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    饲料 二甲 氧苄氨 嘧啶 三甲氧苄氨 甲基 检测 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201510062080.8

    申请日:

    2015.02.05

    公开号:

    CN104678040A

    公开日:

    2015.06.03

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 30/88申请日:20150205|||公开
    IPC分类号: G01N30/88 主分类号: G01N30/88
    申请人: 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所
    发明人: 李剑勇; 杨亚军; 刘希望; 李冰
    地址: 730000甘肃省兰州市七里河区小西湖硷沟沿335号
    优先权:
    专利代理机构: 北京中恒高博知识产权代理有限公司11249 代理人: 夏晏平
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201510062080.8

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2017.01.11|||2015.07.01|||2015.06.03

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的检测方法,使用混合酸性流动相进行洗脱,使二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶在色谱柱上分离,进行串联质谱检测。本发明使用的混合酸性流动相等度洗脱,同时使二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶在C18色谱柱上分离,采用串联三重四极杆质谱作为检测器,满足一次性同时定性、定量检测饲料样品中多种抗菌增效剂的要求,样品前处理简单,检测结果准确可靠。具体可参见实施例中的实验分析。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的检测方法,其特征在于:使用混合酸性流动相进行洗脱,使二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶在色谱柱上分离,进行串联质谱检测。

    2.  根据权利要求1所述的饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的检测方法,其特征在于:所述流动相为甲醇与0.2%的甲酸水溶液以体积比2 : 8混合所得。

    3.  根据权利要求1所述的饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的检测方法,其特征在于:采用等度洗脱的方式进行色谱柱分离。

    4.  根据权利要求1所述的饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的检测方法,其特征在于:色谱分离时,流速为0.3 ml/min,柱温为40 ℃,进样量为5 μl。

    5.  根据权利要求1所述的饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的检测方法,其特征在于:所述串联质谱检测的条件为:离子源为ESI+,喷雾器压力35 psi,毛细管电压为+4000 V,电子倍增器电压增加值为+300V,干燥气温度为350 ℃,干燥气流速为11 L/min ,进行多重离子反应监测。

    说明书

    说明书饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的检测方法
    技术领域
    本发明涉及一种一次性同时测定多种抗菌增效剂的方法,属于药物的检测领域。
    背景技术
    四氢叶酸作为一碳转移酶的辅酶,在机体的代谢中发挥着巨大的作用。细菌等一些 病原微生物不能利用外源性的叶酸,需要以对氨基苯甲酸等为底物在二氢叶酸合成酶的 作用下,生成二氢叶酸;再在二氢叶酸还原酶的作用下生成四氢叶酸?;前防嘁┪镉攵?氨基苯甲酸结构相似,可以干扰细菌等病原微生物的二氢叶酸合成。二甲氧苄氨嘧啶(亦 称二甲氧苄啶,diaveridine,DVD,CAS:5355-16-8)、三甲氧苄氨嘧啶(亦称甲氧苄啶, trimethoprim,TMP,CAS:738-70-5)和二甲氧甲基苄氨嘧啶(亦称二甲氧甲基苄啶, ormetoprim,OMP,CAS:6981-18-6)被称作抗菌增效剂,能抑制二氢叶酸还原酶,使 二氢叶酸不能还原为四氢叶酸,从而妨碍核酸和蛋白质的合成。DVD等与磺胺类药物 合用时,可以从两个不同的环节阻断病原微生物的叶酸合成代谢,使磺胺类药物的疗效 显著增强,因此常与磺胺类药物混合添加于猪、禽饲料中,用于肠道感染的治疗和球虫 病的防治。该类药物还能与其他抗菌药物、抗球虫药物,以及中草药等联用,增强其药 效。
    DVD与其他磺胺类药物配伍添加于配合饲料中,仅作为治疗药物用于猪肠道感染 和鸡球虫病的防治,而TMP和OMP则禁止添加于动物饲料中。该类药物理化性质稳定, 能通过食物链在动物体内长期存在而造成危害,农业部公告第235号中对动物性食品中 TMP的最高残留限量(MRL)做了如下规定:牛、猪、禽、鱼,50μg/kg;马,100μg/kg; 日允许摄入量(ADI)为0~4.2μg/kg。该类药物在广泛应用的同时,许多国家对饲料 中该类药物的添加量有着严格规定。如农业部公告第168号中磺胺喹噁啉二甲氧苄啶预 混剂,用于禽球虫病的治疗,其中DVD在配合饲料中的添加量为20mg/kg;再如《中 国兽药典兽药使用指南——化学药品卷》中磺胺对甲氧嘧啶二甲氧苄啶预混剂,用于猪 胃肠道细菌感染和鸡球虫病的治疗,其中DVD在配合饲料中的添加量为40mg/kg。为 了有效地监测和控制饲料中该类药物的添加量,急需开发一个准确、高效和简便的分析 方法。
    发明内容
    本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷,提供了一种准确、高效和简便的同时 一次性分析检测饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的含量 的方法。
    本发明的目的通过以下技术方案来具体实现:
    一种饲料中二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨嘧啶的检测方法, 使用混合酸性流动相进行洗脱,使二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶和二甲氧甲基苄氨 嘧啶在色谱柱上分离,进行串联质谱检测。
    优选的,所述流动相为甲醇与0.2%的甲酸水溶液以体积比2:8混合所得。
    优选的,采用等度洗脱的方式进行色谱柱分离。
    优选的,色谱分离时,流速为0.3ml/min,柱温为40℃,进样量为5μl。
    优选的,所述串联质谱检测的条件为:离子源为ESI+,喷雾器压力35psi,毛细管 电压为+4000V,电子倍增器电压增加值为+300V,干燥气温度为350℃,干燥气流速 为11L/min,进行多重离子反应监测。
    本发明所分析的饲料样品为配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料。
    本发明使用的混合酸性流动相等度洗脱,同时使二甲氧苄氨嘧啶、三甲氧苄氨嘧啶 和二甲氧甲基苄氨嘧啶在C18色谱柱上分离,采用串联三重四极杆质谱作为检测器,满 足一次性同时定性、定量检测饲料样品中多种抗菌增效剂的要求,样品前处理简单,检 测结果准确可靠。不同品种的饲料中,DVD、TMP和OMP的添加量分别为20μg/kg 时,DVD、TMP和OMP定量离子的信噪比SNR均大于3(按照峰高对峰高计),表明 方法的检测限可至20μg/kg,即0.02mg/kg。不同品种的饲料中,DVD、TMP和OMP 的添加量分别为40μg/kg时,DVD、TMP和OMP定量离子的信噪比SNR均大于10(按 照峰高对峰高计),表明方法的检测限可至40μg/kg,即0.04mg/kg。不同品种的饲料中, 添加不同量的各化合物,回收率均在70%~120%的范围内,批内和批间的变异系数均 小于20%。具体可参见实施例中的实验分析。
    附图说明
    图1为配合饲料中DVD、TMP和OMP的分离色谱图,其中第一个色谱峰为DVD, 第二个色谱峰为TMP,第三个色谱峰为OMP。
    具体实施方式
    以下对本发明的优选实施例进行说明,应当理解,此处所描述的优选实施例仅用于 说明和解释本发明,并不用于限定本发明。
    实施例1:
    一、色谱分离和质谱检测条件
    色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18(3.0mm×100mm,1.8μm);在线预过滤芯(4mm, 5μm,GRACE,USA),流动相为甲醇-0.2%甲酸水溶液(20:80,v/v),等度洗脱,流速 0.3ml/min,柱温40℃,进样量5μl。
    离子源为ESI+,喷雾器压力35psi,毛细管电压为+4000V,电子倍增器电压增加 值(Delta EMV)为+300V,干燥气温度为350℃,干燥气流速为11L/min(N2),进行 多重离子反应监测(MRM),具体参数见表1。
    表1 各化合物的MRM参数及特征离子对

    注:*,为定量离子
    二、标准曲线的建立
    分别精确称取DVD、TMP和OMP标准品约0.01g于不同的50mL烧杯中,用流 动相(甲醇-0.2%甲酸溶液,20+80)溶解后,转移到10mL容量瓶中,用流动相定容 至刻度,混匀,配制成质量浓度为1mg/mL的DVD、TMP和OMP单个标准储备溶液。 4℃条件下贮藏。分别准确吸取1mL上述单个标准储备溶液,于同一100mL容量瓶中, 以流动相稀释并定容至刻度,摇匀,即为质量浓度为10μg/mL的混合标准储备溶液; 准确吸取混合标准储备溶液2mL于10mL容量瓶中,以流动相稀释至刻度,摇匀,即 为质量浓度为2μg/mL的混合标准工作溶液;准确吸取2μg/mL的混合标准工作溶液2 mL于10mL容量瓶中,以流动相稀释至刻度,摇匀,即为质量浓度为400ng/mL的混 合标准工作溶液;同法依次连续进行4次5倍稀释,制得DVD、TMP和OMP质量浓 度均为80ng/mL、16ng/mL、3.2ng/mL和0.64ng/mL的混合标准工作溶液。在上述色 谱和质谱条件下检测,以定量离子的峰面积与浓度进行线性回归。
    各化合物的标准曲线及线性范围见表2。结果表明各化合物在对应的浓度范围内线 性关系良好。
    表2 各化合物的标准曲线及线性范围

    三、饲料样品的提取与净化
    称取一定量的试样(配合饲料2g,浓缩饲料和预混合饲料各1g,精确至0.001g), 置于50mL塑料离心管内,加1mol/L的乙酸钠溶液10mL,盖好密封盖涡旋混合1min, 加入二氯甲烷20mL,盖好密封盖涡旋混合2min,水浴超声30min,每隔10min涡旋 一次,每次2min。取出后,1800g离心分离15min。用注射器吸取下层的二氯甲烷提 取液8mL于10mL离心管中,1800g离心分离10min,小心吸取再次离心过的二氯甲 烷提取液2mL于另一10mL离心管中,40℃条件下氮气吹至近干,加入甲醇-0.2%甲 酸混合溶液(20+80,流动相)1mL,水浴超声使残渣完全溶解,再加入2mL正己烷, 涡旋混合1min,1800g离心10min,弃去正己烷层;下层水相用正己烷重复洗涤1次。 经孔径为0.22μm滤膜过滤,得样品滤液,按照步骤一中的方法上机检测。配合饲料中 添加DVD、TMP和OMP的标准品,分离效果见图1。
    四、检测限和定量限
    实验1 检测限
    添加DVD、TMP和OMP含量分别为100ng/mL的标准溶液400μL于2g配合饲 料中(即各化合物的添加浓度为20μg/kg);添加100ng/mL的标准溶液200μL于1g 浓缩饲料和预混合饲料中(即各化合物的添加浓度为20μg/kg);于40℃条件下烘干, 按照步骤三所述方法处理样品,按照步骤一中方法上机检测。
    实验结果  不同品种的饲料中,DVD、TMP和OMP的添加量分别为20μg/kg时, 按照前述方法提取、净化后测定,DVD、TMP和OMP定量离子的信噪比SNR均大于 3(按照峰高对峰高计),表明方法的检测限可至20μg/kg,即0.02mg/kg。
    实验2 定量限
    添加DVD、TMP和OMP含量分别为100ng/mL的标准溶液800μL于2g配合饲 料中(即各化合物的添加浓度为40μg/kg);添加100ng/mL的标准溶液400μL于1g 浓缩饲料和预混合饲料中(即各化合物的添加浓度为40μg/kg);于40℃条件下烘干, 按照步骤三所述方法处理样品,按照步骤一所述方法上机检测。
    实验结果  不同品种的饲料中,DVD、TMP和OMP的添加量分别为40μg/kg时, 按照前述方法提取、净化后测定,DVD、TMP和OMP定量离子的信噪比SNR均大于 10(按照峰高对峰高计),表明方法的检测限可至40μg/kg,即0.04mg/kg。
    五、添加回收检测实验
    分别称取一定量的DVD、TMP和OMP,添加于同一不同品种的空白饲料样品中, 于研钵中搅拌均匀,配制成高浓度的样品;再称取一定量的高浓度样品,用空白饲料逐 步稀释成中、低浓度的样品。配制成配合饲料样品中DVD、TMP和OMP的低、中、 高添加浓度分别为0.04mg/kg、20mg/kg和100mg/kg;浓缩饲料为100mg/kg;预混合 饲料为500mg/kg。按照步骤三所述方法处理样品,每批次内同一浓度做5次平行实验, 进行3次重复。对浓度较高样品的提取液进行适当地稀释后,使其浓度在步骤二的标准 曲线的线性范围内,按照步骤一所述方法上机检测。计算加样回收率及批内和批间变异 系数。
    实验结果  不同品种的饲料中,添加不同量的各化合物,回收率均在70%~120% 的范围内,批内和批间的变异系数均小于20%。结果见表3。
    表3 加样回收率实验结果

    以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施 例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施 例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的 精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的?;し段?之内。

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