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    重庆时时彩害人骗人的: 快速鉴别文蛤属种类的方法.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201510147304.5

    申请日:

    2015.03.31

    公开号:

    CN104697997A

    公开日:

    2015.06.10

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 21/84申请日:20150331|||公开
    IPC分类号: G01N21/84 主分类号: G01N21/84
    申请人: 浙江万里学院
    发明人: 董迎辉; 林志华; 姚韩韩; 包永波; 何琳
    地址: 315199浙江省宁波市鄞州区钱湖南路8号
    优先权:
    专利代理机构: 宁波诚源专利事务所有限公司33102 代理人: 景丰强
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201510147304.5

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2018.01.12|||2015.07.08|||2015.06.10

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    一种快速鉴别文蛤属种类的方法,其特征在于包括如下步骤:①文蛤活体解剖;②入水管口缘触手制片;③显微观察;④种类确定,依据入水管口缘触手形态特征,确定其种类。与现有技术相比,本发明的优点在于:利用入水管口缘触手显微观察不但检测准确,而且具有技术难度小、操作步骤简单、结果直观准确的优点,尤其在实验总耗时上有明显少于传统的线粒体COI基因测序法和AFLP标记法。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种快速鉴别文蛤属种类的方法,其特征在于包括如下步骤:
    ①文蛤活体解剖,待检文蛤活体洗净后切断前闭壳肌,掰开两壳,再切断后闭壳肌, 且勿损坏后端的入水管;
    ②入水管口缘触手制片,吸取透明的文蛤体液,滴于载玻片上形成液滴,剪取一片 入水管远端带触手部分,管内壁向上置于载玻片的液滴中;
    ③显微观察,拨动入水管口缘触手去除粘液和污物,在显微镜或放大镜下观察其形 态特征;
    ④种类确定,依据入水管口缘触手形态特征,确定其种类。

    2.  根据权利要求1所述的快速鉴别文蛤属种类的方法,其特征在于步骤④种类确 定如下:
    如入水管口缘触手呈牛角状,末端尖细无分支,中部有明显的黑色色素带,则为拉 丁学名是Meretrix meretrix的文蛤;
    如入水管口缘触手散在成簇,顶端如菜花分支,则为斧文蛤;
    如入水管口缘触手顶端有短的树枝样分支,则为白壳文蛤;
    如入水管口缘触手呈长锥形,末端尖细无分支,中部无黑色色素带,而有散在的黄 色色素颗粒,则为帘文蛤。

    3.  根据权利要求1所述的快速鉴别文蛤属种类的方法,其特征在于步骤②所述的 文蛤体液采用文蛤活体解剖中切开闭壳肌2~3min后从体内流出的透明液体。

    4.  根据权利要求1所述的快速鉴别文蛤属种类的方法,其特征在于步骤②所述的 入水管远端带触手部分面积为长0.2cm×宽0.3~0.4cm。

    说明书

    说明书快速鉴别文蛤属种类的方法
    技术领域
    本发明涉及一种文蛤种类的鉴别方法。
    背景技术
    文蛤属(Meretrix)种类是双壳贝类中变异最大的物种之一,因遗传和环境的影响 而导致其在贝壳形态、壳色花纹上存在很大差别,长期以来国内外学者在其种类鉴别、 系统分类、动物区系分析等问题上存在很大争议。我国学者对文蛤属种类的界定也存在 较大分歧。
    庄启谦所著的《中国动物志》(北京:科学出版社,2001:229-236.)中涉及软体动 物们双壳纲帘蛤科将我国分布的文蛤属种类划归为文蛤(M.meretrix)、丽文蛤(M. lusoria)和斧文蛤(M.1amarckii)3种。
    齐钟彦(Qi Zhongyan)所著的《Seashells of China》(北京:海洋出版社,2004:306); 张素萍所著的《中国海洋贝类图鉴》(北京:海洋出版社,2008:353-354.);徐凤山等所 著的《中国海产双壳类图志》(北京:科学出版社,2008:249-251)。
    上述三篇文献对斧文蛤(M.1amarckii)形态的文字描述和图片资料有很大差别。
    《海洋与湖沼》2006年7月第37卷第4期,潘宝平等所著的“文蛤属(Meretrix)16S rRNA 基因及ITS1序列的系统学分析”和《动物学研究》2009年6月,第3期,30(3):233-239 “基于线粒体COI基因序列的文蛤属(软体动物门:帘蛤科)系统发育关系”,上述两 篇文献基于线粒体基因片段和核糖体ITS序列比对,发现文蛤和丽文蛤的亲缘关系很近, 建议将它们划归为同一物种。
    《海洋与湖沼》2009年1月,第40卷第1期,林志华等所著“广西文蛤(Meretrix) 的fAFLP及ITS分析”,该文献通过fAFLP和ITS分析发现,广西白壳文蛤与其它现 有记载文蛤的表型和遗传结构均存在较大差异,推测是文蛤属一新种。
    《水产学报》2011年10月,第35卷第10期,董迎辉等所著“浙江和广西两种文蛤 的分子鉴定及形态特征分析”,该文献利用线粒体COI基因序列分析将浙江苍南文蛤确 定为斧文蛤,从而把斧文蛤的分布区域向北扩展到了浙江南部沿海,修正了现有文献中 记载的仅在我国南海诸省分布的说法。
    综上所述,文蛤属种类划分和认定仍较混乱,这给种质资源?;ぜ跋喙乜蒲а芯看?来了严重困扰。
    目前,主要采用线粒体16S rDNA、COI基因序列和AFLP分子标记等在不同文蛤 属种类间的差异来进行物种鉴定。相关文献可以参考《海洋与湖沼》2011年5月,第 42卷第3期,朱在丽等所著的“文蛤(Meretrix meretrix)4个壳色花纹品系的遗传差异分 析”;还可以参考《水产学报》2011年10月,第35卷第10期,董迎辉等所著“浙江和 广西两种文蛤的分子鉴定及形态特征分析”。
    上述方法虽然准确,应用比较普遍,但存在操作难度大、耗时长,检测结果不直观 等不足。
    发明内容
    本发明所要解决的技术问题是针对上述的技术现状而提供一种操作简单、检测结果 直观的快速鉴别文蛤属种类的方法。
    本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:一种快速鉴别文蛤属种类的方法, 其特征在于包括如下步骤:
    ①文蛤活体解剖,待检文蛤活体洗净后切断前闭壳肌,掰开两壳,再切断后闭壳肌, 并且,保证勿损坏后端的入水管;
    ②入水管口缘触手制片,吸取透明的文蛤体液,滴于载玻片上形成液滴,剪取一片 入水管远端带触手部分,管内壁向上置于载玻片的液滴中;
    ③显微观察,拨动入水管口缘触手去除粘液和污物,在显微镜或放大镜下观察其形 态特征,这里的显微镜可以采用普通体视显微镜或光学显微镜(4×10倍);
    ④种类确定,依据入水管口缘触手形态特征,确定其种类。
    进一步,步骤④种类确定如下:
    如入水管口缘触手呈牛角状,末端尖细无分支,中部有明显的黑色色素带,则为拉 丁学名是Meretrix meretrix的文蛤;
    如入水管口缘触手散在成簇,顶端如菜花分支,则为斧文蛤;
    如入水管口缘触手顶端有短的树枝样分支,则为白壳文蛤;
    如入水管口缘触手呈长锥形,末端尖细无分支,中部无黑色色素带,而有散在的黄 色色素颗粒,则为帘文蛤。
    进一步,步骤②所述文蛤的体液采用文蛤活体解剖中切开闭壳肌2~3min后从体内 流出的透明液体,作为等渗的保湿剂,防止水分快速蒸发而使入水管口缘触手脱水皱缩。
    作为优选,步骤②所述的入水管远端带触手部分面积为长0.2cm×宽0.3~0.4cm。
    与现有技术相比,本发明的优点在于:
    1、方法简单、操作便捷,无需经过分子鉴别的DNA提取、PCR扩增、测序或电 泳等繁琐程序,直接通过简单的水装片制作和显微观察即可;
    2、检测要求低、检测难度小,无需离心机、电泳仪等大量昂贵的仪器设备,只需 轻便的体视显微镜、光镜甚至放大镜;
    3、耗时少,在5min左右就能完成种类鉴定,省时省力;
    4、结果直观准确,结果不是难懂的DNA序列比对和电泳胶图,而是直观且极易 区分辨别的显微形态图,然而鉴定结果同样准确可靠。
    附图说明
    图1为实施例1中文蛤(Meretrix meretrix)入水管口缘触手形态的显微照片
    图2为实施例1中斧文蛤(M.lamarckii)入水管口缘触手形态显微照片。
    图3为实施例1中白壳文蛤(M.spp.)入水管口缘触手形态的显微照片。
    图4为实施例1中帘文蛤(M.lyrata)入水管口缘触手形态的显微照片。
    图5为实施例2中福建长乐三角蛤入水管口缘触手形态的显微照片。
    具体实施方式
    以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
    实施例1,本实施例的实验材料是我国东南沿海采集的文蛤属4种文蛤,分别是文 蛤(采自江苏南通如东海域,经纬度为32°30′N,121°11′E)、斧文蛤(采自浙江温州苍南 海域,经纬度为27°33′N,120°36′E)、帘文蛤(采自广东湛江东海岛海域,经纬度为 21°04′N,110°20′E)、白壳文蛤(采自广西北海营盘海域,经纬度为21°27′N,109°26′E), 壳长3~7cm。
    实施步骤如下:
    1、文蛤活体解剖:将4种待检文蛤活体清洗干净,置于解剖盘中,用解剖刀切断 前闭壳肌,缓慢掰开两壳,再切断后闭壳??;
    2、入水管口缘触手制片:解剖后2min,用滴管吸取文蛤透明的血液/粘液混合物 1mL,滴1滴于干净的载玻片中央;用小剪刀剪取入水管远端带触手部分一小片,大小 为长0.2cm×宽0.3cm,管内壁向上置于载玻片中央的液滴中,透明的血液/粘液混合物 采用文蛤活体解剖中切开闭壳肌2~3min后从体内流出的透明液体;
    3、显微观察:用解剖针轻拨入水管口缘触手,去除粘液和污物,在普通体视显微 镜下观察4种文蛤入水管口缘触手的形态特征;
    4、种类确定:比较入水管口缘触手形态差别,区分4种文蛤。
    5、入水管口缘触手显微观察法与传统线粒体COI基因测序法的方法步骤和结果比 较:
    用入水管口缘触手显微观察法对4种文蛤进行了区分和鉴定,结果如下:
    如图1所示,文蛤入水管口缘触手呈牛角状,末端尖细无分支,中部有明显的黑色 色素带(PB:Pigment Belt,色素带);
    如图2所示,斧文蛤入水管口缘触手散在成簇,顶端如菜花分支;
    如图3所示,白壳文蛤入水管口缘触手顶端有端的树枝样分支;
    如图4所示,帘文蛤入水管口缘触手呈长锥形,末端尖细无分支,但中部无黑色色 素带,而有散在的黄色色素颗粒。
    这4种文蛤样品也已经过线粒体COI基因测序法进行过物种鉴定,物种信息已经 明确。由此可见,入水管口缘触手显微观察法适用于区分文蛤属种类,结果准确可靠。
    表1比较了本发明的入水管口缘触手显微观察法与传统的线粒体COI基因测序法 的方法步骤和结果准确性,结果显示入水管口缘触手显微观察法具有技术难度小、操作 步骤简单、结果直观准确的优点,尤其在实验总耗时上有明显的优势。
    表1、入水管口缘触手显微观察法与传统线粒体COI基因测序法的方法步骤和结果准确性比较

    实施例2,2012年6月,从福建长乐市漳港镇(25°54′32.78″N,119°39′04.53″E) 采集一种文蛤(本地称“三角蛤”),形态和壳色与其他文蛤属种类均有一定差别。为了 对长乐“三角蛤”进行准确鉴别,分别采用入水管口缘触手显微观察法与AFLP分子标 记技术两种手段进行了研究。
    入水管口缘触手显微观察法观察了4颗“三角蛤”的入水管口缘触手,耗时15min, 结合图5所示,结果显示,“三角蛤”的入水管口缘触手均散在成簇,顶端如菜花状分 支,与图2中斧文蛤入水管口缘触手相同,据此将“三角蛤”确定为斧文蛤。
    利用AFLP标记技术,对“三角蛤”、文蛤、斧文蛤、帘文蛤、白壳文蛤5个群体 各15个样本进行了指纹图谱比对和遗传相似度分析,耗时5d,结果显示,“三角蛤” 的AFLP指纹图谱与斧文蛤非常相似,遗传相似度达到0.9554,显著高于与其他群体的 0.5499~0.5844,因此将“三角蛤”确定为斧文蛤。
    以上结果表明,入水管口缘触手显微观察法操作更简单、结果更直观准确。

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