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    重庆时时彩l: 吸附己烯雌酚类药物的免疫亲和搅拌棒及其制备方法与应用.pdf

    关 键 词:
    吸附 己烯 类药物 免疫 亲和 搅拌 及其 制备 方法 应用
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    摘要
    申请专利号:

    CN201510117235.3

    申请日:

    2015.03.18

    公开号:

    CN104698179A

    公开日:

    2015.06.10

    当前法律状态:

    驳回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的驳回IPC(主分类):G01N 33/577申请公布日:20150610|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 33/577申请日:20150318|||公开
    IPC分类号: G01N33/577 主分类号: G01N33/577
    申请人: 天津农学院
    发明人: 李存; 姚凯; 张伟; 杨琳燕; 彭涛; 赵思俊; 丁巧玲; 何建丽
    地址: 300384天津市西青区津静路22号
    优先权:
    专利代理机构: 天津市杰盈专利代理有限公司12207 代理人: 朱红星
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201510117235.3

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2018.05.25|||2015.07.08|||2015.06.10

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的驳回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种吸附己烯雌酚类药物的免疫亲和搅拌棒及其制备方法与应用,它是由固相载体和与其偶联的己烯雌酚鼠单克隆抗体组成,其中固相载体与偶联的己烯雌酚DES-6B4鼠单克隆抗体的偶联长度与重量比为1cm:2mg。本发明的提取方法结合色谱法可以使样品中的待测组分得到有效分离和浓缩,便于二苯乙烯类化合物含量的检测,弥补了单纯免疫测定技术直接测定样本的信息量太少、定量准确差,或理化方法选择性低等不足,体现了免疫学技术和常规理化技术在分析机制的互补性。

    权利要求书

    权利要求书
    1.  一种吸附己烯雌酚类药物的免疫亲和搅拌棒,其特征在于是由固相载体和与其偶联的己烯雌酚鼠单克隆抗体组成,其中固相载体与偶联的己烯雌酚DES-6B4鼠单克隆抗体的偶联长度与重量比为1 cm : 2 mg;所述的固相载体为10 cm×4 mm玻璃棒,偶联抗体的有效长度为2.5 cm,所述的单克隆杂交瘤细胞株 DES-6B4注入小鼠腹腔,纯化小鼠腹水得到。

    2.  权利要求1所述吸附己烯雌酚类药物的免疫亲和搅拌棒的制备方法,其特征在于按如下的步骤进行:
    (1)固相载体表面的处理:将玻璃棒下半部分浸入到双氧水和浓硫酸混合溶液中1h, 依次用超纯水、无水乙醇和超纯水彻底冲洗;其中双氧水:浓硫酸的体积比为30:70;
    (2)硅烷化反应:将玻璃棒下半部分浸入ATPES乙醇溶液中,其中ATPES:超纯水:无水乙醇的体积比为5:5:90,室温下反应24 h;
    (3)氨基的固定:超纯水和纯乙醇依次冲洗玻璃棒,放入真空干燥箱中80℃并通入氮气氮吹15h;
    (4)玻璃棒的活化:玻璃棒浸入2.5%(w/w)的戊二醛PBS溶液中5 h,之后用超纯水冲洗;
    (5)偶联反应:玻璃棒浸入单克隆杂交瘤细胞株 DES-6B4分泌的单克隆抗体PBS溶液(0.5mg/mL抗体+0.05 mg/mL NaN3)中4℃轻微搅拌24 h;
    (6)将玻璃棒上未反应的戊二醛用乙醇胺水溶液(0.3M)去活化1 h;
    (7)稳固共价键:置于PBS+0.05 mg/mL NaN3+0.2mg/mL NaCNBH3混合溶液中4℃反应48h,将酰亚胺还原为胺使共价键结合更加牢固;所述固相载体为高硼硅玻璃棒、高纯硅玻璃棒或石英玻璃棒。

    3.  权利要求2所述吸附己烯雌酚类药物的免疫亲和搅拌棒的制备方法,其特征在于所述的固相载体表面使用体积比30:70的双氧水:浓硫酸进行清洁和形成粗糙表面。

    4.  权利要求2所述吸附己烯雌酚类药物的免疫亲和搅拌棒的制备方法,其特征在于所述的单克隆抗体指的是对己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和丁烯雌酚四种二苯乙烯类化合物具有特异反应的单克隆杂交瘤细胞株DES-6B4分泌的单克隆抗体。

    5.  权利要求1所述吸附己烯雌酚类药物的免疫亲和搅拌棒在制备吸附4种二苯乙烯类化合物方面的应用;所述的4种二苯乙烯类化合物指的是:己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和丁烯雌酚。

    说明书

    说明书吸附己烯雌酚类药物的免疫亲和搅拌棒及其制备方法与应用
    技术领域
    本发明属于食品安全检测技术领域,涉及吸附己烯雌酚类药物免疫亲和搅拌棒及其制备方法与应用。
    背景技术
    随着我国经济的发展,人们生活水平的日益提高,对各种动物源性食品的需求量也逐渐增大,食品安全问题自然成为大家关注的焦点。近年来关于雌激素残留引起的对人身体健康造成危害的报道屡见不鲜,相关食品安全部门也致力于检测方法的研究。由于生物样品的成分复杂、雌激素与样品成分之间易互相结合和残留浓度低等均给样品中药物的提取净化带来了很大的困难,因此分析方法的选择性和灵敏度直接决定了检测的成功与否。
    免疫亲和搅拌棒(Imunoaffinity stir bar)是免疫亲和固相微萃?。↖mmunoaffinity solid phase microextraction, Immunoaffinity SPME)的一种装置形式,将固相微萃?。⊿olid phase microextraction, SPME)与免疫亲和色谱(IAC,immunoaffinity chromatography)相结合,既具有SPME易于操作、使用溶剂少和节省时间的优点,又有免疫亲和色谱高度选择性和高亲和性的特点,使SPME在兽药残留分析中,选择性、亲和性和灵敏度方面得到了很大的提升。Immunoaffinity stir bar常被用作样品的萃取,尤其适用于复杂基质中痕量分析物的提取,与多种检测手段结合使用进行分析测定,具有广阔的应用前景。
        二苯乙烯类化合物主要包括己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和丁烯雌酚,四种药物具有相似的药理作用。己烯雌酚(Diethylestilbestrol, DES)是人工合成的一种雌性激素,是二苯乙烯类化合物中的代表药物。1940年-1971年,当时美国曾用DES来防止流产和临床治疗,之后为增加动物体重而被非法用作畜禽生长促进剂。DES在动物源性食品中即使残留量微小都会使人类的正?;苁艿角痹谕?。由于DES的致畸、致突变和致癌性质,在大多数国家已经被禁止使用。然而因为利益的驱使,目前己烯雌酚的滥用现象仍十分严重。
    己烯雌酚主要用于动物的催情、胎衣不下、排出死胎还可以治疗子宫炎等,如治疗母猪乏情不孕和诱导母兔发情等。由于己烯雌酚可以促进动物蛋白质合成、减少脂肪提高饲料利用率等优点,目前已经被养殖业广泛使用。己烯雌酚为亲脂物质,不能像多数天然的雌激素那样被机体肝脏分解,导致其容易在动物体内残留,人食用了此类动物源性食品后也会在体内富积而导致相关疾病的发生,危害人体健康。目前已知的己烯雌酚的不良反应主要有:孕妇服用此药,其女性后代在青春期后宫颈和阴道的腺病及腺癌发生率升高,男性后代生殖道异常和精子异常发生率也增加。其他参见雌激素??捎卸裥?,呕吐,食欲不振,头痛,长期使用可使子宫内膜增生过度而致子宫出血和肥大。在亚洲方面,韩国、日本等国家也早有规定,激素类物质禁止在国内养殖业中使用,含有雌激素的动物及动物源性食品国家禁止进口。
    目前用于DES检测的主要技术有:气相色谱法(GC)、液相色谱法、气相色谱-质谱联用分析法(GC/MS)、液相色谱-质谱联用分析法(LC/MS)、薄层色谱法(TLC)、放射免疫分析(RIA)和酶联免疫吸附分析(ELISA)等方法。由于样品基质成分复杂,在萃取过程中很容易将待测药物与其他性质相似的成分一起提取出来,给检测造成困难。因此,在检测之前“净化”工作是必不可少的,通常采用净化方法主要有液-液萃?。↙LE)和固相萃?。⊿PE)。LLE过程需要使用大量有机溶剂,而一些有机溶剂性质稳定,不易降解,对环境造成污染,而且操作繁琐。SPE操作简单、省时,但特异性不强是其主要的缺点。Immunoaffinity SPME技术首次于2001年被提出,用Immunoaffinity stir bar净化二苯乙烯类化合物目前还尚未见报道,更无商品化的Immunoaffinity stir bar出售。
    发明内容
    本发明的目的是提供一种吸附二苯乙烯类化合物的免疫亲和搅拌棒及其制备方法。
    为实现上述目的,本发明公开了如下的技术内容:
    一种吸附己烯雌酚类药物的免疫亲和搅拌棒,其特征在于是由固相载体和与其偶联的己烯雌酚鼠单克隆抗体组成,其中固相载体与偶联的己烯雌酚DES-6B4鼠单克隆抗体的偶联长度与重量比为1 cm : 2 mg;所述的固相载体为10 cm×4 mm玻璃棒,偶联抗体的有效长度为2.5 cm。所述的单克隆杂交瘤细胞株 DES-6B4注入小鼠腹腔,纯化小鼠腹水得到。
     所述DES-6B4中DES代表己烯雌酚、6代表细胞融合过程使用第6块96孔板,B4中的字母和数字分别代表96孔板的横纵编号,96孔板中1-12为横向编号,A-H为纵向编号。B4代表融合后的杂交瘤细胞株在96孔板中的位置。
    本发明进一步公开了吸附己烯雌酚类药物的免疫亲和搅拌棒的制备方法,其特征在于按如下的步骤进行:
    (1)固相载体表面的处理:将玻璃棒下半部分浸入到双氧水和浓硫酸混合溶液中1 h, 依次用超纯水、无水乙醇和超纯水彻底冲洗;其中双氧水:浓硫酸的体积比为30:70;浓硫酸进行清洁和形成粗糙表面。
    (2)硅烷化反应:将玻璃棒下半部分浸入ATPES乙醇溶液中,其中ATPES:超纯水:无水乙醇的体积比为5:5:90,室温下反应24 h;
    (3)氨基的固定:超纯水和纯乙醇依次冲洗玻璃棒,放入真空干燥箱中80℃并通入氮气氮吹15h;
    (4)玻璃棒的活化:玻璃棒浸入2.5%(w/w)的戊二醛PBS(磷酸盐缓冲液,即1L中含有0.2 g KH2PO4,0.2 g KCl,2.9 g Na2HPO4.12H2O,8.8 g NaCl的溶液。)溶液中5 h,之后用超纯水冲洗;
    (5)偶联反应:玻璃棒浸入单克隆杂交瘤细胞株 DES-6B4分泌的单克隆抗体PBS溶液,0.5 mg/mL抗体+0.05 mg/mL NaN3中4 ℃轻微搅拌24 h;
    (6)将玻璃棒上未反应的戊二醛用乙醇胺水溶液(0.3 M)去活化1 h;
    (7)稳固共价键:置于PBS+0.05 mg/mL NaN3+0.2 mg/mL NaCNBH3混合溶液中4 ℃反应48 h,将酰亚胺还原为胺使共价键结合更加牢固;所述固相载体为高硼硅玻璃棒、高纯硅玻璃棒或石英玻璃棒。
    本发明所述的单克隆抗体指的是对己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和丁烯雌酚四种二苯乙烯类化合物具有特异反应的单克隆杂交瘤细胞株DES-6B4分泌的单克隆抗体。
    本发明更进一步公开了吸附己烯雌酚类药物的免疫亲和搅拌棒在制备吸附4种二苯乙烯类化合物方面的应用。
    本发明的方法对组分净化的同时还可提供定性信息。本发明的提纯方法结合色谱法可以使样品中的待测组分得到有效分离和浓缩,便于己烯雌酚、乙烷雌酚、双烯雌酚和丁烯雌酚的含量检测,弥补了单纯免疫测定技术直接测定样本的信息量太少、定量准确差,或理化方法选择性低等不足,体现了免疫学技术和常规理化技术在分析机制的互补性。

                                                     
    本发明所述单克隆抗体可通过本发明提供的方法固定在玻璃棒上,制成免疫亲和搅拌棒,该免疫亲和搅拌棒属于本发明的?;し段?。
    该免疫亲和搅拌棒基于免疫反应和色谱反应,适合从各类动物源性样品中提取二苯乙烯类化合物,便于残留分析。
    本发明提供的制备对二苯乙烯类化合物具有特异性反应的免疫亲和搅拌棒的方法,详细步骤如下:
    固相载体表面的处理:将玻璃棒下半部分浸入到双氧水和浓硫酸(30:70,v/v)的混合溶液中1h, 依次用超纯水、无水乙醇和超纯水彻底冲洗。
    硅烷化反应:将玻璃棒下半部分浸入ATPES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)乙醇溶液中(ATPES:超纯水:无水乙醇=5:5:90,v/v)室温下反应24h。
    氨基的固定:超纯水和纯乙醇依次冲洗玻璃棒,放入真空干燥箱中80℃并通入氮气氮吹15h。
    玻璃棒的活化:玻璃棒浸入2.5%的戊二醛PBS(磷酸盐缓冲液,即1L中含有0.2gKH2PO4 ,0.2 g KCl,2.9gNa2HPO4.12H2O,8.8gNaCl的溶液。)中5h,之后用超纯水冲洗。
    偶联反应:玻璃棒浸入上述对二苯乙烯类化合物具有特异性反应的单克隆杂交瘤细胞株 DES-6B4分泌的单克隆抗体PBS溶液(0.5mg/mL抗体+0.05 mg/mL NaN3)中4℃轻微搅拌24h。
    活化位点的封闭:将玻璃棒上未反应的戊二醛用乙醇胺水溶液(0.3M)去活化1h。
    稳固共价键:置于PBS+0.05 mg/mL NaN3+0.2mg/mL NaCNBH3混合溶液中4℃反应48h,将酰亚胺还原为胺使共价键结合更加牢固。
    本发明公开的免疫亲和搅拌棒所具有的积极效果在于:
    (1)本发明的免疫亲和搅拌棒对单克隆抗体的需求量小,能重复使用,能节省大量的有机溶剂,降低分析成本并对环境友好。
    (2)本发明的免疫亲和搅拌棒特异性强,很大程度上简化了样品前处理过程。尤其适用于动物源性样品中二苯乙烯类化合物的前处理,分析质量得到改善。单克隆抗体的高选择性使得二苯乙烯类化合物分析方法的检测限将主要取决于取样量,这是单纯理化手段难以达到的。
    (3)本发明的免疫亲和搅拌棒对待测组分有很强的保留和浓缩能力,只要加样量不超过柱容量,在实测样品条件下免疫亲和吸附剂对组分的保留能力几乎不受样品体积或组分浓度的影响。
    (4)本发明的该免疫亲和搅拌棒基于免疫反应和色谱反应,适合从各类动物源性样品中提取己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和丁烯雌酚,便于残留分析。
    具体实施方式
    下面结合具体实施例对本发明做进一步说明:下述各实施例仅用于说明本发明而并非对本发明的限制。
    本发明涉及到的试剂、原料药市场均有销售。

     
    实施例1
    1、吸附己烯雌酚单克隆抗体的制备
     己烯雌酚-单羧基丙基醚(DES-CP)合成:称取 55 mg(Diethylstilbestrol, DES)溶于2 mL二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO),加入适量无水碳酸钾和4-溴丁酸乙酯(Ethyl 4-bromobutyrate),70℃搅拌反应,薄层色谱监测反应进程。反应完全后将产物加入纯水中,乙酸乙酯萃取,纯水洗涤、无水Na2SO4干燥,吹干,甲醇溶解,NaOH溶液(3 mol/L)水解,HCl溶液(6 mol/L)调pH至3左右,乙酸乙酯萃取,纯水洗涤、无水Na2SO4干燥,吹干。
    己烯雌酚-单羧基丙基醚-BSA(DES-CP-BSA)免疫原的制备:取40 mg DES-CP溶于2 mL DMSO,加入14 mg N-羟基琥珀酸亚胺(N-Hydroxysuccinimide, NHS),20 mg碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl),反应3 h,将上述溶液缓慢加入BSA溶液中(60 mg BSA溶于2 mL 0.05 mg/mL mol/L PBS),反应12 h,产物经葡聚糖凝胶G-25凝胶层析柱纯化,以紫外检测仪监测,收集大分子蛋白峰,0.01 mol/L PBS(pH 7.2)透析3 d。
    同样方法制备己烯雌酚-单羧基丙基醚-OVA(DES-CP-OVA)包被原。
    免疫程序的技术路线如下:取100 μg BSA偶联物,加等量弗氏完全佐剂,制成乳化剂,免疫8周龄雌性BALB/c小鼠12只,共免疫6次,每次间隔2周。BALB/c小鼠三免后眼眶采血,分离血清,用间接酶联免疫吸附测定法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)进行血清效价检测,选取血清效价最高的小鼠用来制备单克隆抗体。在含10%~15%小牛血清的完全培养液中对SP2/0骨髓瘤细胞进行培养。选取处于生长旺盛,形态良好的对数生长期细胞供融合用。用间接ELISA法对所有克隆生长孔的培养上清进行检测。选择阳性值较高、克隆数目较少的细胞克隆化,并扩大培养。阳性率100%时,得到稳定的融合杂交瘤细胞株。
    采用体内诱生腹水法制备单克隆抗体。选择8~10周BALB/c雌性小鼠10只,每只腹腔内注射无菌石蜡油0.5 mL。10~14天后,接种融合后的杂交瘤细胞。将培养的杂交瘤细胞吹打下来,1000 rpm离心10 min,弃去上清液,用无血培养液将其混匀,并将细胞数调至1~4×105个/mL,每只小鼠腹腔注射0.5 mL。植入细胞后第7天起,每天观察小鼠腹部,待小鼠腹部明显膨大,用9号针头穿刺腹腔,收集腹水,5000 rpm离心10 min,收集上清液,分装,-20 ℃保存备用。采用饱和硫酸铵法纯化腹水中的单克隆抗体。
    2、吸附二苯乙烯类化合物的免疫亲和搅拌棒的制备:
    载体的处理:将玻璃棒下半部分浸入到双氧水和浓硫酸(30:70,v/v)的混合溶液中1h, 依次用超纯水、无水乙醇和超纯水彻底冲洗。
    硅烷化反应:将玻璃棒下半部分浸入ATPES乙醇溶液中(ATPES:超纯水:无水乙醇=5:5:90,v/v)室温下反应24h。
    氨基的固定:超纯水和纯乙醇依次冲洗玻璃棒,放入真空干燥箱中80℃并通入氮气氮吹15h。
    玻璃棒的活化:玻璃棒浸入2.5%的戊二醛PBS溶液中5 h,之后用超纯水(超纯水机制备)冲洗。
    偶联反应:玻璃棒浸入上述对己烯雌酚有特异性反应的单克隆杂交瘤细胞株 DES-6B4分泌的单克隆抗体PBS溶液(0.5 mg/mL抗体+0.05 mg/mL NaN3)中4℃轻微搅拌24h。
    活化位点的封闭:将玻璃棒上未反应的戊二醛用乙醇胺水溶液(0.3M)去活化1h。
    稳固共价键:置于PBS+0.05 mg/mL NaN3+0.2mg/mL NaCNBH3混合溶液中4℃反应48h,将酰亚胺还原为胺使共价键结合更加牢固。制成对己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和丁烯雌酚具有特异反应的单克隆杂交瘤细胞株DES-6B4分泌的单克隆抗体的免疫亲和搅拌棒。
    3、免疫亲和搅拌棒柱容量的测定:
     将步骤3制得的对己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和丁烯雌酚具有特异反应的单克隆杂交瘤细胞株DES-6B4分泌的单克隆抗体从4℃冰箱中取出,静置到室温。浸入含2 mL 500 ng/mL的二苯乙烯类化合物的标准品溶液中,搅拌30 min,用700 μL洗脱液洗脱,氮气吹干,复溶,进行高效液相色谱-质谱测定,计算出柱容量。
    结果表明偶联有对己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和丁烯雌酚有特异反应的单克隆杂交瘤细胞株DES-6B4分泌的单克隆抗体的免疫亲和搅拌棒的柱容量为己烯雌酚0.93 ng,己烷雌酚0.88 ng,双烯雌酚 0.75 ng和丁烯雌酚0.98 ng。
    实施例2
    对比试验
     
    实施例3
    免疫亲和搅拌棒用于水中二苯乙烯类化合物的提取??瞻姿ü?.45水系滤膜除去杂质,准确称取过滤后的水样5 mL,置于10 mL离心管中,添加适量的二苯乙烯类化合物标准溶液,涡旋混匀,将免疫亲和玻璃棒放入除去混匀后的水样中,摇床振荡器上振荡30 min。将振荡后的玻璃棒从离心管中取出,用超纯水清洗后,放入装有700 μL甲醇的2 mL离心管中,摇床振荡器上振荡20min进行洗脱,氮气吹干,流动相复溶,0.22 μm微孔滤膜过滤,高效液相色谱-质谱进行分离检测。结果显示可以检测出己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚和丁烯雌酚,说明可以提取4种二苯乙烯类化合物。

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