16h,得到ABTS储液。 测定时用PBS(pH7.4)稀释到734nm处吸光度为0.7±0.02,-20℃保存备用。反应在96孔板中 进行,200μL反应液中含有100μL不同浓度的样品或参比溶液、100μL的ABTS反应溶液(每 列8个复孔加入同一个样品,5个复孔加入ABTS溶液,3个复孔加入去离子水扣除药物本底颜 色对实验的影响)。振荡摇匀,于室温下避光静置6min,测定溶液在734nm处的吸光值。A0为溶剂与ABTS反应溶液作用后的吸光度,A0'为溶剂加去离子水后的吸光度,A1为受试物与 ABTS反应液作用后的吸光度;A1'为受试物中未加ABTS反应溶液时的吸光度。计算ABTS自 由基清除率计算公式与DPPH一致。
    FRAP法测定:用去离子水分别配置2mM的FeCl3和TPTZ(三吡啶三哑嗪)溶液,于实验 前将两者按1:1体积比混合,混合液加入96孔板中,每孔100μL,然后加入不同浓度受试物, 每孔100μL,振荡均匀,在室温下静置30min,于593nm处测吸光度,OD值越高,表明还原 Fe3+的能力越强。样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需的FeSO4的物质的量(mmol)表示, 其标准方程[16]为y=14.65x-0.0081,R2=0.992。
    2.5.统计学处理
    实验数据以表示,组间比较采用t检验,以P<0.05为具有统计学意义。
    首先将各组样品的所有活血指标导入MassLynx v4.1(Waters公司)软件的EZ info中, 采用软件中的偏最小二乘法(partial least squares method,PLS)分析得到各个指标的变量重要 性投影值(variable importance in the projection,VIP)即VIP值,依据VIP值的大小判断各个 指标对活血化瘀效应的重要程度,一般VIP>1的指标认为其对评价活血化瘀效应有重要贡献 [4],然后将各个指标赋予权重系数。随后,对各指标数据进行标化,当剔除样品相应指标数 值与剔除前样品相比升高时,V标化=(V剔除-V原)/V原,V剔除与V原分别是剔除溶液与原溶液。 最后依据多指标综合指数法,对血小板聚集、PT、TT、APTT以及抗氧化相关的多个指标进 行单一化处理,计算得到各剔除样品的总活血效应贡献值。
    3.实验结果
    3.1.对血小板聚集的影响
    血小板在动脉粥样血栓形成的各个阶段都扮演着重要角色。血小板黏附、聚集、释放反 应可导致血栓形成。因此抑制血小板聚集在治疗心血管疾病中发挥着极其重要的作用。血小 板表面受体种类繁多,如GPIIb/IIIa受体(纤维蛋白原受体)、ADP受体、胶原受体、血栓素 A2(thromboxaneA2,TXA2)受体、血小板活化因子受体等。
    3.1.1.PAF诱导的血小板聚集活性主要效应物质研究
    PAF是迄今发现的最强的血小板聚集诱导剂,是TXA2的200倍,ADP的500倍。PAF可 引起储存池中Ca2+释放和血小板细胞骨架重组,使血小板活化,导致血管收缩,通透性增高, 微循环障碍及炎性反应;PAF还可促进AA代谢产生TXA2,促进颗粒释放ADP(adenosine  diphosphate)、5-羟色胺(5-Hydroxytryptamine,5-HT)等,从而进一步增强炎性反应和血小 板聚集。
    对剔除某成分前后溶液PAF诱导的血小板聚集活性比较结果显示(表2),当剔除成分3、 8、9、10、12、13后,剔除溶液的抗PAF诱导的血小板聚集活性显著降低。结果表明,成分 3、8、9、10、12、13是红花抗PAF诱导的血小板聚集活性主要物质基础。
    表2红花成分剔除前后对PAF诱导的血小板聚集的影响(n=4)


    注:与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;与剔除前溶液比较,△P<0.05,△△P< 0.01,△△△P<0.001,阳性对照为银杏内酯B(浓度5μg/ml)。样品浓度0.7g生药/ml,单体成 分的浓度均与红花原溶液中该成分的浓度一致。
    对红花中抗PAF诱导的血小板聚集主要活性成分贡献度比较结果显示, 8>13>9>12>3>10。对单体成分该活性比较显示,成分3、8、9、10、11、13能抑制PAF诱导 的血小板聚集作用,作用大小比较:13>3>8>10>11>9。结果发现,成分3、8、9、10、13单 体与在中药中作用一致,但其作用大小不完全一致,如成分9作用相对较弱,但在中药中作 用则相对较强,此外,成分3单体作用较强,但其在中药中的作用贡献则相对较弱。而成分 11、12与中药中该成分所体现出的活性却不一致,成分11本身有一定抗血小板聚集活性, 而剔除后对红花提取物抗血小板聚集活性却无显著影响,成分12则与之相反。
    3.1.2.ADP诱导的血小板聚集活性主要效应物质研究
    ADP是人们发现最早也是体内最重要的诱导血小板聚集的物质,其在止血块和病理性动 脉血栓形成中起到关键的作用。ADP对血小板的作用主要是通过与血小板膜ADP受体结合 后导致血小板形态变化或使cAMP水平降低而聚集,且ADP可以增强或放大其他血小板激动 剂的作用,故ADP在血小板功能中发挥关键作用。
    对剔除某成分前后溶液ADP诱导的血小板聚集活性比较结果显示(表3),当剔除成分5、 6、8、10、12、13后,提取物抗血小板聚集活性均显著降低。结果表明,成分5、6、8、10、 12、13是红花抗ADP诱导的血小板聚集活性主要物质基础。
    表3红花成分剔除前后溶液对ADP诱导的血小板聚集的影响(n=4)


    注:与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;与剔除前溶液比较,△P<0.05,△△P< 0.01,△△△P<0.001,样品浓度0.5g生药/ml,单体成分的浓度均与红花原溶液中该成分的浓度 一致。
    对红花中抗ADP诱导的血小板聚集主要活性成分贡献度比较结果显示, 13>8>10>12>6>5。对单体成分该活性比较显示,成分2、8、10能抑制ADP诱导的血小板聚 集作用,作用大小比较:2>8>10,成分4、11能促进ADP诱导的血小板聚集,作用大小比较: 4>11。结果发现,除成分8和10单体与中药中作用一致外,其他几个活性成分在单体活性下 均未显现活性。单体成分2虽然具有较强的抑制血小板聚集活性,但剔除前后对该活性的影 响不大,说明成分2并不是红花抑制血小板聚集活性的物质基础。而单体成分4和11则具有 促进血小板聚集活性,但剔除后对该活性无显著影响,可能与成分间相互作用有关。
    3.2.体外凝血功能
    在凝血功能测定指标中,PT反映血浆中凝血因子I、II、V、VII、X水平的实验,是外 源性凝血系统的主要筛选指标;APTT反映血浆中凝血因子VIII、IX、XI水平的实验,是内 源性凝血系统的主要筛选指标;TT观察凝血因子血中抗凝物增多与否。通过比较原溶液与剔 除某特定成分溶液的凝血相关指标,意图从一定程度上为活血相关效应物质的研究提供一定 依据。结果显示(表4),成分3、4、6、9、10、11被剔除后,红花提取物对PT延长作用明 显降低,说明成分2、7、8、9、11、12是红花中影响外源性凝血系统中相关凝血因子的主要 物质基??;成分3、9、10被剔除后,红花提取物对APTT延长作用明显降低,说明成分3、 9、10是红花中影响内源性凝血系统中相关凝血因子的主要物质基??;成分1、3、4、6、10、 11被剔除后,红花提取物对TT延长作用明显降低,说明成分1、3、4、6、10、11是红花中 影响凝血系统纤维蛋白原转化的主要物质基础。
    表4红花成分剔除前后对TT、PT和APTT的影响(n=4)


    注:与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;与剔除前溶液比较,△P<0.05,△△P< 0.01,△△△P<0.001;PT、TT:0.7g生药/ml;APTT:0.5g生药/ml,单体成分的浓度均与红花 原溶液中该成分的浓度一致。
    对红花中延长PT主要活性成分贡献度比较结果显示,3>10>11>6>4>9,但各成分本身对 该活性均无显著活性。红花中延长APTT主要活性成分贡献度比较结果显示,10>9>3,其中 成分9与空白组比较无显著性差异,剔除混合物10与空白组比显现出来一定的抑制APTT延 长作用;各成分本身活性研究结果显示,成分3、7、9、10、12、13能显著延长APTT,作 用大小比较:9>13>12>10>3>7,其中成分3、9、10对APTT的作用与中药中该成分的作用 一致,但成分作用大小与成分本身不一致,主要是混合物10本身延长APTT作用远不及成分 9的作用,但剔除后剔除溶液活性却显著降低,而其他对APTT有活性的成分在红花中并未 显现相应活性。此外,成分13本身有较强的延长APTT的作用,但剔除后其延长作用反而更 强,进一步显示了中药各成分相互作用的复杂性。对红花中延长TT主要活性成分贡献度比 较结果显示,10>11>3>4>6>1,但各成分本身对该活性也均无显著活性。
    3.3.总抗氧化活性
    红花是活血化瘀的传统中药,是治疗心脑血管疾病方剂的主要配方药物,具有抗血小板 聚集、抗凝血等多种相关药理活性,许多文献报道红花也具有明显的抗氧化活性,降低细胞 氧化损伤,其抗氧化作用也与治疗心肌缺血、脑缺血等心脑血管疾病密切相关。
    对不同抗氧化活性评价结果显示(表5),红花中成分1、3、4、5、8-13被剔除后DPPH 自由基清除率显著降低,说明这些成分是红花清除DPPH自由基的主要活性成分;红花中成 分1、3、5、8、9、10被剔除后ABTS自由基清除率显著降低,说明这些成分是红花清除ABTS 自由基的主要活性成分;红花中各主要成分被剔除后,其对Fe3+的还原能力均有显著降低, 说明这些主要成分对红花Fe3+的还原能力方面均有一定作用。
    表5红花成分剔除前后对抗氧化活性的影响(n=5)


    注:与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;与剔除前溶液比较,△P<0.05,△△P<0.01, △△△P<0.001;药物浓度DPPH法和FRAP法:5mg生药/mL,ABTS法:0.156mg生药/mL,单体成 分的浓度均与红花原溶液中该成分的浓度一致。
    根据实验结果,对几种主要活性成分在红花DPPH自由基清除活性中贡献度进行比较结 果,4>1>8>10>12>11>5>9>3>13,成分1-11均有显著的DPPH自由基清除活性,作用大小比 较:3>9>1>10>6>7>8>4>11>2>5,成分12和混合物13对该活性无显著影响。结果发现,成 分12和混合物13本身无显著作用,但在中药中却有显著贡献,而成分2、6、7本身有一定 活性,但在中药中无显著贡献。此外部分成分本身的活性大小与这些成分在中药中的贡献度 也不完全一致,主要差异性物质为成分3和9与混合物4和8,其中成分3、9本身活性很显 著,但在中药中的贡献却相对较弱,而混合物4和8本身活性相对较弱,但在该活性中却有 较强的贡献。
    对几种主要活性成分在红花ABTS自由基清除活性中贡献度进行比较结果显示, 5>3>9>10>8>1,但各剔除成分在相应浓度下对ABTS自由基清除也无显著活性。结果发现, 成分1、3、5、8、9、10本身无显著作用,但在中药中却有显著贡献。
    对几种主要活性成分在红花Fe3+还原能力中贡献度进行比较,结果显示, 10>8>9>12>11>7>6>1>13>4>3>2>5,成分1-11均有显著的还原Fe3+的能力,作用大小比较: 3>9>10>1>6>7>5>2>8>4>11,成分12和混合物13对该活性无显著影响。结果发现,成分12 和混合物13本身无显著作用,但在中药中贡献却无统计学意义。此外部分成分本身的活性大 小与这些成分在中药中的贡献度也不完全一致,主要差异性物质为成分3、5、11与混合物8, 其中成分3、5尤其是成分3本身活性相对很强,但在中药中的贡献却相对较弱,而成分11 和混合物8本身活性相对较弱,但在该活性中却有较强的贡献。
    3.4.对大鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响
    卵巢颗粒细胞是哺乳动物卵巢内重要的生殖细胞,是卵巢性激素分泌的主要场所,是机 体内性激素的重要产生来源。在原始卵泡中,颗粒细胞仅为单层,随着卵泡的发育不断增殖, 并逐渐形成卵丘包围卵母细胞??帕O赴氖考胺置诖萍に睾驮屑に氐墓δ芏杂诼雅莘⒂?及成熟有着重要的作用。本章第二节结果显示红花有一定促进卵巢颗粒细胞的影响,可能是 红花通经功效的机制之一。
    对剔除某成分前后溶液对大鼠卵巢颗粒细胞增殖作用的比较结果显示,当剔除成分1、2、 4、6-13后,剔除溶液对大鼠卵巢颗粒细胞的增殖作用显著降低。结果表明,成分1、2、4、 6-13是红花促进卵巢颗粒细胞增殖的主要物质基础。
    对红花中促进卵巢颗粒细胞增殖主要活性成分贡献度比较结果显示(表6), 7>6>4>11>1>8>10>9>12>13>2。对单体成分该活性比较显示,成分1、4、5、6、8、11对卵 巢颗粒细胞增殖有促进作用,作用大小比较:11>1≈6>4>8>5。结果发现,成分1、4、6、8、 11单体与在中药中作用一致,但其作用大小不完全一致,如成分2、7、9、10、12、13无促 进卵巢颗粒细胞增殖作用,但在中药中作用却表现出一定的贡献。而成分5单体对有一定促 进细胞增殖的作用,但该成分在中药中却没有贡献。
    表6红花成分剔除前后样品对大鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响(n=5)

    注:与空白对照组比较,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;与剔除前溶液比较,△P<0.05, △△P<0.01,△△△P<0.001;单体成分的浓度均与红花原溶液中该成分的浓度一致
    本发明通过大量实验筛选研究,采用基于制备液相色谱的选择性剔除技术与多效应指标评 价相结合的方法,提供一种新颖而有效的研究中药效应物质的方法,通过本发明提供的方法, 可阐明不同成分对红花不同效应表达直接或间接的贡献以及贡献度。结果基本确定红花活血 效应的主要活性成分为羟基红花黄色素A、脱水红花黄色素B、6-羟基山柰酚-3-氧芸香糖苷、 6-羟基山柰酚-3,6-二氧葡萄糖苷和6-羟基山柰酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄糖苷的混合物;抗氧化 主要效应物质为胞苷、6-羟基山柰酚-3,6-二氧葡萄糖苷和6-羟基山柰酚-3-氧芸香糖-6-氧葡萄 糖苷的混合物、脱水红花黄色素B、6-羟基山柰酚-3-氧芸香糖苷、山柰酚-3-氧芸香糖苷以及 两个未知物。
    本发明提供的方法,从中药整体作用特点出发,体现中药效应物质的复杂性特点,能广泛 运用于中药中多种类型有效成分的研究,重要的是能将起辅助作用的中药成分(该成分单体 活性检测不显示活性,但对中药的整体作用有贡献)得到有效辨识。同时应用该研究技术既 可以对中药有效成分进行辨识,更可以作为一个很好的验证技术对辨识的有效成分进行反向 验证,对阐明中药活性物质基础具有重要的应用价值。
    以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在 不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明 的?;し段?。

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    一种 基于 选择性 剔除 技术 中药 效应 物质 辨识 方法
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