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    重庆时时彩大小单双龙虎总和分析: 一种测定红枣中环磷酸腺苷含量的方法.pdf

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    一种 测定 红枣 磷酸 腺苷 含量 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201510120057.X

    申请日:

    2015.03.18

    公开号:

    CN104698116A

    公开日:

    2015.06.10

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||著录事项变更IPC(主分类):G01N 30/88变更事项:发明人变更前:孟伊娜 赵鑫 周晓明 张平 张谦 邹淑萍 马燕 张健 许铭强变更后:孟伊娜 赵鑫 周晓明 过利敏 苗昊翠 张平 张谦 马燕 邹淑萍 张健 许铭强|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 30/88申请日:20150318|||公开
    IPC分类号: G01N30/88 主分类号: G01N30/88
    申请人: 新疆农业科学院农产品贮藏加工研究所
    发明人: 孟伊娜; 赵鑫; 周晓明; 张平; 张谦; 邹淑萍; 马燕; 张健; 许铭强
    地址: 830091新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市沙依巴克区南昌路403号新疆农科院加工所
    优先权:
    专利代理机构: 北京科龙寰宇知识产权代理有限责任公司11139 代理人: 孙皓晨
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201510120057.X

    授权公告号:

    |||||||||

    法律状态公告日:

    2015.11.18|||2015.10.28|||2015.07.08|||2015.06.10

    法律状态类型:

    授权|||著录事项变更|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种测定红枣中环磷酸腺苷含量的方法,包括如下步骤:(1)红枣中环磷酸腺苷的提??;(2)高效液相色谱测定。本发明对常规测定红枣环磷酸腺苷的方法进行改进,提高了红枣中环磷酸腺苷的提取率,将常规方法中的浸提率85%提高至95%以上;资源综合利用率高,由于溶媒用量的大幅减少,浸提液中环磷酸腺苷含量高,后期浓缩成本大大降低,绿色环保;回收率为109%,精密度较高,结果准确,且方法可行性高。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种测定红枣中环磷酸腺苷含量的方法,其特征在于,包括如下操作步骤:
    (1)红枣中环磷酸腺苷的提?。?
    (a)预处理:将含有水分的红枣枣果放入50℃鼓风干燥箱中干燥72h,然后去核、粉碎, 并过40-60目筛;
    (b)超声超临界浸提:准确称取干枣粉末5.0000g,装入带有超声装置的超声超临界流 体萃取釜中用CO2进行低温超临界流体萃取,再加入粉料重量2-5倍的浓度为5%-10%乙醇 萃取液,关闭釜体密封盖,通过纯度为99.8%的CO2控制临界温度25-30℃,临界压力为 3.5-5.5MPa,CO2流量10kg/h,浸提时间1.5-2.5h,超声时间0.5-1.0h,超声波功率:600w, 频率:18.0Hz-22.0Hz,超声1s,间隙1s;
    (c)离心分离:将步骤(b)装入低温离心机中离心分离,转速:4000r/min,分离时间: 10mim;温度:4℃,取上清液,洗涤滤渣,并入上清液,过滤后浓缩至50mL,备用。
    (2)高效液相色谱测定:
    (a)环磷酸腺苷标准曲线绘制:
    精确称取5.0mg cAMP标准品,用超纯水溶解,然后分别配制成浓度为1μg/mL、5μg/mL、 10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL标准品溶液,用微量进样器吸取15μL注入液相色谱仪,将 色谱图积分后记录峰面积,以标准品浓度(μg/mL)为纵坐标,峰面积为横坐标,绘制标准曲线。
    (b)样品环磷酸腺苷含量的测定:
    将步骤(1)的提取液经0.22μm滤膜过滤,用微量进样器吸取15μL注入高效液相色谱 仪,将色谱图积分后记录峰面积,外标法计算,既得样品环磷酸腺苷的含量。

    2.  根据权利要求1所述的测定红枣中环磷酸腺苷含量的方法,其特征在于:所述步骤 (1)中选取含水量在5-15%的枣为原料。

    3.  根据权利要求1所述的测定红枣中环磷酸腺苷含量的方法,其特征在于:所述步骤 (1)中(b)乙醇浓度为6-8%。

    4.  根据权利要求1所述的测定红枣中环磷酸腺苷含量的方法,其特征在于:所述步骤 (1)中(b)时间26-28℃。

    5.  根据权利要求1所述的测定红枣中环磷酸腺苷含量的方法,其特征在于:所述步骤 (1)中(b)临界压力4.0-5.0MPa。

    6.  根据权利要求1所述的测定红枣中环磷酸腺苷含量的方法,其特征在于:所述步骤 (1)中(b)浸提时间为2.0h。

    7.  根据权利要求1所述的测定红枣中环磷酸腺苷含量的方法,其特征在于:所述步骤 (1)中(b)超声波频率为19.5-21.0Hz。

    8.  根据权利要求1所述的测定红枣中环磷酸腺苷含量的方法,其特征在于:所述步骤 (2)中(b)按照如下色谱条件进行测定:色谱柱:Thermo C18柱,4.6mm×250mm,5μm; 流动相:0.05mol/L磷酸二氢钾溶液:甲醇体积比为90:10,流动相经0.45μm滤膜过滤,超 声脱气,等度洗脱;流速:1ml/min;进样量:15μL;柱温:30℃;检测波长:258nm或268nm 或284nm或312nm。

    说明书

    说明书一种测定红枣中环磷酸腺苷含量的方法
    技术领域
    本发明涉及植物有效成分的提取和含量测定领域,尤其是一种测定红枣中 环磷酸腺苷含量的方法。
    背景技术
    环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,简称cAMP)分子式 为:C10H12N5O6P·H2O,水合物为类白色或淡黄色结晶,微溶于水,不溶于乙醇或 乙醚;熔点为219~220℃,比旋度为-51.3°(C=0.67);它对酸、碱、热都相当 稳定。cAMP是人体中的一种重要生物活性物质,它是细胞内传递激素和递质的 中介因子,并作为第二信使参与多种生理生化过程的调节,对心肌梗塞、冠心 病、心源性休克、牛皮癣等疾病有显著疗效。cAMP是由Sutherland于1957年 最早从哺乳动物组织中发现的,Sutherland因发现cAMP于1971年获得生理和 医学诺贝尔奖。据文献报道,枣中cAMP含量在已测动植物中是最高的,是一 般动植物的数千至数万倍。因而枣中环磷酸腺苷颇具开发利用价值。
    超临界流体(Supercritical fluid,SCF)作为处于高于临界点的温度和压力条 件下的纯净物质,在1822年被发现,最早的应用则可以追溯到1970年马普研 究所使用超临界二氧化碳从咖啡豆中萃取咖啡因和从啤酒花中萃取苦味酸,从 此掀起了SCF的发展序幕SCF特殊的物理性质是与液体类似的密度,与气体类 似的黏度,没有界面张力和密度的可调控性。SCF比液体更小的黏度,具有更 髙的物质扩散系数。没有界面张力使得在三相体系中更好地渗透到固体颗粒的 间隙中间,提高渗透性能,从而提髙萃取的效率。在SCF流体中,超临界二氧 化碳(supercritical Carbon Dioxide,SCCD)的条件比较容易实现Tc=39.5℃, Pc=72.8atm),因而最为常用,特别适合于规?;褂?。对二氧化碳而言,临界点 的温度和压力适中,容易达到,同时不会破坏萃取物质的固有属性。通过对温 度和压力的控制,可以根据成分的不同进行选择性萃取。
    近年来,不少学者对红枣中环磷酸腺苷的提取技术和测定方法进行了积极 的探索和研究。但目前测定红枣中环磷酸腺苷的方法存在浸提时间长且不完全, 操作繁琐,寻找一种快速准确测定红枣中环磷酸腺苷的方法是本领域的研究的 重点和难点。超声波法是一种新型有效的中草药活性成分提取方法(超声波辅 助酶法提取木枣环磷酸腺苷的工艺条件优化,食品科技,2013,7(38):220-224), 超临界二氧化碳萃取红枣中有益成份也广泛应用,见中国专利,发明名称:一 种高含量枣环磷酸腺苷提取物及其制备方法,申请号:201310443550.6,而采 用超声波辅助超临界二氧化碳法提取枣果环磷酸腺苷的方法并测定其含量,尚 未见报道。
    发明内容
    本发明的目的就在于为了解决上述问题而提供一种测定红枣中环磷酸腺苷 含量的方法,其可以快速准确的测定红枣中环磷酸腺苷的含量,操作简单、快 捷,含量准确。
    本发明通过以下技术方案来实现上述目的:
    本发明的一种测定红枣中环磷酸腺苷含量的方法,其特征在于,包括如下 操作步骤:
    (1)红枣中环磷酸腺苷的提?。?
    (a)预处理:将含有水分的红枣枣果放入50℃鼓风干燥箱中干燥72h,然 后去核、粉碎,并过40-60目筛;
    (b)超声超临界浸提:准确称取干枣粉末5.0000g,装入带有超声装置的 超声超临界流体萃取釜中用CO2进行低温超临界流体萃取,再加入粉料重量2-5 倍的浓度为5%-10%乙醇萃取液,关闭釜体密封盖,通过纯度为99.8%的CO2控制临界温度25-30℃,临界压力为3.5-5.5MPa,CO2流量10kg/h,浸提时间 1.5-2.5h,超声时间0.5-1.0h,超声波功率:600w,频率:18.0Hz-22.0Hz,超 声1s,间隙1s;
    (c)离心分离:将步骤(b)装入低温离心机中离心分离,转速:4000r/min, 分离时间:10min;温度:4℃,取上清液,洗涤滤渣,并入上清液,过滤后浓 缩至50mL,备用。
    (2)高效液相色谱测定:
    (a)环磷酸腺苷标准曲线绘制:
    精确称取5.0mg cAMP标准品,用超纯水溶解,然后分别配制成浓度为1 μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL标准品溶液,用微量进样器 吸取15μL注入液相色谱仪,将色谱图积分后记录峰面积,以标准品浓度(μg/mL) 为纵坐标,峰面积为横坐标,绘制标准曲线。
    (b)样品环磷酸腺苷含量的测定:
    将步骤(1)的提取液经0.22μm滤膜过滤,用微量进样器吸取15μL注入 高效液相色谱仪,将色谱图积分后记录峰面积,外标法计算,既得样品环磷酸 腺苷的含量。
    进一步地,所述步骤(1)中选取含水量在5-15%的枣为原料。
    进一步地,所述步骤(1)中(b)乙醇浓度为6-8%。
    进一步地,所述步骤(1)中(b)时间26-28℃。
    进一步地,所述步骤(1)中(b)临界压力4.0-5.0MPa。
    进一步地,所述步骤(1)中(b)浸提时间为2.0h。
    进一步地,所述步骤(1)中(b)超声波频率为19.5-21.0Hz。
    进一步地,所述步骤(2)中(b)按照如下色谱条件进行测定:色谱柱: Thermo C18柱,4.6mm×250mm,5μm;流动相:0.05mol/L磷酸二氢钾溶液: 甲醇体积比为90:10,流动相经0.45μm滤膜过滤,超声脱气,等度洗脱;流速: 1ml/min;进样量:15μL;柱温:30℃;检测波长:258nm或268nm或284nm 或312nm。
    本发明与现有技术相比较,其有益的技术效果在于:
    本发明对常规测定红枣环磷酸腺苷的方法进行了改进,提高红枣中环磷酸 腺苷的提取率,将常规方法中的浸提率85%提高至95%以上;资源综合利用率 高,由于溶媒用量的大幅减少,浸提液中环磷酸腺苷含量高,后期浓缩成本大 大降低,绿色环保;在本发明色谱条件下分析环磷酸腺苷保留时间为9.113min, 对比标准品与样品色谱图保留时间可以肯定样品测定的就是环磷酸腺苷。通过 计算分离度R>>1.5杂质无干扰,且方法可行性高;在相应的线性范围内,各种 类线性关系好,决定系数均达0.999以上,相对标准差(RSD)在1%,回收率 为109%,精密度较高,结果准确,且方法可行性高。
    附图说明
    图1是环磷酸腺苷标准曲线。
    具体实施方式
    下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明:
    1、原料与药品
    新鲜红枣枣果,河北沧州枣基地;超纯水,自制;甲醇,色谱纯,迪马公 司;磷酸二氢钾,色谱纯,Sigma公司;环磷酸腺苷标准品,色谱纯,99.95%, Sigma公司。
    2、仪器与设备
    SFE-2超临界萃取仪,美国ASI公司;JY92-II超声波细胞粉碎机,宁波新 芝生物科技股份有限公司;高效液相色谱仪:Agilent1260,包括在线脱气机, 四元泵,自动进样器,柱温箱,紫外检测器,色谱工作站;色谱柱:Thermo C18 色谱柱(4.6×250mm,5μm);ML204分析天平0.0001g,梅特勒-托利多仪器 有限公司;AP-01P真空泵,天津奥特赛思仪器有限公司;AKHL-Ⅲ-24A艾柯实 验室超纯水仪,成都艾柯水处理设备有限公司;GL-20G-Ⅱ型离心机,上海安亭 科学仪器厂;多功能粉碎机,北京市永光明医疗仪器厂;HDS-D120B-D型多功 能烘干机,辽宁海帝升机械有限公司。
    实施例1
    一种测定红枣中环磷酸腺苷含量的方法,包括如下操作步骤:
    (1)红枣中环磷酸腺苷的提?。?
    (a)预处理:将含水量5%红枣枣果放入50℃鼓风干燥箱中干燥72h,然 后去核、粉碎,并过40目筛;
    (b)超声超临界浸提:准确称取干枣粉末5.0000g,装入带有超声装置的 超声超临界流体萃取釜中用CO2进行低温超临界流体萃取,再加入粉料重量2 倍的浓度为5%乙醇萃取液,关闭釜体密封盖,通过纯度为99.8%的CO2控制临 界温度25℃,临界压力为3.5MPa,CO2流量10kg/h,浸提时间1.5h,超声时间 0.5,超声波功率600w,频率18.0Hz,超声1s,间隙1s;
    (c)离心分离:将步骤(b)装入低温离心机中离心分离,转速:4000r/min, 分离时间:10min;温度:4℃,取上清液,洗涤滤渣,并入上清液,过滤后浓 缩至50mL,备用;
    (2)高效液相色谱测定:
    (a)环磷酸腺苷标准曲线绘制:
    精确称取5.0mg cAMP标准品,用超纯水溶解,然后分别配制成浓度为1 μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL标准品溶液,用微量进样器 吸取15μL注入液相色谱仪,将色谱图积分后记录峰面积,以标准品浓度(μg/mL) 为纵坐标,峰面积为横坐标,绘制标准曲线如附图1。
    由上图知道标准曲线为:y=2e-06X-0.6802、相关系数R2=0.9991。表明cAMP 在1.0μg/mL—50.0μg/mL浓度范围内,色谱峰面积与样品量呈线性关系。
    本实验采用样品加标回收,称取相同质量的两份样品,分别称取1.0000g干 燥的枣粉,在其中一份加入0.70mg环磷酸腺苷标准品,按照本发明处理方法处 理两份相同的样品,测定其环磷酸腺苷的含量。
    结果为(样品浓度mg/kg),未加标样品:396.221;加标样品:1158.346。 使用以下公式对加标回收率进行计算:
    加标回收率=(加标试样测定值-试样测定值)÷加标量×100%;
    加标回收率为:109%。根据规定样品加标回收的实验中,加入标准品的量 一般控制为样品中所含物质的0.5—2.0倍,本次加入环磷酸腺苷标品量为干枣 粉中环磷酸腺苷含量的1.7667倍。
    (b)样品环磷酸腺苷含量的测定:
    将步骤(1)的提取液经0.22μm滤膜过滤,用微量进样器吸取15μL注入 高效液相色谱仪,将色谱图积分后记录峰面积,外标法计算,既得样品环磷酸 腺苷的含量,色谱条件进行测定:色谱柱:Thermo C18柱,4.6mm×250mm,5μm; 流动相:0.05mol/L磷酸二氢钾溶液:甲醇体积比为90:10,流动相经0.45μm 滤膜过滤,超声脱气,等度洗脱;流速:1ml/min;进样量:15μL;柱温:30℃; 检测波长:258nm。
    实施例2
    一种测定红枣中环磷酸腺苷含量的方法,包括如下操作步骤:
    (1)红枣中环磷酸腺苷的提?。?
    (a)预处理:将含水量15%红枣枣果放入50℃鼓风干燥箱中干燥72h,然 后去核、粉碎,并过60目筛;
    (b)超声超临界浸提:准确称取干枣粉末5.0000g,装入带有超声装置的 超声超临界流体萃取釜中用CO2进行低温超临界流体萃取,再加入粉料重量5 倍的浓度为10%乙醇萃取液,关闭釜体密封盖,通过纯度为99.8%的CO2控制 临界温度30℃,临界压力为5.5MPa,CO2流量10kg/h,浸提时间2.5h,超声时 间1.0h,超声波功率:600w,频率:22.0Hz,超声1s,间隙1s;
    (c)离心分离:将步骤(b)装入低温离心机中离心分离,转速:4000r/min, 分离时间:10min;温度:4℃,取上清液,洗涤滤渣,并入上清液,过滤后浓 缩至50mL,备用。
    (2)高效液相色谱测定:
    (a)环磷酸腺苷标准曲线绘制:
    精确称取5.0mg cAMP标准品,用超纯水溶解,然后分别配制成浓度为1 μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL标准品溶液,用微量进样器 吸取15μL注入液相色谱仪,将色谱图积分后记录峰面积,以标准品浓度(μg/mL) 为纵坐标,峰面积为横坐标,绘制标准曲线。
    (b)样品环磷酸腺苷含量的测定:
    将步骤(1)的提取液经0.22μm滤膜过滤,用微量进样器吸取15μL注入 高效液相色谱仪,将色谱图积分后记录峰面积,外标法计算,既得样品环磷酸 腺苷的含量。色谱条件进行测定:色谱柱:Thermo C18柱,4.6mm×250mm,5 μm;流动相:0.05mol/L磷酸二氢钾溶液:甲醇体积比为90:10,流动相经0.45μm 滤膜过滤,超声脱气,等度洗脱;流速:1ml/min;进样量:15μL;柱温:30 ℃;检测波长:312nm。
    实施例3
    一种测定红枣中环磷酸腺苷含量的方法,其特征在于,包括如下操作步骤:
    (1)红枣中环磷酸腺苷的提?。?
    (a)预处理:将含水量8%红枣枣果放入50℃鼓风干燥箱中干燥72h,然 后去核、粉碎,并过40-60目筛;
    (b)超声超临界浸提:准确称取干枣粉末5.0000g,装入带有超声装置的 超声超临界流体萃取釜中用CO2进行低温超临界流体萃取,再加入粉料重量2-5 倍的浓度为6%乙醇萃取液,关闭釜体密封盖,通过纯度为99.8%的CO2控制临 界温度26℃,临界压力为4.0MPa,CO2流量10kg/h,浸提时间2.0h,超声时间 0.8h,超声波功率:600w,频率:19.0Hz,超声1s,间隙1s;
    (c)离心分离:将步骤(b)装入低温离心机中离心分离,转速:4000r/min, 分离时间:10min;温度:4℃,取上清液,洗涤滤渣,并入上清液,过滤后浓 缩至50mL,备用。
    (2)高效液相色谱测定:
    (a)环磷酸腺苷标准曲线绘制:
    精确称取5.0mg cAMP标准品,用超纯水溶解,然后分别配制成浓度为1 μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL标准品溶液,用微量进样器 吸取15μL注入液相色谱仪,将色谱图积分后记录峰面积,以标准品浓度(μg/mL) 为纵坐标,峰面积为横坐标,绘制标准曲线。
    (b)样品环磷酸腺苷含量的测定:
    将步骤(1)的提取液经0.22μm滤膜过滤,用微量进样器吸取15μL注入 高效液相色谱仪,将色谱图积分后记录峰面积,外标法计算,既得样品环磷酸 腺苷的含量。色谱条件进行测定:色谱柱:Thermo C18柱,4.6mm×250mm,5μm; 流动相:0.05mol/L磷酸二氢钾溶液:甲醇体积比为90:10,流动相经0.45μm滤 膜过滤,超声脱气,等度洗脱;流速:1ml/min;进样量:15μL;柱温:30℃; 检测波长:284nm。
    实施例4
    一种测定红枣中环磷酸腺苷含量的方法,其特征在于,包括如下操作步骤:
    (1)红枣中环磷酸腺苷的提?。?
    (a)预处理:将含水量12%红枣枣果放入50℃鼓风干燥箱中干燥72h,然 后去核、粉碎,并过50目筛;
    (b)超声超临界浸提:准确称取干枣粉末5.0000g,装入带有超声装置的 超声超临界流体萃取釜中用CO2进行低温超临界流体萃取,再加入粉料重量3 倍的浓度为8%乙醇萃取液,关闭釜体密封盖,通过纯度为99.8%的CO2控制临 界温度28℃,临界压力为5.0MPa,CO2流量10kg/h,浸提时间1.8h,超声时间 0.8h,超声波功率:600w,频率21.0Hz,超声1s,间隙1s;
    (c)离心分离:将步骤(b)装入低温离心机中离心分离,转速:4000r/min, 分离时间:10min;温度:4℃,取上清液,洗涤滤渣,并入上清液,过滤后浓 缩至50mL,备用。
    (2)高效液相色谱测定:
    (a)环磷酸腺苷标准曲线绘制:
    精确称取5.0mg cAMP标准品,用超纯水溶解,然后分别配制成浓度为1 μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL标准品溶液,用微量进样器 吸取15μL注入液相色谱仪,将色谱图积分后记录峰面积,以标准品浓度(μg/mL) 为纵坐标,峰面积为横坐标,绘制标准曲线。
    (b)样品环磷酸腺苷含量的测定:
    将步骤(1)的提取液经0.22μm滤膜过滤,用微量进样器吸取15μL注入 高效液相色谱仪,将色谱图积分后记录峰面积,外标法计算,既得样品环磷酸 腺苷的含量。色谱条件进行测定:色谱柱:Thermo C18柱,4.6mm×250mm,5μm; 流动相:0.05mol/L磷酸二氢钾溶液:甲醇体积比为90:10,流动相经0.45μm滤 膜过滤,超声脱气,等度洗脱;流速:1ml/min;进样量:15μL;柱温:30℃; 检测波长:258nm。
    实施例5
    一种测定红枣中环磷酸腺苷含量的方法,包括如下操作步骤:
    (1)红枣中环磷酸腺苷的提?。?
    (a)预处理:将红枣枣果放入50℃鼓风干燥箱中干燥72h,然后去核、粉 碎,并过55目筛;
    (b)超声超临界浸提:准确称取干枣粉末5.0000g,装入带有超声装置的 超声超临界流体萃取釜中用CO2进行低温超临界流体萃取,再加入粉料重量4 倍的浓度为9%乙醇萃取液,关闭釜体密封盖,通过纯度为99.8%的CO2控制临 界温度27℃,临界压力为4.5MPa,CO2流量10kg/h,浸提时间2.2h,超声时间 0.8h,超声波功率:600w,频率20.0Hz,超声1s,间隙1s;
    (c)离心分离:将步骤(b)装入低温离心机中离心分离,转速:4000r/min, 分离时间:10min;温度:4℃,取上清液,洗涤滤渣,并入上清液,过滤后浓 缩至50mL,备用。
    (2)高效液相色谱测定:
    (a)环磷酸腺苷标准曲线绘制:
    精确称取5.0mg cAMP标准品,用超纯水溶解,然后分别配制成浓度为1 μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL标准品溶液,用微量进样器 吸取15μL注入液相色谱仪,将色谱图积分后记录峰面积,以标准品浓度(μg/mL) 为纵坐标,峰面积为横坐标,绘制标准曲线。
    (b)样品环磷酸腺苷含量的测定:
    将步骤(1)的提取液经0.22μm滤膜过滤,用微量进样器吸取15μL注入高 效液相色谱仪,将色谱图积分后记录峰面积,外标法计算,既得样品环磷酸腺 苷的含量。色谱条件进行测定:色谱柱:Thermo C18柱,4.6mm×250mm,5μm; 流动相:0.05mol/L磷酸二氢钾溶液:甲醇体积比为90:10,流动相经0.45μm 滤膜过滤,超声脱气,等度洗脱;流速:1ml/min;进样量:15μL;柱温:30℃; 检测波长:258nm。
    实施例6
    一种测定红枣中环磷酸腺苷含量的方法,包括如下操作步骤:
    (1)红枣中环磷酸腺苷的提?。?
    (a)预处理:将含水量为14%红枣枣果放入50℃鼓风干燥箱中干燥72h, 然后去核、粉碎,并过53目筛;
    (b)超声超临界浸提:准确称取干枣粉末5.0000g,装入带有超声装置的 超声超临界流体萃取釜中用CO2进行低温超临界流体萃取,再加入粉料重量3.5 倍的浓度为6%乙醇萃取液,关闭釜体密封盖,通过纯度为99.8%的CO2控制临 界温度29℃,临界压力为4.2MPa,CO2流量10kg/h,浸提时间1.8h,超声时间 0.6h,超声波功率:600w,频率20.5Hz,超声1s,间隙1s;
    (c)离心分离:将步骤(b)装入低温离心机中离心分离,转速:4000r/min, 分离时间:10min;温度:4℃,取上清液,洗涤滤渣,并入上清液,过滤后浓 缩至50mL,备用。
    (2)高效液相色谱测定:
    (a)环磷酸腺苷标准曲线绘制:
    精确称取5.0mg cAMP标准品,用超纯水溶解,然后分别配制成浓度为1 μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL标准品溶液,用微量进样器 吸取15μL注入液相色谱仪,将色谱图积分后记录峰面积,以标准品浓度(μg/mL) 为纵坐标,峰面积为横坐标,绘制标准曲线。
    (b)样品环磷酸腺苷含量的测定:
    将步骤(1)的提取液经0.22μm滤膜过滤,用微量进样器吸取15μL注入 高效液相色谱仪,将色谱图积分后记录峰面积,外标法计算,既得样品环磷酸 腺苷的含量。色谱条件进行测定:色谱柱:Thermo C18柱,4.6mm×250mm,5 μm;流动相:0.05mol/L磷酸二氢钾溶液:甲醇体积比为90:10,流动相经0.45 μm滤膜过滤,超声脱气,等度洗脱;流速:1ml/min;进样量:15μL;柱温: 30℃;检测波长:258nm。
    上述实施例只是本发明的较佳实施例,并不是对本发明技术方案的限制, 只要是不经过创造性劳动即可在上述实施例的基础上实现的技术方案,均应视 为落入本发明专利的权利?;し段?。

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