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    测定 CP 装载 SIRNA 体系 释放 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201410114083.7

    申请日:

    2014.03.25

    公开号:

    CN104677866A

    公开日:

    2015.06.03

    当前法律状态:

    撤回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的视为撤回IPC(主分类):G01N 21/64申请公布日:20150603|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 21/64申请日:20140325|||公开
    IPC分类号: G01N21/64 主分类号: G01N21/64
    申请人: 中国科学院大连化学物理研究所
    发明人: 马小军; 张德蒙; 刘袖洞; 于炜婷
    地址: 116023辽宁省大连市中山路457号
    优先权:
    专利代理机构: 沈阳科苑专利商标代理有限公司21002 代理人: 马驰
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201410114083.7

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2017.11.07|||2015.07.01|||2015.06.03

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的视为撤回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明提供一种可测定阳离子聚合物载siRNA体系中siRNA释放曲线的方法。该监测siRNA释放方法需要分别对阳离子聚合物载体及所装载siRNA进行荧光标记,且标记使用的两种荧光物质构成荧光共振能量转移(FRET)荧光供体/受体对。FRET效率变化反映壳聚糖与siRNA复合状况的变化,即FRET效率降低曲线即为siRNA释放曲线。本发明优势在于只需对常规体系进行荧光标记,操作简便,检测灵敏度高,且可实现siRNA释放的原位、实时检测,即可用于细胞外环境模拟也可用于细胞、动物水平的实验操作。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  测定CP装载siRNA体系中siRNA释放的方法,其特征在于:体系中 阳离子聚合物(Cationic Polymeric,CP)及其所装载siRNA皆选用带有荧光 基团的原料,且载体阳离子聚合物与siRNA所标记两种荧光物质可构成荧光 共振能量转移(FRET)效应的荧光供体/受体对,即可根据体系中FRET效率 的变化获得siRNA释放信息。

    2.  根据权利要求1所述的方法,其特征在于:选用经FRET荧光供体/ 受体对分子Donor/Acceptor(D/A)分别标记CP与siRNA,即D-CP、A-siRNA 或A-CP、D-siRNA;
    当标记形式为D-CP、A-siRNA时,具体步骤如下:
    (1)CP溶于0.5-5mL溶剂S中,使得溶液中阳离子聚合物所携带阳离 子基团浓度为1-600μM;
    (2)取体积为5μL-500μL、浓度1μM-100μM的siRNA搅拌条件下缓慢 加入步骤(1)所得溶液中,避光反应5-60分钟后得CP/siRNA复合物;
    (3)采用与步骤(1)、步骤(2)所述相同的条件和过程,不同之处是 将CP更换为D-CP,得到D-CP/siRNA复合物;采用与步骤(1)、步骤(2) 所述相同的条件和过程,将siRNA更换为A-siRNA,得到CP/A-siRNA复合 物;采用与步骤(1)、步骤(2)所述相同的条件和过程,不同之处是将CP 更换为D-CP同时将siRNA更换为A-siRNA,得到D-CP/A-siRNA复合物;
    (4)取等体积CP/siRNA、D-CP/siRNA、CP/A-siRNA、D-CP/A-siRNA 复合物分别加入到相同条件(相同组成的缓冲体系、pH、浓度条件)、体积为 0.1-10mL溶液R,使得R中siRNA终浓度为1-1000nM;
    (5)分别取含有CP/siRNA、D-CP/siRNA及D-CP/A-siRNA复合物体系 R0.1-2mL,测定D(D即为FRET体系供体/受体对的供体荧光探针)激发波 长下,D最大发射波长处的荧光发射强度I0、ID、ID/A,并根据公式(i)计算 FRET效率E;或分别取含有CP/siRNA、CP/A-siRNA及D-CP/A-siRNA复合 物R0.1-2mL,分别测定D激发波长下,A最大发射波长处的荧光发射强度 I0、IA、ID/A,并根据公式(ii)计算FRET效率E
    E = ( I D - I 0 ) - ( I D / A - I 0 ) I D - I 0 × 100 % - - - ( i ) ]]>
    E = ( I D / A - I 0 ) - ( I A - I 0 ) I A - I 0 × 100 % - - - ( ii ) ; ]]>
    (6)每隔3分钟-24小时重复一次步骤(5),持续检测24-72小时,绘 制时间-FRET效率曲线,该曲线即为siRNA释放过程曲线;
    或者,当标记形式为A-CP、D-siRNA时,具体步骤如下:
    (1)CP溶于0.5-5mL溶剂S中,使得溶液中阳离子聚合物所携带阳离 子基团浓度为1-600μM;
    (2)取体积为5μL-500μL、浓度1μM-100μM的siRNA搅拌条件下缓慢 加入步骤(1)所得溶液中,避光反应5-60分钟后得CP/siRNA复合物;
    (3)采用与步骤(1)、步骤(2)所述相同的条件和过程,不同之处是 将CP更换为A-CP,得到A-CP/siRNA复合物;采用与步骤(1)、步骤(2) 所述相同的条件和过程,不同之处是将siRNA更换为D-siRNA,得到 CP/D-siRNA复合物;采用与步骤(1)、步骤(2)所述相同的条件和过程, 不同之处是将CP更换为A-CP同时将siRNA更换为D-siRNA,得到 A-CP/D-siRNA复合物;
    (4)取等体积CP/siRNA、A-CP/siRNA、CP/D-siRNA、A-CP/D-siRNA 复合物分别加入到相同条件(相同组成的缓冲体系、pH、浓度条件)、体积为 0.1-10mL溶液R中,使得R中siRNA终浓度为1-1000nM;
    (5)分别取含有CP/siRNA、A-CP/siRNA及A-CP/D-siRNA复合物体系 R0.1-2mL,测定D激发波长下,A最大发射波长处的荧光发射强度I0、IA、 ID/A,并根据公式(ii)计算FRET效率E;或分别取含有CP/siRNA、CP/D-siRNA 及A-CP/D-siRNA复合物R0.1-2mL,分别测定D激发波长下,D最大发射波 长处的荧光发射强度I0、ID、ID/A,并根据公式(i)计算FRET效率E;
    (6)每隔3分钟-24小时重复一次步骤(5),持续检测24-72小时,绘 制时间-FRET效率曲线,该曲线即为siRNA释放过程曲线。

    3.  根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述阳离子聚合物为 下列物质或其衍生物的一种:壳聚糖(CS),聚乙烯亚胺(PEI),L-聚赖氨酸 (PLL)以及聚酰胺-胺(PAMAM)、聚丙烯亚胺(PPI)、碳硅烷(CB)、三 嗪、聚甘油等带有氨基基团的树状聚合物。

    4.  根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:阳离子聚合物上结合 的荧光探针分子与聚合物阳离子基团摩尔比为1:500至1:10。

    5.  根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述FRET荧光供体 /受体对为以下荧光供体/受体对或其衍生物的一种:FITC/TMR;CFP/YFP; CFP/dsRED;BFP/GFP;GFP/dsRED;YFP/dsRED;Cy3/Cy5;Alexa488/Alexa555; Alexa488/Cy3;FITC/TRITC;YFP/TRITC;YFP/Cy3;FITC/Cy3。

    6.  根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述siRNA上结合的 荧光探针分子标记于siRNA5’端,荧光探针分子与siRNA的摩尔比为1:1 至1:5。

    7.  根据权利要求2所述的方法,其特征在于:溶剂S为水,0.01-5M  pH4.5-pH6.5醋酸-醋酸钠缓冲液,0.01-5M pH5.0-pH8.0磷酸缓冲液及0.9% 氯化钠溶液中的一种;所述释放体系R为水,0.01-5M pH4.5-pH6.5醋酸-醋 酸钠缓冲液,0.01-5M pH5.0-pH8.0磷酸缓冲液,0.9%氯化钠溶液,RPMI-1640、 DMEM、MEM、F12等细胞培养液中的一种。

    8.  根据权利要求2所述的方法,其特征在于:
    当考察siRNA在细胞内释放过程时,权利要求2步骤(4)应将复合物分 别加入接种密度102-105细胞/cm2,培养时间5-48小时细胞培养皿中,培养液 中siRNA终浓度为1-1000nM,步骤(5)取出103-106细胞悬于0.1-2mL权利 要求7中所述培养液中中用于检测;
    当考察siRNA在小鼠或大鼠体内释放过程时,权利要求2步骤(4)应将 复合物分别经尾静脉注射入相同饲养条件体重15-25g的小鼠或150-250g大鼠 体内,步骤(5)取出0.1-2mL小鼠或大鼠血液用于检测。

    9.  根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述方法用于细胞外环境 模拟siRNA释放过程及细胞siRNA释放过程、或动物水平siRNA释放过程的 监测。

    10.  根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述CP装载siRNA体 系是阳离子聚合物(CS、PEI、阳离子型树状聚合物等)与siRNA形成的纳 米复合物;然后分别在阳离子聚合物与siRNA标记上荧光探针,构成FRET 体系,根据FRET效率变化即可获得siRNA在细胞外、细胞内、或动物体内 的释放情况。

    说明书

    说明书测定CP装载siRNA体系中siRNA释放的方法
    技术领域
    本发明属于药物分析领域,具体涉及一种实时测定阳离子聚合物(Cationic  Polymeric,CP)装载siRNA体系中siRNA释放的方法。
    背景技术
    小干扰RNA(siRNA)由21~23个碱基对构成,可在细胞质中特异性与其 碱基对互补的信使RNA(mRNA)结合并使其经核酸酶降解,从而阻断其编码蛋 白质的表达,即通过RNA干扰(RNAi)实现基因沉默。因此,siRNA作为药 物在癌症和流感、炎等病毒感染疾病治疗领域有重要科学意义和应用价值。然 而,荷负点的亲水性siRNA难以跨越表面负电的疏水性细胞膜,易被核酸酶降 解及快速从血液循环中清除。因此需要安全高效的载体释放系统?;げ⒏咝г?送进入细胞发挥功能。
    理想的siRNA载体应具有高效、稳定,并且无毒、靶向性好等特点。siRNA 载体主要分为病毒型和非病毒型两种。病毒型siRNA载体虽然转染效率高,但 同时具有免疫原性、潜在的致瘤性,且装载容量有限、成本高等缺陷而限制其 应用。因此,非病毒型载体的应用受到重视。
    阳离子聚合物作为非病毒siRNA载体的一类,其转导效率虽低于病毒载体, 但因其具有无免疫原性、低毒、装载容量大、制备容易等优势而引起广泛关注。 阳离子聚合物所携带正电荷,可与带负电荷siRNA通过静电相互作用,自聚集 形成纳米结构复合体系,无需使用有机溶剂及超声处理,减少对核酸损伤。
    阳离子聚合物装载siRNA进入细胞,即要在siRNA进入细胞前保持复合状 态的稳定而避免siRNA提前释放而遭核酸酶降解;同时还要求载体到达细胞质 后及时释放siRNA而发挥基因沉默功能。无论siRNA递送过程中释放过早或过 晚,都会降低最终基因沉默效果。因此,明确siRNA释放过程对提高阳离子聚 合物载siRNA体系的基因沉默效果有重要意义。实际操作中siRNA浓度极低, 一般低于50nM,同时游离siRNA与处于复合态的siRNA亦极难分离,最终导 致常规方法无法检测siRNA释放过程。
    移荧光共振能量转移(FRET)是指两个荧光发色基团在足够靠近时,当供 体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的电子能态,在该电子回到基态 前,通过偶极子相互作用,实现了能量向邻近的受体分子转移(即发生能量共 振转移)。产生FRET的条件(附图1)主要有三个:(1)供体与受体间在合适 的距离(1~10nm);(2)供体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠,这 是能量匹配的条件;(3)供体与受体的偶极具一定的空间取向,这是偶极-偶 极耦合作用的条件。
    FRET的效率用E表示,E值可由以下几种方式测定:用荧光强度表征(E=1- IDA/ID,IDA表示A存在时D的荧光强度);用量子产率表征(E=1-φDA/φD); 用荧光寿命表征(E=1-τDA/τD)。这表示研究FRET可以通过不同的实验设备, 既可以用普通光谱仪测定其荧光强度、量子产率,也可以用时间分辨仪测定其 荧光寿命。随着成像技术的发展,用显微成像的方法可更直观地观测FRET地 发生。
    由于FRET现象的效率对荧光探针间距离变化十分敏感,即两种荧光物质 间距变化即导致FRET效率变化。阳离子聚合物载siRNA FRET体系中,siRNA 释放过程伴随FRET探针的分离及FRET效率的降低。因此体系FRET效率降 低曲线即为siRNA释放曲线。
    Christopher A.Alabi等人将分别标记了AlexaFluor594(荧光供体)与 AlexaFluor647(荧光受体)的siRNA共同装载入PEI纳米复合物中(Christopher  A.Alabi,Kevin T.Love,Gaurav Sahay,et al.FRET-Labeled siRNA Probes  forTracking Assembly and Disassembly of siRNANanocomplexes[J].ACS Nano,6 (2012):6133-6141)。当siRNA处于复合态时,两种荧光分子间发生FRET现象, 而随着siRNA释放,这种FRET效率逐渐减弱。文中比较了三种载体装载siRNA 在细胞内的释放过程:b-PEI组几乎不见siRNA释放,C14-113组siRNA于2 小时内快速释放;而ND98组可在6小时内几乎保持相同的释放速率。
    Shan Jiang and Yong Zhang将BOBO-3标记的siRNA装载于上转换量子点 上构成FRET体系(Shan Jiang and Yong Zhang,Upconversion Nanoparticle-Based  FRET System for Study of siRNAin Live Cells[J].Langmuir,26(9), 2010:6689-6694),通过FRET效率变化曲线得出载体在SK-BR-3细胞中20小 时内释放完全。
    发明内容
    本发明的目的在于提供一种实时测定阳离子聚合物装载siRNA体系中 siRNA释放的方法,该方法无需将释放的siRNA分离,直接检测样品荧光的变 化而得出体系FRET效率进而得出siRNA释放曲线。
    本发明阳离子聚合物装载siRNA体系中siRNA释放是利用FRET效率随探 针间距离发生改变的特性,FRET效率定义为:
    E = R 0 6 R 0 6 + R 6 - - - ( iii ) ]]>
    R0=const·κ2·n-4·φD·JDA   (iv);
    其中其中R0为Foster距离,表示某一给定供体与受体间能量转移效率为 50%时的距离;R为供体与受体的实际距离。R0可由式(iv)计算:其中κ2是 方向因素,n是溶剂的反射系数,φD是供体探针结合到阳离子聚合物的量子效 率,JDA是供体发射波长和受体吸收波长的交叠系数。由式(2)可看出R0对于 给定的给-受体是一个特征值,因此,式(iii)中E值与R的关系紧密,这也 成为了FRET用于测定siRNA释放过程的重要理论依据。体系FRET效率的降 低意味着载体与siRNA的分离,即siRNA的释放。
    由此,本发明人提出如下实时测定聚阳离子装载siRNA体系中siRNA释放 状况的方法。
    本发明提出的具体技术方案:
    选用经FRET荧光供体/受体对分子Donor/Acceptor(D/A)分别标记CP与 siRNA,即D-CP、A-siRNA或A-CP、D-siRNA;
    当标记形式为D-CP、A-siRNA时,实施方案步骤如下:
    (1)CP溶于0.5-5mL溶剂S中,使得溶液中阳离子聚合物所携带阳离子 基团浓度为1-600μM;
    (2)取体积为5μL-500μL、浓度1μM-100μM的siRNA搅拌条件下缓慢加 入步骤(1)所得溶液中,避光反应5-60分钟后得CP/siRNA复合物;
    (3)采用与步骤(1)、步骤(2)所述相同的条件和过程,不同之处是将 CP更换为D-CP,得到D-CP/siRNA复合物;采用与步骤(1)、步骤(2)所述 相同的条件和过程,将siRNA更换为A-siRNA,得到CP/A-siRNA复合物;采 用与步骤(1)、步骤(2)所述相同的条件和过程,不同之处是将CP更换为 D-CP同时将siRNA更换为A-siRNA,得到D-CP/A-siRNA复合物;
    (4)取等体积CP/siRNA、D-CP/siRNA、CP/A-siRNA、D-CP/A-siRNA复 合物分别加入到相同条件、体积为0.1-10mL溶液R,使得R中siRNA终浓度 为1-1000nM;
    (5)分别取含有CP/siRNA、D-CP/siRNA及D-CP/A-siRNA复合物体系R 0.1-2mL,测定D激发波长下,D最大发射波长处的荧光发射强度I0、ID、ID/A, 并根据公式(i)计算FRET效率E;或分别取含有CP/siRNA、CP/A-siRNA及 D-CP/A-siRNA复合物R0.1-2mL,分别测定D激发波长下,A最大发射波长处 的荧光发射强度I0、IA、ID/A,并根据公式(ii)计算FRET效率E
    E = ( I D - I 0 ) - ( I D / A - I 0 ) I D - I 0 × 100 % - - - ( i ) ]]>
    E = ( I D / A - I 0 ) - ( I A - I 0 ) I A - I 0 × 100 % - - - ( ii ) ; ]]>
    (6)每隔3分钟-24小时重复一次步骤(5),持续检测24-72小时,绘制 时间-FRET效率曲线,该曲线即为siRNA释放过程曲线。
    或者,当标记形式为A-CP、D-siRNA时,具体步骤如下:
    (1)CP溶于0.5-5mL溶剂S中,使得溶液中阳离子聚合物所携带阳离子 基团浓度为1-600μM;
    (2)取体积为5μL-500μL、浓度1μM-100μM的siRNA搅拌条件下缓慢加 入步骤(1)所得溶液中,避光反应5-60分钟后得CP/siRNA复合物;
    (3)采用与步骤(1)、步骤(2)所述相同的条件和过程,不同之处是将 CP更换为A-CP,得到A-CP/siRNA复合物;采用与步骤(1)、步骤(2)所述 相同的条件和过程,不同之处是将siRNA更换为D-siRNA,得到CP/D-siRNA 复合物;采用与步骤(1)、步骤(2)所述相同的条件和过程,不同之处是将 CP更换为A-CP同时将siRNA更换为D-siRNA,得到A-CP/D-siRNA复合物;
    (4)取等体积CP/siRNA、A-CP/siRNA、CP/D-siRNA、A-CP/D-siRNA复 合物分别加入到体积为0.1-10mL溶液R中,使得R中siRNA终浓度为1-1000nM;
    (5)分别取含有CP/siRNA、A-CP/siRNA及A-CP/D-siRNA复合物体系R 0.1-2mL,测定D激发波长下,A最大发射波长处的荧光发射强度I0、IA、ID/A, 并根据公式(ii)计算FRET效率E;或分别取含有CP/siRNA、CP/D-siRNA 及A-CP/D-siRNA复合物R0.1-2mL,分别测定D激发波长下,D最大发射波 长处的荧光发射强度I0、ID、ID/A,并根据公式(i)计算FRET效率E;
    (6)每隔3分钟-24小时重复一次步骤(5),持续检测24-72小时,绘制 时间-FRET效率曲线,该曲线即为siRNA释放过程曲线。
    作为具体解决方案的优选方案,阳离子聚合物为下列物质或其衍生物的一 种:壳聚糖(CS)、聚乙烯亚胺(PEI)、L-聚赖氨酸(PLL)、聚酰胺-胺(PAMAM)、 聚丙烯亚胺(PPI)、碳硅烷(CB)、三嗪、聚甘油等带有氨基基团的树状聚合 物。
    作为具体解决方案的优选方案,阳离子聚合物上结合的荧光探针分子与聚 合物阳离子基团摩尔比为1:500至1:10。
    作为具体解决方案的优选方案,FRET荧光供体/受体对为以下荧光供体/ 受体对或其衍生物的一种:FITC/TMR;CFP/YFP;CFP/dsRED;BFP/GFP; GFP/dsRED;YFP/dsRED;Cy3/Cy5;Alexa488/Alexa555;Alexa488/Cy3; FITC/TRITC;YFP/TRITC;YFP/Cy3;FITC/Cy3。
    作为具体解决方案的优选方案,siRNA上结合的荧光探针分子标记于 siRNA5’端,荧光探针分子与siRNA的摩尔比为1:1至1:5。
    作为具体解决方案的优选方案,所述溶剂S为水,0.01-5M pH4.5-pH6.5醋 酸-醋酸钠缓冲液,0.01-5M pH5.0-pH8.0磷酸缓冲液及0.9%氯化钠溶液中的 一种;所述释放体系R为水,0.01-5M pH4.5-pH6.5醋酸-醋酸钠缓冲液,0.01-5M pH5.0-pH8.0磷酸缓冲液,0.9%氯化钠溶液,RPMI-1640、DMEM、MEM、F12 等细胞培养液中的一种。
    作为具体解决方案的优选方案,当考察siRNA在细胞内释放过程时,权利 要求2步骤(4)应将复合物分别加入接种密度102-105细胞/cm2,培养时间5-48 小时细胞培养皿中,培养液中siRNA终浓度为1-1000nM,步骤(5)取出103-106细胞悬于0.1-2mL权利要求7中所述培养液中中用于检测;当考察siRNA在小 鼠或大鼠体内释放过程时,权利要求2步骤(4)应将复合物分别经尾静脉注射 入相同饲养条件体重15-25g的小鼠或150-250g大鼠体内,步骤(5)取出0.1-2mL 小鼠或大鼠血液用于检测。
    本发明效果如下:
    (1)本发明可实时测定阳离子聚合物装载siRNA体系siRNA释放过程, 该方法灵敏度高,重复性好。
    (2)本发明实时测定阳离子聚合物装载siRNA体系siRNA释放过程,可 用于细胞外环境模拟及细胞、动物水平实验操作。
    (3)本发明实时测定阳离子聚合物装载siRNA体系siRNA释放过程,原 位进行,无需对纳米粒分离,且检测过程不对样品产生损伤。
    附图说明
    图1.荧光共振能量转移原理图;
    图2.体系FRET效率与siRNA实际复合率关系;
    图3.FRET效率随时间变化曲线。
    具体实施方式
    实施例1:测定壳聚糖/siRNA纳米复合物siRNA装载稳定性
    (1)选用罗丹明B(RB)标记的壳聚糖(CS)RB-CS作为阳离子载体, 装载羧基荧光素(FAM)标记的siRNA(FAM-siRNA)??蔷厶欠肿恿縈w为 230KDa、脱乙酰度DD为80%,RB与壳聚糖上氨基摩尔比为1:300,FAM与 siRNA摩尔比为1:1。以无荧光标记的CS、siRNA作为对照;
    (2)称取0.002g RB-CS,溶于5mL0.2M醋酸中,并以10M NaOH调节 pH至5.5,并取出0.95mL于1mL反应瓶中。随后,将体积为50μL、浓度为 10μM FAM-siRNA缓慢加入到盛有RB-CS的反应瓶,避光搅拌反应20分钟, 即得RB-CS/FAM-siRNA,其中siRNA浓度为500nM,N/P=120;
    (3)同(2)反应条件,将FAM-siRNA替换为siRNA,反应得RB-CS/siRNA 复合物;将FAM-siRNA替换为siRNA,同时将RB-CS替换为CS,得CS/siRNA 复合物;
    (4)将(3)所得样品分别以0.2M pH5.5醋酸-醋酸钠缓冲液稀释10倍;
    (5)490nm激发下,分别测定CS/siRNA、RB-CS/siRNA及 RB-CS/FAM-siRNA所在缓冲液580nm荧光发射强度I0、IA、ID/A,并根据公式 (ii)计算该时刻FRET效率为63%;
    (6)30分钟内,每隔3分钟测定一次荧光强度并计算FRET效率,30min 后,每隔2h测定一次荧光强度并计算FRET效率,48小时后终止实验,并将 各时刻FRET效率绘制成时间-FRET效率曲线,如图3所示。结果显示CS装 载siRNA体系FRET效率24小时内几乎保持恒定,48小时内略有降低,说明 CS装载siRNA有良好的稳定性。
    实施例2:测定壳聚糖/siRNA纳米复合物在溶菌酶作用下siRNA释放特性
    (1)选用荧光素异硫氰酸酯(FTIC)标记的壳聚糖(CS)FITC-CS作为 阳离子载体,装载四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)标记的siRNA (TRITC-siRNA)??蔷厶欠肿恿縈w为230KDa、脱乙酰度DD为80%,RB 与壳聚糖上氨基摩尔比为1:300,FAM与siRNA摩尔比为1:2。无荧光标记的 CS、siRNA作为对照;
    (2)称取0.005g FITC-CS,溶于5mL0.5M醋酸中,并以10M NaOH调 节pH至5.0,并取出0.98mL于1mL反应瓶中。随后,将体积为20μL、浓度 为50μM TRITC-siRNA缓慢加入到盛有FITC-CS的反应瓶,避光搅拌反应10 分钟,即得FITC-CS/TRITC-siRNA,其中siRNA浓度为1000nM,N/P=150;
    (3)同(2)反应条件,将TRITC-siRNA替换为siRNA,反应得FITC-CS/ siRNA复合物;将FITC-CS替换为CS,同时将TRITC-siRNA替换为siRNA, 得CS/siRNA复合物;
    (4)将(3)所得样品分别加入等体积含浓度为2mg/mL溶菌酶的0.5M Ph5.0缓冲液中;
    (5)490nm激发下,分别测定CS/siRNA、FITC-CS/siRNA及 FITC-CS/TRITC-siRNA所在缓冲液520nm荧光发射强度I0、ID、ID/A,并根据 公式(i)计算该时刻FRET效率为56%;
    (6)30分钟内,每隔10分钟测定一次荧光强度并计算FRET效率,30min 后,每隔4h测定一次荧光强度并计算FRET效率,48小时后终止实验,并将 各时刻FRET效率绘制成时间-FRET效率曲线,如图3所示。结果显示CS装 载siRNA体系加入溶菌酶后FRET效率30分钟内急剧下降至初始水平的75%, 随后下降速度减慢,48小时约降至初始值的50%。
    实施例3:测定PEI/siRNA纳米复合物在细胞内siRNA释放特性
    (1)选用Cy3标记的聚乙烯亚胺Cy3-PEI作为载体,装载Cy5标记的 siRNA(siRNA),PEI分子量Mw为25KDa,Cy3与PEI上氨基摩尔比为1:500, Cy5与siRNA摩尔比为1:1,无荧光标记的CS、siRNA作为对照;
    (2)称取0.005g Cy3-PEI,溶于5mL pH7.40.2M磷酸盐缓冲液中,并取 出8μL于1mL反应瓶中,并加入972μL pH7.40.2M磷酸盐缓冲液搅拌均匀。 随后,将体积为20μL、浓度为20μM Cy5-siRNA缓慢加入到盛有Cy3-PEI的反 应瓶中,避光搅拌反应10分钟,即得Cy3-PEI/Cy5-siRNA,其中siRNA浓度 为400nM,N/P=10;
    (3)同(2)反应条件,将Cy5-siRNA替换为siRNA,反应得Cy3-PEI/siRNA 复合物;将Cy3-PEI替换为PEI,同时将Cy5-siRNA替换为siRNA,得PEI/siRNA 复合物;
    (4)小鼠黑色素瘤细胞(B16-F10)提前24小时接种入24孔板中,每孔 接种细胞数为2×104,培养液为含10%新生牛血清RPMI-1640培养液500μL。 三块孔板分成三组,(2)、(3)所得三种复合物分别加入一组孔板中,每孔复合 物体积为60μL。转染5小时后更换新鲜培养继续培养;
    (5)各组孔板分别取三孔,细胞消化后以PBS清洗并重悬于0.1mL PBS 中。测定550nm激发下,三组样品对应PEI/siRNA、Cy3-PEI/siRNA及 Cy3-PEI/Cy5-siRNA复合物570nm处荧光发射强度I0、ID、ID/A,并根据公式(i) 计算该时刻FRET效率;
    (6)步骤(5)所得结果即为0小时,并分别在2h、4h、8h、12h、24h、 48h重复(5)操作,并绘制每隔5h测定一次荧光强度并计算FRET效率,48 小时后终止实验,并将各时刻FRET效率绘制成时间-FRET效率曲线,结果显 示PEI装载siRNA在细胞中48小时内siRNA释放速率均十分缓慢。

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