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    重庆时时彩任选一: 一种免疫磁珠阴性富集法及应用.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201510092126.0

    申请日:

    2015.03.02

    公开号:

    CN104698169A

    公开日:

    2015.06.10

    当前法律状态:

    驳回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):G01N 33/574申请公布日:20150610|||实质审查的生效 IPC(主分类):G01N 33/574申请日:20150302|||公开
    IPC分类号: G01N33/574 主分类号: G01N33/574
    申请人: 徐兴祥
    发明人: 徐兴祥; 扬俊俊; 林平; 代小勤; 闵林峰; 苄家蓉; 陈勇; 邹晶; 凡国华
    地址: 225000江苏省扬州市苏北人民医院南通西路98号
    优先权:
    专利代理机构: 代理人:
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201510092126.0

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2017.12.26|||2015.11.04|||2015.06.10

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的驳回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明提供了一种免疫磁珠阴性富集法及应用,通过将预处理后的胸腹水标本中获取分离介质,配平,离心去掉沉积红细胞,将上层液体与磁珠发生吸附反应,离心后将沉积磁珠上的所有液体用hCTC缓冲液配平后,置于磁力架上吸附磁珠,离心后收集上层液体用hCTC缓冲液配平,离心去上清,对细胞进行计数、稀释、涂片、干燥后,再进行FISH检测。本发明联合FISH检测提高肿瘤细胞富集的敏感性及特异性,用于良恶性胸腹水的鉴别诊断,实体瘤的动态基因检测,实现个体化治疗。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种免疫磁珠阴性富集法,其特征在于,包括以下步骤:
    (1)将预处理后的10ml胸水标本和10ml腹水标本加入离心管A中,竖直 摇匀细胞后,配平,室温600g离心3分钟,弃上清至3ml,再加入2ml 1×hCTC 缓冲液,摇匀细胞;
    (2)将3ml hCTC非血源性细胞分离介质加入到离心管B,再将离心管A 中的细胞液转移到离心管B中分离介质顶层,将离心管B用hCTC缓冲液配平 后,在室温400g离心5分钟;将离心管B中底层沉积红细胞上的所有液体分别 转移至离心管C中;
    (3)在摇动状态下,按每管80μl的比例将洗涤后的磁珠缓慢加入离心管C 中,再将离心管以35~40°倾斜固定于摇床上,室温120rpm摇动10分钟;
    (4)将3ml hCTC非血源性细胞分离介质加入离心管D中,再将离心管C 中的磁珠悬液加到离心管D中分离介质顶层,将离心管D用hCTC缓冲液配平 后,在室温400g离心5分钟;将离心管D中底层沉积磁珠上的所有液体转移至 离心管E中;
    (5)将14ml 1×hCTC缓冲液加入离心管E中,使用1×hCTC缓冲液配 平后,头尾颠倒混匀,室温950g离心3分钟;弃上清至300μl,加入1.4ml 1 ×hCTC缓冲液,混匀,将液体转移至离心管F中;
    (6)将离心管F置于磁力架上吸附磁珠,两分钟后轻轻吹打、旋转液体, 三分钟后将离心管F内的液体转移至离心管G中;
    (7)将14ml 1×hCTC缓冲液加入到离心管G中,将离心管G中液体吹打 三次,再用1×hCTC缓冲液配平后,头尾颠倒混匀,室温950g离心3分钟, 弃上清;
    (8)将离心管G中的细胞进行计数、稀释后,加入100μl Cytelligen固定 液混匀,将离心管G中液体涂片、干燥后进行检测。

    2.  如权利要求1所述的免疫磁珠阴性富集法,其特征在于,在步骤(1) 中,所述预处理为:将采集的10ml胸水标本和10ml腹水标本分别与1ml细胞 保存液混合摇匀,4℃避光保存,且标本待用时间不超过24小时。

    3.  如权利要求2所述的免疫磁珠阴性富集法,其特征在于,在步骤(2) 中,所述将离心管A中的细胞液转移到离心管B中分离介质顶层具体为:将管 A中的细胞液沿管壁液面处位置缓慢加到离心管B中分离介质顶层。

    4.  如权利要求3所述的免疫磁珠阴性富集法,其特征在于,在步骤(6) 中,所述轻轻吹打、旋转液体具体为:用1ml枪头沿磁珠对侧管壁轻轻吹打液 体1~2次,并旋转离心管15°。

    5.  如权利要求4所述的免疫磁珠阴性富集法,其特征在于,在步骤(8) 中,所述计数、稀释具体为:
    将100μl细胞液混匀后,取4μl细胞液于4μl 2%冰醋酸中,混匀,将以上 8μl液体于血细胞计数板上观察四个大方格中的细胞总数;
    当四个大方格中的细胞数多于100个时,按比例将细胞液稀释至四个大方 格中的细胞总数为100个以内。

    6.  如权利要求5所述的免疫磁珠阴性富集法,其特征在于,在步骤(8) 中,所述干燥具体为:将标本放置30~32℃干燥箱过夜,干燥箱全程不开鼓风, 打开顶置通风口,第二天关闭干燥箱温度后将标本继续静置于干燥箱中30分钟 凉至室温,立即进行后续检测。

    7.  如权利要求6所述的免疫磁珠阴性富集法,其特征在于,在步骤(8) 中,所述检测包括FISH检测。

    8.  如权利要求1~7任一项所述的免疫磁珠阴性富集法,其特征在于,所述 离心管A~G的规格分别为50ml、50ml、50ml、50ml、15ml、2ml、15ml。

    9.  权利要求1~8任一项所述的免疫磁珠阴性富集法在肺癌诊疗中的应用。

    10.  如权利要求9所述的免疫磁珠阴性富集法在肺癌诊疗中的应用,其特 征在于,所述应用具体包括:
    (1)对捕获合并恶性胸腔积液的NSCLC患者治疗前、治疗中、治疗后的 胸水肿瘤细胞进行肿瘤细胞计数;
    (2)对捕获的肿瘤细胞采用免疫荧光及流式细胞术检测细胞表面CD133、 CK表达、倍体分析、端粒酶活性检测、肿瘤细胞侵袭及转移能力;
    (3)收集入组NSCLC患者临床资料,将肿瘤细胞计数、CD133、CK表达、 倍体分析、端粒酶活性、肿瘤细胞侵袭、转移能力与肺癌患者耐药、疗效及预 后分析。

    说明书

    说明书一种免疫磁珠阴性富集法及应用
    技术领域
    本发明属于癌症诊断技术领域,尤其涉及一种免疫磁珠阴性富集法及应用。
    背景技术
    肺癌是目前发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,据WHO统计,每年全 世界估计有130万人死于肺癌,其中85%为非小细胞肺癌。肺癌患者的平均生 存期约10个月,其5年生存率不足15%。尽管近年来肿瘤分子生物学研究的 进展及新的化疗药物的应用为肺癌的诊断和治疗带来了新的希望,但大部分肺 癌患者的生存率并无明显改善。肺癌的转移、复发及对化疗药物的耐药仍是目 前面临的难题。胸腔积液是肺癌的常见症状之一,也是许多患者的首发表现, 但是胸腔积液亦常见于其他非肿瘤性疾病,如结核、肺炎及心功能不全等。
    目前胸腔积液肿瘤细胞富集方法常用的梯度密度离心法,但敏感性较低, 约为42~67%,容易漏诊。目前最新的免疫磁珠技术主要用于细胞的分离和纯 化,包括免疫磁珠阳性捕获法和阴性富集法,常用于外周血循环中肿瘤细胞 (circulating tumor cels,CTC)的富集。但免疫磁珠阳性法富集检测肿瘤细胞 需要特异性的肿瘤细胞抗体,不仅成本较高,对于部分不表达特异性抗体或抗 原抗体难以结合的肿瘤细胞容易漏诊,造成假阴性;并且经抗体抗原反应后, 肿瘤细胞的生物学特性会受到一定影响,从而影响其后续生物学特性分析的准 确性。
    因此迫切需要一种敏感性和特异性俱佳的实验技术来协助恶性胸腔积液 的诊断。
    发明内容
    本发明的目的在于提供一种免疫磁珠阴性富集法及应用,旨在解决现有肺 癌诊断技术敏感性和特异性欠佳的问题。
    本发明是这样实现的,一种免疫磁珠阴性富集法,包括以下步骤:
    (1)将预处理后的10ml胸水标本和10ml腹水标本加入离心管A中,竖 直摇匀细胞后,配平,室温600g离心3分钟,弃上清至3ml,再加入2ml 1 ×hCTC缓冲液,摇匀细胞;
    (2)将3ml hCTC非血源性细胞分离介质加入到离心管B,再将离心管A 中的细胞液转移到离心管B中分离介质顶层,将离心管B用hCTC缓冲液配平 后,在室温400g离心5分钟;将离心管B中底层沉积红细胞上的所有液体分 别转移至离心管C中;
    (3)在摇动状态下,按每管80μl的比例将洗涤后的磁珠缓慢加入离心管 C中,再将离心管以35~40°倾斜固定于摇床上,室温120rpm摇动10分钟;
    (4)将3ml hCTC非血源性细胞分离介质加入离心管D中,再将离心管C 中的磁珠悬液加到离心管D中分离介质顶层,将离心管D用hCTC缓冲液配平 后,在室温400g离心5分钟;将离心管D中底层沉积磁珠上的所有液体转移 至离心管E中;
    (5)将14ml 1×hCTC缓冲液加入离心管E中,使用1×hCTC缓冲液配 平后,头尾颠倒混匀,室温950g离心3分钟;弃上清至300μl,加入1.4ml 1 ×hCTC缓冲液,混匀,将液体转移至离心管F中;
    (6)将离心管F置于磁力架上吸附磁珠,两分钟后轻轻吹打、旋转液体, 三分钟后将离心管F内的液体转移至离心管G中;
    (7)将14ml 1×hCTC缓冲液加入到离心管G中,将离心管G中液体吹 打三次,再用1×hCTC缓冲液配平后,头尾颠倒混匀,室温950g离心3分钟, 弃上清;
    (8)将离心管G中的细胞进行计数、稀释后,加入100μl Cytelligen固定 液混匀,将离心管G中液体涂片、干燥后进行检测。
    优选地,在步骤(1)中,所述预处理为:将采集的10ml胸水标本和10ml 腹水标本分别与1ml细胞保存液混合摇匀,4℃避光保存,且标本待用时间不 超过24小时。
    优选地,在步骤(2)中,所述将离心管A中的细胞液转移到离心管B中 分离介质顶层具体为:将管A中的细胞液沿管壁液面处位置缓慢加到离心管B 中分离介质顶层。
    优选地,在步骤(6)中,所述轻轻吹打、旋转液体具体为:用1ml枪头 沿磁珠对侧管壁轻轻吹打液体1~2次,并旋转离心管15°。
    优选地,在步骤(8)中,所述计数、稀释具体为:
    将100μl细胞液混匀后,取4μl细胞液于4μl 2%冰醋酸中,混匀,将以 上8μl液体于血细胞计数板上观察四个大方格中的细胞总数;
    当四个大方格中的细胞数多于100个时,按比例将细胞液稀释至四个大方 格中的细胞总数为100个以内。
    优选地,在步骤(8)中,所述干燥具体为:将标本放置30~32℃干燥箱 过夜,干燥箱全程不开鼓风,打开顶置通风口,第二天关闭干燥箱温度后将标 本继续静置于干燥箱中30分钟凉至室温,立即进行后续检测。
    优选地,在步骤(8)中,所述检测包括FISH检测。
    有优选地,所述离心管A~G的规格分别为50ml、50ml、50ml、50ml、15ml、 2ml、15ml。
    本发明进一步提供了上述免疫磁珠阴性富集法在肺癌诊疗中的应用。
    优选地,所述应用具体包括:
    (1)对捕获合并恶性胸腔积液的NSCLC患者治疗前、治疗中、治疗后的 胸水肿瘤细胞进行肿瘤细胞计数;
    (2)对捕获的肿瘤细胞采用免疫荧光及流式细胞术检测细胞表面CDl33、 CK表达、倍体分析、端粒酶活性检测、肿瘤细胞侵袭及转移能力;
    (3)收集入组NSCLC患者临床资料,将肿瘤细胞计数、CDl33、CK表 达、倍体分析、端粒酶活性、肿瘤细胞侵袭、转移能力与肺癌患者耐药、疗效 及预后分析。
    免疫磁珠阴性富集法起初用于外周血循环中肿瘤细胞的富集及检测,其敏 感性及特异性均较高,原理是通过免疫磁珠技术去除无关细胞而使目标细胞得 以纯化,从而提高外周血循环中肿瘤细胞的检测率;并且阴性法富集后的肿瘤 细胞纯度较高,且没有被抗体触及而处于自然状态,从而可进行一系列后续分 析测定。本发明克服现有技术的不足,首次将免疫磁珠阴性富集法用于恶性胸 腔积液中肿瘤细胞的富集,提高了肿瘤细胞检出的敏感性,与此同时,与外周 血阴性富集法不同之处在于,由于正常外周血中不存在上皮来源的细胞,故上 皮来源的肿瘤细胞分离及鉴定较为容易,而胸腔积液中因有大量的上皮和间皮 细胞,大大影响了上皮来源肿瘤细胞的检出及鉴定,本发明免疫磁珠阴性富集 法对此做了很大的改进,并联合FISH检测成功解决了上述难题,为肺癌诊疗 提供极大帮助。本发明去除了胸腔积液中白细胞对肿瘤细胞端粒酶活性检测的 影响,提高了胸腔积液中端粒酶活性对肺癌诊疗的敏感性、特异性及应用价值。
    附图说明
    图1是本发明实施例中恶性胸腔积液肿瘤细胞瑞姬染色涂片;其中,图①, ②为密度梯度离心法富集后瑞姬染色细胞涂片(其中杂细胞较多,肿瘤细胞易 聚集成团);图③,④为免疫磁珠阴性富集法富集后瑞姬染色细胞涂片);
    图2是本发明实施例中恶性胸腔积液肿瘤细胞免疫磁珠阴性富集后7、8 号染色体着丝粒FISH分析图;其中,图①、②、③为二倍体细胞,图④、⑤、 ⑥为超二倍体细胞;
    图3是本发明实施例中经免疫磁珠阴性富集法捕获的恶性胸腔积液肿瘤细 胞(WBC)和CD133细胞(CSC)。
    具体实施方式
    为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实 施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅 仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
    实施例1实验材料、器材准备与说明
    (1)调节离心机的加减速时间,本发明步骤中所有离心加减速时间均一样。 符合实验要求的加减速时间为:设置离心机的离心力450g,从转速0升至450g 的时间应为40秒,从450g降到0的时间最短应为200秒。
    (2)测试水平转子低速离心机是否满足本实验要求,测试方法:取1ml  hCTC分离介质至15ml离心管中,将0.5ml外周血与1.5ml 1x hCTC缓冲液混 匀后加到1ml hCTC非血源性细胞分离介质顶层,室温离心5分钟(550g), 离心后可见液体明显分层,上层为透明液体,下层为棕红色沉积红细胞。如离 心后分层效果差,即该离心机不能满足本实验要求。
    (3)每隔一周使用温度计测试干燥箱内干片温度30℃,如干燥箱内实测 温度与设定的30℃不相符,按照仪器使用说明校准温度至所需30℃。
    (4)为避免上皮细胞污染,实验全程必须穿戴白大衣、帽子、口罩及手套。
    (5)配制1×hCTC缓冲液:将10×浓缩hCTC缓冲液于37℃水浴溶解可 能出现的结晶,混匀,将全部10×浓缩hCTC缓冲液精确定量,用纯化水稀释 10倍至1×hCTC缓冲液,4℃保存。每次分装使用。
    (6)实验前,分装适量1×hCTC缓冲液(25ml 1×hCTC缓冲液/人份)、 适量hCTC分离介质(6ml/人份)于恒温水浴锅中预热至27℃。每次实验后的 多余试剂于4℃单独保存以供下次实验使用。
    (7)洗涤Cytelligen免疫磁珠:充分混匀Cytelligen免疫磁珠后(使用200μ1 枪头吸取或吹打磁微粒时,均需平剪去200μl枪头前端)。吸取适量Cytelligen 免疫磁珠(80μl/人份)混悬液至2ml离心管中,加入1ml 1×hCTC缓冲液,轻 柔吹打混匀,置于磁力架上1分钟,弃上清(如一次吸取磁珠体积超过200μl, 先靠磁力架,吸弃上清后使用1ml 1×hCTC缓冲液洗涤)。取下离心管,使用 1×hCTC缓冲液重悬磁珠至原体积(80μl/人份),室温保存在离心管架上。将 原磁珠管放回冰箱4℃保存。
    (8)每步离心前均需配平,如标本为双管,使用1×hCTC缓冲液互相配 平;如标本为单管,与相应配平管中的水配平。
    实施例2胸腹肿瘤细胞富集
    (1)于15ml离心管中加入1ml细胞保存液,采集10ml病人胸水/腹水加 入管中,并立即头尾颠倒,轻柔摇匀细胞。采集的胸水、腹水标本应立即处理, 4℃避光保存不超过24小时。
    将15ml离心管中胸、腹水混匀后,倒入50ml离心管A中,竖直摇匀细胞 后,配平,室温离心3分钟(600g)。弃上清至3ml,将离心管竖直沿顺时针 方向轻柔快速晃动以混匀沉淀细胞(注意勿使用加样器头吹打沉淀细胞,摇匀 细胞时不要使过多液体沾至管壁,一般不宜超过25ml刻度)。于管A中加入 2ml 1×hCTC缓冲液,摇匀细胞。
    (2)于50ml离心管B中加入3ml hCTC非血源性细胞分离介质,将离心 管管A中的细胞液沿管壁液面处位置缓慢加到分离介质顶层(切忌将血细胞加 入到分离介质中。叠加后可见清晰的分界面,少量红细胞慢慢沉降至管底)。 使用1ml 1×hCTC缓冲液清洗离心管A,并将清洗液转移至离心管B的溶液顶 层。使用1×hCTC缓冲液沿管壁缓慢加入配平后,室温400g离心5分钟。
    离心后可见三层液体,上层为淡黄色液体(Layerl),中间层为透明液体 (Layer2),底层为棕红色沉积红细胞(Layer3)。非血性胸腹水和血性胸腹 水棕红色沉淀量会有所差异。
    将离心管B中底层沉积红细胞上的所有液体分别转移至50ml离心管C中 (使用1ml加样器先从上层和中间层的液面交界处吸取液体)。上清剩2ml时 使用枪头从液面处吸取上清,切勿吸取到底层红细胞),竖直摇匀液体。
    (3)按每管80μl的比例将洗涤后的磁珠缓慢加入离心管C中,边加边摇 动离心管。将离心管C按35~40°角倾斜固定于摇床上,室温摇动10分钟, 120rpm。
    (4)于50ml离心管D中分别加入3ml hCTC分离介质,将离心管C中的 磁珠悬液分别沿管壁液面处位置轻轻加到非血源性细胞分离介质顶层(切忌将 磁珠悬液加入到分离介质中),将离心管D使用hCTC缓冲液配平后,室温400g 离心5分钟。
    离心后将管D中底层沉积磁珠上的所有液体转移至15ml离心管E中(保 留磁珠上方100μl溶液,切勿吸取到底层磁珠)。
    (5)往离心管E中加入1×hCTC缓冲液至14ml,使用1×hCTC缓冲液 配平后,头尾颠倒混匀,室温950g离心3分钟。弃上清至300μl,加入1.4ml 1 ×hCTC缓冲液,使用1ml加样器混匀,将液体转移至2ml离心管F中(保留 加样器枪头供第(6)步使用)。
    (6)将上述2ml离心管F置于磁力架上3分钟以彻底吸附磁珠。第2分 钟后使用上述保留的1ml枪头沿磁珠对侧管壁轻轻吹打液体1~2次,并旋转离 心管15°,1分钟后将置于磁力架上的管内液体小心转移至新的15ml离心管G 中(保留加样器枪头)。
    (7)往离心管G中加入1×hCTC缓冲液至14ml,将保留的加样器枪头于 液面处洗涤吹打三下,使用1×hCTC缓冲液配平后,头尾颠倒混匀,室温950g 离心3分钟。弃上清至100μl。
    (8)将离心管G中的细胞进行计数、稀释后,加入100μl Cytelligen固定 液混匀,将离心管G中液体涂片、干燥后进行检测。具体为:
    细胞计数、稀释:为了防止细胞过多引起固定涂片后细胞重叠,影响后续 检测后的细胞识别,需对最后的沉淀细胞进行计数、稀释。细胞计数:将步骤 8中的100μl细胞液混匀后,取4μl细胞液于4μl 2%冰醋酸中,混匀,将以上 8μl液体于血细胞计数板上观察四个大方格中的细胞总数,100个细胞以内为 宜,即100μl细胞液中细胞总数不超过5×104个(注:100μl细胞液中细胞总 数为:4个大方格内白细胞总数×稀释倍数(2倍)×103/(1×1×0.1×4)×0.1)。 富集后样本液稀释:当四个大方格中的细胞数少于100个时,最后的细胞液不 需要稀释;当四个大方格中的细胞数多于100个时,按一定比例将细胞液稀释 至四个大方格中的细胞总数为100个。举例说明,当四个大方格中的细胞数为 200个时,稀释2倍为100个,因此将100μl细胞液混匀,取50μl细胞液混匀 于50μl 1×hCTC缓冲液中。
    使用1ml注射器扎入固定液试剂瓶,抽取适量Cytelligen固定液(100μl固 定液/玻片/人份)于1.5ml离心管中,立即盖上管盖。由于注射器抽取液体不精 确,避免反复抽取,因此每张玻片可取出100~150μl固定液。如因瓶内真空而 抽不出液体,使用注射器打入少量空气。使用完毕后,剩余固定液弃去,不可 打回至原包装瓶内。1ml注射器用纯化水反复洗涤并晾干后可反复使用。
    将稀释后的100μl细胞液(确保内含细胞数不大于10时)轻轻吹打混匀(保 留加样器枪头)后加入100μlCytelligen固定液,并使用保留的加样器枪头轻柔 吹打混匀。将每管标本液体分别涂于Cytelligen载玻片标本框内(1人份/玻片)。
    标本干燥与保存标本干燥与保存标本干燥与保存标本干燥与保存:将标本 放置30~32℃干燥箱过夜(全程不开鼓风,打开顶置通风口),第二天关闭干 燥箱温度后将标本继续静置于干燥箱中30分钟凉至室温(此步骤不可省略!), 立即进行后续检测。注意!当夏天环境温度高于干燥箱设定的30~32℃时,干 燥箱会停止运转,建议将室内空调温度调节至25℃过夜。如室内没有空调设施, 可将标本放置35℃干燥箱过夜,但标本背景会略有增高。为避免标本背景增高, 干燥后4℃保存的标本必须在48小时内进行后续实验。4℃冰箱保存或4℃条件 运输后的标本取出后按照以上干燥条件重新干燥后进行瘤标FISH检测。
    实施例3恶性胸腔积液肿瘤细胞瑞姬染色涂片
    (1)密度梯度离心法富集恶性胸腔积液中肿瘤细胞:①取50ml胸水于50ml 离心管中,离心(200g,常温,10min),弃上清至4ml并混匀;②取4ml淋 巴细胞分离液至离心管底部,并升温至室温;③将4ml细胞悬液轻轻置于淋巴 细胞分离液上面,勿打乱液层界面,离心(300g,室温,25min),吸取中间层 至15ml离心管中,并加5倍于该液体的PBS缓冲液混匀,离心(250g,室温, 15min),弃上清;④加入1mlPBS缓冲液洗涤2遍,250g离心5min,弃上清, 加1mlPBS混匀沉淀,然后进行细胞计数,取适量细胞与固定液混匀后按106个细胞的密度进行涂片,用于瑞姬染色进行肿瘤细胞鉴定。
    (2)按照本发明建立的免疫磁珠阴性富集法富集恶性胸腔积液中肿瘤细 胞。
    (3)瑞姬染色:将上述两种方法制备好的106个细胞密度胸水涂片滴加瑞 姬染液A液3~5滴,然后滴加B液6~10滴,使其充分混匀,染色3min左右, 自来水冲洗1min,然后经梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树胶封片后镜检, 结果如图1所示。肿瘤细胞鉴定标准:细胞多成团成对分布,相互融合,界限 不清;细胞体积较大,核浆比例失调,核仁增大有畸形,胞浆较少、偏碱、有 空泡。
    实施例4染色体荧光原位杂交
    1、准备工作包括:
    在操作过程中,为避免污染,实验全程必须穿戴白大衣、帽子、口罩及手 套。
    分装FR1溶液:收到试剂盒后,将FR1溶液于振荡器上头尾振荡混匀后高 速离心3秒钟,并分装至6个0.5ml PCR管中,20μl/管,使用封口膜封口,置 于50ml管中,封口。室温避光保存。每次取用完毕后封口膜封口,放置室温避 光保存。
    配制1×FR3溶液:将全部10×浓缩FR3溶液精确定量后,用纯化水稀释 10倍至1×FR3溶液,4℃保存。每次分装使用。
    每次实验前,准备4个Coplin染色缸,分别标记为I、II、III、IV。按下 列顺序向每缸中加入40~42ml相应液体。缸I:1×FR3溶液(使用1M NaOH、 pH计将试剂调至pH7.2~7.3),37℃恒温水浴锅中预热保存;缸II:75%乙醇, 室温保存;缸III:85%乙醇,室温保存;缸IV:无水乙醇,室温保存。每次实 验前,4个染色缸中的溶液均需更换,一个染色缸一次最多处理5张标本。
    取适量1×FR3溶液(1ml/玻片)于离心管中,使用pH计将试剂调至 pH7.2~7.3(或从调节好pH值,放入水浴锅中前的缸I中取出所需适量1×FR3 溶液),于水浴锅中预热至27℃,保存至步骤(2)、 (9)使用。
    每次实验前分装适量FR2溶液(240μl FR2溶液/玻片)于恒温水浴锅中预 热至37℃后再使用!分装适量抗体洗涤液(1.2ml/玻片)及抗体配制液(200μl/ 玻片)并预热至27℃。每次实验后的多余试剂于4℃单独保存以供下次实验使 用。
    CEP-7、CEP-8探针:室温融化-20℃保存的探针后,将探针管于振荡器上 头尾分别充分振荡(每次振荡不少于5秒钟)后高速离心3秒钟,再次头尾振 荡并离心。按每张玻片10μl的比例取出本次实验所需探针于0.5ml离心管中, 4℃避光保存至步骤(5)使用。原探针管放回-20℃保存。
    2、染色体荧光原位杂交过程:
    (1)配制混合液:使用1.5ml离心管离心机室温高速离心FR1溶液管10 秒。按每张玻片计算取液,胸水、腹水标本:5μl FR1+240μl FR2;尿液标本: 10μl FR1+240μl FR2;于振荡器上充分振荡混匀?;旌弦号渲坪煤罅⒓醇尤氡?本上(等待时间不超过1分钟):沿Cytelligen CTC载玻片标本框内侧一角轻柔 滴加240μl混合液覆盖标本框(注意!不要将液体滴于标本框外,如液体不能 覆盖整个标本框,使用枪头平推液体,但枪头不要触碰玻片上的细胞),室温 避光静置10分钟。
    (2)将载玻片微斜,使用真空泵吸头沿标本框外围吸弃混合液。沿标本框 内侧一角轻柔滴加200μl室温预热的1×FR3溶液后,立即吸弃溶液,共重复2 次。沿标本框内侧一角轻柔滴加200μl室温预热的1×FR3溶液,室温静置2 分钟,吸弃溶液。
    (3)将玻片插入已预热至37℃的染色缸I中静置15分钟。取出玻片,竖 立在滤纸上,轻轻磕动,以快速吸取玻片残留液,但切忌使玻片干燥。将缸I 从水浴锅中取出,室温保存FR3溶液至步骤(8)中使用。
    (4)将玻片依次在缸II、III、IV中静置1分钟。缸II及缸III换缸时,取出 玻片,竖立在滤纸上,轻轻磕动,快速吸干玻片残留液至无液体流下即可,但 切忌使玻片干燥。将玻片从缸IV中取出后,竖立在滤纸上完全吸干玻片流下残 留液,并使用微型吹风机将玻片轻柔吹至完全干燥后,立即按步骤(5)滴加探 针(标本干燥后在空气中等待时间不可超过1分钟)。多张玻片操作时可先取 出2张玻片,剩余玻片一直保存在缸IV中,直至先取出的2张玻片干燥、加上 探针并置放好盖玻片。
    (5)以下操作均须避光。自4℃取出分装好的探针液,于标本框中央滴加 10μl探针(切忌起泡!)后,立即使用镊子将盖玻片平放在探针液上,使液体 向四周蔓延至整个标本框(切忌起泡!)。如果需要,可轻按盖玻片以使探针液 覆盖整个标本框。
    (6)封片:剪去1ml加样器尖头,每张玻片使用250μl封片胶(Rubber  Cement)封住盖玻片四边边缘后,直接放入杂交仪(不需等待封片胶干燥)。
    (7)杂交:变性76℃,5分钟;杂交37℃,1.5小时。
    配制抗体:杂交结束前10分钟进行抗体配制。从冰箱取出抗体保存管于 1.5ml离心管台式离心机中高速离心5秒钟。4℃条件下吸取抗体,按每张玻片 计算,200μl抗体配制液+1μl抗白细胞抗体组合群。使用加样器轻柔吹打10次 以充分混匀抗体(切忌起泡!)。将配制后的抗体混合液置于冰箱4℃避光保 存至步骤(11)使用??固迥敢汗芊呕?℃避光保存。
    (8)杂交完毕,取出玻片。用手轻按盖玻片一角,使用镊子撕去Rubber  Cement(切勿掀动盖玻片!),将玻片置于已凉至室温的缸I中,静置1分钟 后轻柔晃动缸I,直至盖玻片脱落(如盖玻片不易脱落,使用镊子轻推至盖玻 片松动,继续晃动缸I)。盖玻片脱落后,将玻片继续在缸I中室温静置1分 钟后取出,使用滤纸吸干玻片流下的残留液,并擦干标本框外围液体。
    (9)沿标本框内侧一角轻柔滴加200μl 1×FR3溶液后,静置1分钟,吸 弃FR3溶液,共重复2次。
    抗体染色:
    (10)沿载玻片标本框内侧一角轻柔滴加200μl抗体洗涤液后,将载玻片 微斜,使用真空泵吸头沿标本框外围吸弃染色液,共重复2次。沿载玻片标本 框内侧一角轻柔滴加200μl抗体洗涤液,室温静置2分钟,吸弃。
    (11)将玻片置于湿盒中,沿标本框内侧一角轻柔滴加200μl配制好的抗 体混合液,室温避光孵育2小时。切忌使玻片干燥。
    注:抗体孵育的温度须在25℃~30℃,否则会影响染色效果。当环境温度 低于25℃时,请将玻片放于烘箱30℃孵育。具体操作如下:将载玻片平放入 100mm的培养皿中,于标本框上加入配制好的抗体混合液,玻片周边放些湿纸, 盖上盖子并用封口膜封口,然后小心将培养皿平放于烘箱,以免液体以免液体 洒出。孵育过程中注意液体不能挥发干。
    (12)吸弃抗体后,沿标本框内侧一角轻柔滴加200μl抗体洗涤液,立即 吸弃,共重复2次。沿玻片标本框内侧一角轻柔滴加200μl抗体洗涤液,室温 静置2分钟,吸弃抗体洗涤液(过程中高速离心DAPI荧光保存液管5秒钟)。
    (13)取5μl荧光保存液滴加于标本框中央,置放盖玻片后,一手用镊子 轻按盖玻片中央防止其滑动,另一手用真空泵吸头从盖玻片中央向四周轻轻滑 动挤压并吸干溢出的多余液体。
    (14)立即在荧光显微镜下观察或于4℃避光保存。为避免FISH信号及抗 体染色荧光减弱,标本应在一周内完成检测。在荧光显微镜上反复观察标本会 使荧光淬灭,在第一次读片时储存细胞图片,结果如图2所示。
    实施例5恶性胸腔积液肿瘤细胞和CD133细胞的捕获
    1、准备工作
    为避免上皮细胞污染,实验全程必须穿戴白大衣、帽子、口罩及手套。
    分装SR1溶液:收到试剂盒后,将SR1溶液于振荡器上充分振荡后高速离。
    心3秒钟,并分装至6个0.5ml PCR管中,40μl/管,使用封口膜封口,置 于50ml管中,封口。室温避光保存。每次取用完毕后封口膜封口,放置室温避 光保存。
    每次实验前分装适量SR2溶液(1.5ml/玻片)、抗体染色液(1.0ml/玻片) 于恒温水浴锅中预热至27℃再使用。每次实验后的多余试剂于4℃单独保存以 供下次实验使用。
    配制抗体:从冰箱取出抗体保存管于1.5ml离心管台式离心机中高速离心5 秒钟。4℃条件下吸取抗体,按每张玻片计算,200μl抗体染色液+1μl抗角蛋白 CK-18抗体+1μl CD133抗体(抗体取用完立即拧紧管帽,放回4℃避光保存), 使用加样器轻柔吹打10次以充分混匀抗体(切忌起泡!)。将配制后的抗体混 合液置于冰箱4℃避光保存至步骤3使用。
    2、捕获操作过程:
    (1)配制混合液:将SR1溶液管于1.5ml离心管台式离心机中室温高速离 心5秒钟。按每张玻片计算:10μl SR1溶液+240μl SR2溶液,于振荡器上充分 振荡混匀?;旌弦号渲坪煤罅⒓醇尤氡瓯旧?,等待时间不超过1分钟!沿 Cytelligen CTC载玻片标本框内侧一角轻柔滴加240μl混合液覆盖标本框,30 ℃(可放于烘箱30℃)避光静置10分钟。注意!不要将液体滴于标本框外, 如液体不能覆盖整个标本框,使用枪头平推液体,但枪头不要触碰玻片上的细 胞。
    (2)将载玻片微斜,使用真空泵吸头沿标本框外围吸弃混合液。沿标本框 内侧一角轻柔滴加200μl SR2溶液后,立即吸弃SR2溶液,共重复3次。沿标 本框内侧一角轻柔滴加200μl SR2溶液,室温静置2分钟,吸弃SR2溶液,共 重复3次(以下所有操作步骤需避光操作)。
    (3)将玻片置于湿盒中,沿标本框内侧一角轻柔滴加200μl上述配制的抗 体,室温避光孵育2小时。切忌使玻片干燥(以下操作须避光)。
    (4)弃抗体。沿标本框内侧一角轻柔滴加200μl抗体染色液后,立即吸弃 溶液,共重复2次。沿载玻片标本框内侧一角轻柔滴加200μl抗体染色液,室 温静置2分钟,吸弃溶液(静置期间高速离心DAPI荧光保存液管5秒钟)。
    (5)取5μl荧光保存液滴加于标本框中央,置放盖玻片后,一手用镊子轻 按盖玻片防止其滑动,一手用真空泵吸头轻按盖玻片挤压并吸干溢出的多余液 体。荧光显微镜下观察染色细胞。
    (6)立即在荧光显微镜下观察细胞。染色后标本于4℃避光保存。为避免 抗体染色荧光减弱,标本应在一周内完成检测。在荧光显微镜下反复观察标本 会使荧光淬灭,在第一次读片时储存细胞图片,结果如图3所示。
    实施例6临床实验
    (1)临床入组合并恶性胸腔积液的肺癌患者(病理确诊),此外,入组良 性胸腔积液的患者作为对照;
    (2)胸腔积液的采集:无菌条件下行胸腔穿刺术取胸腔积液100ml,尽快 送检,于1小时内富集。
    (3)细胞分离:分别采用本研究建立的免疫磁珠阴性富集法和梯度密度离 心法富集良恶性胸腔积液中肿瘤细胞;
    (4)细胞鉴定:采用瑞姬染色涂片、FISH方法验证富集到的细胞是否为 肿瘤细胞;
    (5)实验结果统计分析。
    从目前已完成工作来看,在良恶性胸腔积液的鉴别诊断方面;已经将该方 法应用了78例患者,结果显示FISH检测恶性胸腔积液肿瘤细胞的敏感性达 86.11%,特异性达100%,表明该试剂盒利于良恶性胸腔积液的鉴别,性能优 于目前临床常用的梯度密度离心等方法(敏感性在40~60%)。
    在胸腔积液肿瘤细胞端粒酶检测方面,该方法去除了胸腔积液中白细胞对 肿瘤细胞端粒酶活性的影响,使用该法富集后的肿瘤细胞进行端粒酶活性检测 提高了恶性胸腔积液诊断的特异性。
    相比于现有技术的缺点和不足,本发明具有以下有益效果:本发明首次将 免疫磁珠肿瘤细胞阴性富集法应用到胸腔积液肿瘤细胞的富集上,提高了肿瘤 细胞检出的敏感性,与外周血阴性富集法在方法上明显不同,胸腔积液中因有 大量的上皮和间皮细胞,大大影响了上皮来源肿瘤细胞的检出。本技术联合 FISH检测成功解决了上述难题,提高肿瘤细胞富集的敏感性及特异性。本技术 可用于良恶性胸腹水的鉴别诊断,实体瘤的动态基因检测,实现个体化治疗。
    以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明 的?;し段е?。

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    一种 免疫 阴性 富集 应用
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