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    重庆时时彩的遗漏数值: 一种多通道微流控固相萃取质谱联用装置及制备方法.pdf

    关 键 词:
    一种 通道 微流控固相 萃取 联用 装置 制备 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201510119706.4

    申请日:

    2015.03.18

    公开号:

    CN104698064A

    公开日:

    2015.06.10

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 27/62申请日:20150318|||公开
    IPC分类号: G01N27/62 主分类号: G01N27/62
    申请人: 青岛大学
    发明人: 赵凯; 王宗花; 夏建飞; 张菲菲; 刘正晓
    地址: 266071山东省青岛市市南区宁夏路308号
    优先权:
    专利代理机构: 济南圣达知识产权代理有限公司37221 代理人: 杨琪; 崔苗苗
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201510119706.4

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2015.12.02|||2015.07.08|||2015.06.10

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种多通道微流控-固相萃取-质谱联用装置及制备方法,所述联用装置包括微流控芯片和质谱仪;所述微流控芯片设置有上下两层通道,上层通道为细胞培氧通道,上层通道两端分别设置有垂直孔和水平孔,下层通道为化学吸氧通道,下层通道两端分别设置有多组垂直孔、上下两层通道通过一层PDMS膜相连,所述上层通道的一侧填充有C18球形颗粒,形成填充柱,所述上层通道的水平孔与质谱仪相连??梢酝惫鄄煜赴诓煌跗肪诚碌纳硇形?,可以一次性实现对照实验、多浓度梯度平行刺激以及多区域检测。经固相萃取芯片分离富集,质谱实时检测,更直观更准确检测细胞代谢物,为研究肿瘤细胞缺氧提供理论依据。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种多通道微流控-固相萃取-质谱联用装置,其特征在于:所述联用装置包括微流控 芯片和质谱仪;所述微流控芯片设置有上下两层通道,上层通道为细胞培养通道,上层通道 两端分别设置有细胞培养通道的出入孔和下层化学吸氧通道的出入孔,下层通道为化学吸氧 通道,所述化学吸氧通道内设置有化学吸氧剂,形成特定氧气浓度,上下两层通道通过一层 透气膜相连;所述芯片通道导管与填充球型C18颗粒的固相萃取芯片入口相连,固相萃取芯片 出口则通过石英毛细管与质谱仪相连。

    2.  如权利要求1所述的多通道微流控-固相萃取-质谱联用装置,其特征在于,所述下层通 道为八个通道的阵列。

    3.  如权利要求2所述的多通道微流控-固相萃取-质谱联用装置,其特征在于,所述的八 个通道内填充有不同浓度的邻苯三酚溶液。

    4.  一种多通道微流控-固相萃取-质谱联用装置的制作方法,其特征在于,
    (1)设计和绘制微通道图案,并打印到透明胶片上;
    (2)通过光刻刻蚀技术将上述图案转移到设定厚度的SU-8负光胶的硅基片模板上,并制 得微流控芯片基材凸面;
    (3)将PDMS的A胶和B胶混合液浇筑于周围有围堰的微流控芯片基材凸面上,真空脱气、烘 干、固化后,形成PDMS盖片;
    (4)将PDMS混合液倒在2寸硅片上,覆盖硅片面积的二分之一,硅片置于匀胶机上,设 置匀胶机Ⅰ速600转/秒,时间9s,Ⅱ速1000转/秒,时间20s,烘干可得100微米厚的PDMS薄膜;
    (5)将上层PDMS盖片打孔后,与PDMS薄膜永久性键合,形成封闭微通道,之后再将氢氧化 钠入口和邻苯三酚溶液的入口及出口打孔,再与下层芯片键合即可得到微流控芯片;
    (6)将C18悬浮液注入固相萃取芯片中,利用芯片出口的楔形结构拦截C18球形颗粒并使 其在通道中聚集,形成填充柱,
    (7)芯片出口通过石英毛细管导入质谱,即得。

    5.  权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤(3)中,所述PDMS的A胶和B胶混合液中,A 胶和B胶的质量比为10:1。

    6.  权利要求4所述的方法,其特征在于,步骤(6)中,所述C18悬浮液中C18球形颗粒与 甲醇的质量比为1:200。

    说明书

    说明书一种多通道微流控-固相萃取-质谱联用装置及制备方法
    技术领域
    本发明属于生物化学领域,特别涉及一种多通道微流控-固相萃取-质谱联用装置及制备方法。
    背景技术
    近年来,微流控芯片技术在细胞研究中不断获得新的应用和尝试。由于细胞内的生化反应通常为超微量和毫秒级,要求检测的高选择性、高灵敏度、快速响应和超小体积。在最初的微流控芯片-细胞研究中,荧光和电化学检测常被用于已知或特定的一种或几种目标分子的检测,可以聚焦到几十微米直径的荧光激发光斑或微电化学电极能够很好地与芯片上的微检测区域耦合,实现高灵敏度检测。但是,细胞的化学成分复杂,一个生化反应通常伴随多种物质的转化和代谢。如何从复杂的干扰基质中快速地甄别出目标分子,检测方法除了高灵敏度外,还需要兼具高通量和高分辨的能力。质谱检测,依据质荷比的不同能一次性检测多种化合物,检测范围可涵盖大部分的生物小分子、多肽、蛋白质、酶和核酸等,已成为生物分析最重要的检测手段。近年来,快速发展的高分辨质谱技术具有fmol级的灵敏度和每秒数百张全谱扫描速度,能很好地监测细胞内瞬间的微量组分变化。同时,高分辨质谱的精确质量数测定可进行母离子和碎片离子的元素组成推测,通过中性丢失扫描进行多级碎片离子的原药物溯源,这是其他检测方法所无法比拟的。微流控芯片-质谱联用技术使细胞药物代谢研究和细胞间信号传递的研究深化到分子水平,虽然仅是初步研究阶段,但其已显示出独特优势。微流控芯片-质谱联用系统进行活体细胞研究时,最大限度地减少培养液中复杂成分和高浓度盐分对电离的影响,是准确获取细胞细微生化信息变化的关键。
    在微流控芯片中细胞代谢物的检测已经开发出大量的新技术和新方法,针对不同的检测对象,需要采用不同的检测手段。较为直观的一类方法是荧光成像技术。微流控芯片大多是透明材料,将待测代谢物直接进行荧光标记后,使用荧光显微镜进行分析。广泛使用的蛋白质分析检测方法是免疫分析,利用免疫亲和原理从复杂基质中快速富集目标物质,利用芯片集成化的优势对细胞代谢物进行高通量的检测。然而这些方法在细胞研究中检测灵敏度和精度都不高。质谱是目前用于分析有机物最为理想的检测器,灵敏度高,用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定,因此它也成为生命科学中进行分析研究的重要手段之一。特别是对小分子和生物大分子的定性分析中,不仅能够提供分子结构的信息,而且在 需要的时候还可以进行半定量的检测。因此微流控-质谱联用应用于细胞研究已引起广泛关注。
    目前,在低氧环境中研究细胞行为的方法包括缺氧工作站及缺氧小室,但是这些方法不能形成氧气浓度梯度。为了满足该需要,各种微流体装置已经被开发用于严格控制氧含量。微流控技术为研究低氧的微环境提供优秀平台。在微流控装置中,最直接最普遍的方法调控氧气浓度是通过扩散实现的,这种扩散是从流体源或控制通道使气体透过薄的透气性好的PDMS膜,从而制造在不同的低氧微环境中。流体源可以是液体也可以是气体。流体源是液体时,需要先平衡流体中的气体含量。先将流体进行氮吹,使流体中的氧气含量稳定,在连续通入芯片中,进而在芯片中得到理想的低氧环境。但是这种方法不能得到准确有效的数据,由于PDMS良好的气透性,通道中的流体会与芯片外空气中的气体重新达到一个平衡。气体流则不需要考虑这种再平衡的弊端。气体灌入的方便与简便是研究人员希望可以完成更复杂的实验内容。但是气体控制需要复杂的芯片设计和精确的控制,需要外揭气瓶,操作繁琐。在细胞培养时,细胞在静态培养基中消耗的氧气足以产生低氧微环境,这种低氧为环境跟细胞的密度和代谢速度密不可分。然后细胞的生长状态并不是一致的,这导致芯片中的代谢速度不一样,再加上细胞的密度容易出现较大的误差,这种方法的重复性差。微流控装置中的氧气浓度可以通过芯片上发生的化学反应来调控,这主要是通过消耗少量的化学试剂产生或者消耗氧气从而实现芯片管道内的氧浓度梯度。这种方法不需要大型的高压气瓶、复杂的气体连接设备以及繁琐的流体控制系统,而直接利用除氧剂来在芯片内实现氧浓度梯度。
    发明内容
    本发明搭建了一种微流控-质谱联用装置,构建缺氧微环境模型。微流控芯片通过固相萃取分离芯片与质谱连接。固相萃取分离芯片可以对细胞代谢物进行除盐、分离、富集等操作。微流控芯片质谱联用不仅可以考察细胞的代谢行为,还可以对细胞代谢物进行半定量测定。首先,在微流控芯片上利用化学吸氧反应形成氧气浓度梯度。芯片设有八通道的阵列,构造的氧气浓度梯度范围广,可以同时观察细胞在不同氧气环境下的生理行为可以一次性实现对照实验、多浓度梯度平行刺激以及多区域检测。经固相萃取芯片分离富集,质谱实时检测,更直观更准确检测细胞代谢物,为研究肿瘤细胞缺氧提供理论依据。
    为实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
    一种多通道微流控-固相萃取-质谱联用装置,所述联用装置包括微流控芯片和质谱仪;所述微流控芯片设置有上下两层通道,上层通道为细胞培养通道,上层通道两端分别设置有 细胞培养通道的出入孔和下层化学吸氧通道的出入孔,下层通道为化学吸氧通道,所述化学吸氧通道内设置有化学吸氧剂,形成特定氧气浓度,上下两层通道通过一层透气膜相连。所述芯片通道导管与填充球型C18颗粒的固相萃取芯片入口相连,固相萃取芯片出口则通过石英毛细管与质谱仪相连。
    优选的是,所述下层通道为八个通道的阵列
    更优选的是,所述的八个通道内填充有不同浓度的邻苯三酚溶液。每个通道都与1M的氢氧化钠溶液混合,以形成不同氧浓度的微环境。
    本发明还提供了一种多通道微流控-固相萃取-质谱联用装置的制作方法,包括如下步骤:
    (1)设计和绘制微通道图案,并打印到透明胶片上;
    (2)通过光刻刻蚀技术将上述图案转移到设定厚度的SU-8负光胶的硅基片模板上,并制得微流控芯片基材凸面;
    (3)将PDMS的A胶和B胶混合液浇筑于周围有围堰的微流控芯片基材凸面上,真空脱气、烘干、固化后,形成PDMS盖片;
    (4)将PDMS的A胶和B胶混合液倒在2寸硅片上,覆盖硅片面积的二分之一,硅片置于匀胶机上,设置匀胶机Ⅰ速600转/秒,时间9s,Ⅱ速1000转/秒,时间20s,烘干可得100微米厚的PDMS薄膜。
    (5)将上层PDMS盖片打孔后,与PDMS薄膜永久性键合,形成封闭微通道,之后再将氢氧化钠入口和邻苯三酚溶液的入口及出口打孔,再与下层芯片键合即可得到微流控芯片; 
    (6)将C18悬浮液注入固相萃取芯片中,利用芯片出口的楔形结构拦截C18球形颗粒并使其在通道中聚集,形成填充柱,
    (7)芯片出口通过石英毛细管导入质谱,即得。
    优选的是,步骤(3)中,所述PDMS的A胶和B胶混合液中,A胶和B胶的质量比为10:1。
    优选的是,步骤(6)中,所述C18悬浮液中C18球形颗粒与甲醇的质量比为1:200。
    本发明的有益效果:
    本发明搭建了一种微流控-质谱联用装置,构建缺氧微环境模型。微流控芯片通过固相萃取分离芯片与质谱连接。固相萃取分离芯片可以对细胞代谢物进行除盐、分离、富集等操作。微流控芯片质谱联用不仅可以考察细胞的代谢行为,还可以对细胞代谢物进行半定量测定。首先,在微流控芯片上利用化学吸氧反应形成氧气浓度梯度。芯片设有八通道的阵列,构造的氧气浓度梯度范围广,可以同时观察细胞在不同氧气环境下的生理行为可以一次性实现对照实验、多浓度梯度平行刺激以及多区域检测。经固相萃取芯片分离富集, 质谱实时检测,更直观更准确检测细胞代谢物,为研究肿瘤细胞缺氧提供理论依据。
    附图说明
    图1芯片设计图,其中,a上层芯片结构,b为下层芯片。其中1位氢氧化钠入口,2为8个邻苯三酚入口,3为8个细胞培养通道,4为氢氧化钠和邻苯三酚混合液出口,5为氢氧化钠与不同浓度的邻苯三酚溶液混合后形成不同氧气浓度的区域。
    图2固相萃取柱设计图。
    图3氧气浓度CO2与荧光强度I的关系。
    图4氧气浓度与邻苯三酚浓度的关系。
    图5微流控芯片-质谱联用装置的一个操作单元示意图。
    图6微流控芯片-质谱联用装置实物图。
    具体实施方式
    以下通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规的方法和条件进行选择。
    实施例:
    1、仪器和试剂 
    Sylard 184聚二甲基硅氧烷(PDMS,包括A胶PDMS预聚物和B胶固化剂,道康宁公司,美国),邻苯三酚(国药集团化学试剂有限公司),NaOH(北京化工厂),甲醇(北京化工厂),无水乙醇(北京化工厂),三(4,7-联苯-1,10菲咯啉)二氯化钌(II)复合物(sigma),C18填料(天津艾杰儿公司),石英毛细管(河北永年锐沣公司),硅基片SU-8阳膜(北京博奥生物有限公司),荧光显微镜(IX81,OLYMPUS),KW-4A型匀胶机(中国科学院微电子研究所),实验所用水和溶液配置所需纯水由Milli-Q超纯水系统(Millipore,美国)制备。
    2、芯片设计和制作
    (1)缺氧模型芯片:芯片主要有三个结构单元:上层芯片是细胞培氧通道和下层芯片通道入口和出口以及中间的一层透气性较好的PDMS膜。下层为化学吸氧通道,为八个通道的阵列。共有9个入口和1个出口,9个入口中1个氢氧化钠入口和8个邻苯三酚入口。中间一层为100μm厚的PDMS膜。芯片设计尺寸:上下两层高都为100μm,细胞培养通道宽1mm,长1cm,下层芯片,蛇形通道左侧通道宽500μm,蛇形通道宽100μm,氧气浓度梯度区域宽1.5mm,剩余部分宽1mm。
    (2)PDMS膜的制备:在两英寸圆形单抛硅片上导入约1g的PDMS预聚物和固化剂混合液(按10:1混合),设置匀胶机第一档转速600转/秒,运行9秒,第二档转速1000转/秒, 运行20秒,然后将硅片放入烘箱烘干即可。
    (3)微流控芯片制作
    用AutoCAD 2010绘制微通道图案,再将图案打印到透明胶片上,然后采用标准光刻技术将图案转移到设定厚度的SU-8负光胶的硅基片模板上,坚膜后即形成由凸起SU-8构成的图案。将PDMS的A胶和B胶按照A:B=10:1的质量比混合均匀,浇注到水平放置的周围有围堰的SU-8阳膜上,常温下真空脱气15分钟后,于70℃烘箱中加热2小时左右,直至刚好固化后取出、切割和剥离PDMS,然后用空心不锈钢微针分别在入口和出口处打孔。将上层PDMS厚片(盖片)与PDSM薄膜放入等离子清洗机中,真空80s,紫外辉光100s,再拿出PDMS厚片(盖片)与PDMS薄膜进行永久性键合,形成封闭微通道,然后将氢氧化钠与邻苯三酚入口和出口打孔,同样的操作再与下层PDMS键合,即完成整个微流控芯片的制作。
    3、填充柱制备 
    利用上述相同的操作步骤将PDMS盖片与玻璃基底键合,制作固相萃取芯片,所述固相萃取芯片设计如图2所示,芯片一端逐渐变细,由1mm变为30μm。主要通道长2.25cm,芯片宽1mm。然后,称取5mg C18球形颗粒溶于1ml甲醇中,制备C18悬浮液。将C18悬浮液注入芯片中,由于芯片出口的楔形结构会拦截C18球形颗粒并使其在通道中聚集,进而制备填充柱。
    4、芯片上氧气浓度梯度的测定与表征
    (1)氧气敏感荧光指示剂
    为了直观准确地测定芯片通道内的氧气浓度,采用对氧气敏感的荧光指示剂三(4,7-联苯-1,10菲咯啉)二氯化钌(II)复合物进行表征[15]。原理为,此种荧光指示剂荧光强度因分子氧动态猝灭,它在不同的氧气浓度下有不同的荧光强度,而且氧气浓度越低,荧光强度越大,最大吸收波长为455nm,最大发射波长为613nm。
    荧光强度的测定条件:荧光指示剂浓度为250μM(溶于无水乙醇),激发波长为455nm,荧光显微镜曝光时间为10ms。
    (2)氧气浓度与荧光强度间关系标准方程的测定
    为了将荧光强度转换成氧浓度,检测纯N2和空气的荧光强度来做两点标定。氧浓度通过检测的荧光强度和Stern-Volmer公式[16]来计算:I0/I=1+Kq[O2]。其中I代表有氧时的荧光强度,I0代表无氧时即纯氮气环境中的荧光强度,Kq代表淬灭系数。令I空气代表氧气浓度为21%时对应的荧光强度,由上式可知,只要测得I0、I空气就可得到Kq,把Kq值带入上式就可以得到荧光强度和氧气浓度间的关系方程。
    5.相关溶液的配制
    1M氢氧化钠溶液:称取2g氢氧化钠固体,溶于50ml水中。
    邻苯三酚溶液:称取250mg邻苯三酚,溶于50ml水中,分别移取1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml邻苯三酚,分别稀释至50ml,配制100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、700ng/ml的邻苯三酚溶液。需现配现用。
    6.芯片上氧气浓度梯度的实现
    利用荧光染料三联吡啶钌的氧敏感性及其荧光成像,在细胞培养通道内测定氧浓度并对其进行表征,结果如图3所示。为了在芯片上形成氧气浓度梯度,在八个通道中通入不同浓度的邻苯三酚溶液,每个通道都与1M的氢氧化钠溶液混合,以形成不同氧浓度的微环境,并对其结果进行表征,得到图4。由图4可以看出,在微流控芯片上实现了浓度梯度。
    7.微流控芯片操作方法
    缺氧模型构建:同时向芯片注入1M的氢氧化钠和浓度分别为0,100μg/ml,200μg/ml,300μg/ml,400μg/ml,500μg/ml,600μg/ml,700μg/ml的八种邻苯三酚溶液,平衡反应2个小时,使上层细胞培养通道达到缺氧环境。
    填充柱芯片:使用前,需用甲醇溶液活化芯片通道,即向芯片中以10μl/min流速通入甲醇,连续通1个小时。之后以5μl/min流速分别进行上样、淋洗、洗脱,洗脱液通过石英毛细管导入质谱,进行分析检测。
    上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述,但并非对本发明?;し段У南拗?,所属领域技术人员应该明白,在本发明的技术方案的基础上,本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的?;し段б阅?。

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