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    重庆时时彩独胆网: T2毒素的检测方法及检测试剂盒.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201610041769.7

    申请日:

    2016.01.21

    公开号:

    CN105606574A

    公开日:

    2016.05.25

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 21/64申请日:20160121|||公开
    IPC分类号: G01N21/64 主分类号: G01N21/64
    申请人: 湖南科技大学
    发明人: 夏晓东; 冉海宁; 杨阳; 唐春然
    地址: 411201 湖南省湘潭市雨湖区石码头2号
    优先权:
    专利代理机构: 张家界市慧诚商标专利事务所 43209 代理人: 高红旺
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201610041769.7

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2018.07.24|||2016.06.22|||2016.05.25

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及一种检测T-2毒素的方法及试剂盒,该方法包括如下步骤:(A)使T-2毒素核酸适体与单链信号探针ssDNA杂交,形成杂交链;(B)使该杂交链与待测样品接触,当待测样品中有T-2毒素存在时,杂交链与T-2毒素反应释放出单链信号探针ssDNA;(C)利用DNA扩增,使杂交链成双链DNA,然后用外切酶,将双链DNA水解成单核苷酸而清除双链DNA,此时体系中留下ssDNA;(D)在ssDNA诱导下,银离子还原生成近红外荧光银纳米簇;检测体系荧光强度,从而测定待测样品中的T-2毒素的含量。该方法具有高灵敏度,操作简单,低成本等特点。

    权利要求书

    1.一种T-2毒素的检测方法,其特征是,该方法包括如下步骤:
    (A)T-2毒素核酸适体与单链信号探针DNA(ssDNA)杂交,形成杂交链;
    (B)使该杂交链与待测样品作用,当待测样品中有T-2毒素存在时,杂交链选择性地与
    T-2毒素反应释放出单链信号探针ssDNA;
    (C)消除杂交链的干扰,利用DNA扩增,使杂交链成双链DNA,然后用外切酶,将双链DNA
    水解成单核苷酸而除去双链DNA,留下单链信号探针ssDNA;
    (D)利用T-2毒素核酸适体-T-2毒素结合体不能诱导银离子还原生成近红外荧光银纳
    米簇,只有单链信号探针ssDNA能够诱导银离子还原成近红外荧光银纳米簇,检测体系的荧
    光强度,从而测定待测样品中的T-2毒素的含量。
    2.根据权利要求1所述的方法,其特征是,所述T-2毒素核酸适体为5’-
    CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGC-3’。
    3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征是,所述的单链信号探针ssDNA为5’-
    CCCCCCACACCCGATCCCCCCCGCGAGTCTTCACC-3’。
    4.一种检测T-2毒素的试剂盒,其特征是,其至少包括:T-2毒素核酸适体、可与T-2毒
    素核酸适体杂交的单链信号探针ssDNA、DNA扩增体系、核酸外切酶、银离子还原检测体系。
    5.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征是,所述T-2毒素核酸适体为5’-
    CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGC-3’。
    6.根据权利要求4所述的试剂盒,其特征是,所述的单链信号探针DNA为5’-
    CCCCCCACACCCGATCCCCCCCGCGAGTCTTCACC-3’。
    7.根据权利要求4中所述的检测T-2毒素的试剂盒,其特征是,所述DNA扩增体系包括
    缓冲溶液、dNTP和Phi29DNA聚合酶;所述缓冲溶液由Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4)组成。
    8.根据权利要求4中所述的检测T-2毒素的试剂盒,其特征是,所述核酸外切酶为Exo
    III核酸外切酶。
    9.根据权利要求4中所述的检测T-2毒素的试剂盒,其特征是,所述的银离子还原检测
    体系中还原剂为硼氢化物。
    10.根据权利要求9中所述的检测T-2毒素的试剂盒,其特征是,所述硼氢化物为硼氢化
    钠。

    说明书

    T-2毒素的检测方法及检测试剂盒

    技术领域

    本发明属纳米生物传感以及生物检测技术领域,具体地说,是提供一种T-2毒素的
    检测方法及检测试剂盒。

    背景技术

    T-2毒素(trichothecenes,TS)主要由三线镰刀菌等多种真菌产生的单端孢霉
    烯族化合物之一。1973年联合国粮农组织(FAQ)和世界卫生组织(WHO)在日内瓦召开的联席
    会议上,把这类毒素同黄曲霉素一样作为自然存在的最危险的食品污染源,它广泛分布于
    自然界,是常见的污染田间作物和库存谷物的主要毒素,对人、畜危害较大。T-2毒素在室
    温条件下非常稳定,放置6~7年或加热至100~120℃1小时不能破坏其毒性。目前还没有对
    T-2毒素中毒的特异性防治办法,唯一有效的预防办法是避免接触或减少接触。因此,对T-
    2毒素的检测非常必要。

    目前,检测T-2毒素的方法主要有:色谱法、免疫层析法、色谱-质谱联用法等方
    法。最近,中国专利CN105021593A公开了一种基于足点域和杂交链式反应测定T-2毒素
    的方法。

    但是,这些方法的各有其缺点:如色谱-质谱联用法,不仅仪器价格昂贵,且需药专
    门技术人员才能胜任,难于普及;免疫法试剂贵且易于失活;基于足点域和杂交链式反应测
    定T-2毒素的方法,需要使用价格昂贵的通过标记的DNA等不足。

    发明内容

    本发明的目的是针对现有技术中存在的问题,提供一种检T-2毒素的方法。本发明
    采用的技术方案:一种检T-2毒素的方法,包括如下步骤:

    (A)T-2毒素核酸适体(Apt)与单链信号探针ssDNA杂交,形成杂交链;

    (B)将待测样品溶液加入到该杂交链溶液,当待测样品中有T-2毒素时,杂交链选择性
    地与T-2毒素反应释放出单链信号探针ssDNA;

    (C)消除杂交链的干扰,利用DNA扩增,使杂交链成双链DNA,然后用核酸外切酶,将双链
    DNA水解成单核苷酸而清除双链DNA,留下单链信号探针ssDNA;

    (D)利用T-2毒素核酸适体-T-2毒素结合体不能诱导银离子还原成近红外荧光的银纳
    米簇,只有单链信号探针ssDNA能诱导银离子还原成近红外荧光银纳米簇,在银离子还原检
    测体系中检测体系荧光强度,从而测定待测样品中的T-2毒素的含量。

    所述银离子还原检测体系包括先后添加的银离子和使银离子还原成近红外荧光
    银纳米簇的硼氢化物还原剂,例如硼氢化钠。步骤(D)的检测,例如包括依次先后向体系中
    加入银离子溶液和硼氢化钠溶液,反应后生成近红外荧光银纳米簇。

    所述T-2毒素核酸适体为

    5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGC-
    3’。

    所述可与T-2毒素核酸适体杂交的单链信号探针ssDNA为5’-
    CCCCCCACACCCGATCCCCCCCGCGAGTCTTCACC-3’。

    本发明的检测原理如下:先让Apt与ssDNA杂交(下划线部分);当有T-2毒素存在
    时,杂交链与T-2毒素反应释放出ssDNA;体系中存在Apt-ssDNA(剩余的),Apt-T-2毒素
    和ssDNA。Apt-T-2毒素不能诱导银离子还原成近红外荧光银纳米簇,Apt-T-2毒素存在对测
    定无干扰;杂交链可能有干扰;为了消除杂交链的干扰:a.利用DNA扩增,使杂交链成双链
    DNA,b.用核酸外切酶,将双链DNA水解成单核苷酸,从而清除体系中的双链DNA。此时体系
    中只留下可诱导生成近红外荧光银纳米簇的ssDNA,通过检测体系的荧光强度,可以测定T-
    2毒素的含量。由于消除体系中背景荧光的干扰,提高了检测的灵敏度和精度。

    本发明另外提供了一种检测T-2毒素的试剂盒,其至少包括:T-2毒素核酸适体、可
    与T-2毒素核酸适体杂交的单链信号探针ssDNA、DNA扩增体系、外切酶、银离子还原检测体
    系。

    所述T-2毒素核酸适体为5’-CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACA
    CATGCGAGAGGTGAAGACTCGC-3’。

    所述的单链信号探针ssDNA为5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCCGCGAGTCTTCACC-3’。

    所述DNA扩增体系包括缓冲溶液、dNTP和Phi29DNA聚合酶;所述缓冲溶液由
    Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4组成。

    所述外切酶为ExoIII核酸外切酶。

    所述的银离子还原检测体系中还原剂为硼氢化物。

    所述硼氢化物为硼氢化钠。

    本发明还提供了一种可用于检测T-2毒素的T-2毒素核酸适体,其碱基序列为5’-
    CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACAC

    ATGCGAGAGGTGAAGACTCGC-3’。

    本发明的优点

    根据本发明的检测方法和试剂盒,消除了背景荧光的干扰,提高了T-2毒素的检测灵敏
    度和精度。

    附图说明

    图1为ssDNA-Ag纳米簇荧光强度与T-2毒素的浓度关系。

    具体实施方式

    实施例1

    一种检测T-2毒素的试剂盒至少包括:T-2毒素核酸适体、单链信号探针ssDNA、DNA扩增
    体系、核酸外切酶、银离子还原检测体系。T-2毒素核酸适体为5’-
    CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGC-3’。单链信
    号探针ssDNA为5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCCGCGAGTCTTCACC-3’。DNA扩增体系包括缓冲溶
    液、dNTP和Phi29DNA聚合酶;所述缓冲溶液由Tris-HCl、MgCl2、(NH4)2SO4组成。核酸外切
    酶为ExoIII核酸外切酶。所述的银离子还原检测体系中的还原剂为硼氢化物,如硼氢化
    钠。

    实施例2

    一种检测T-2毒素的方法,具体操作过程如下:

    将各DNA储备液在95℃下经加热处理5分钟,使用前,并在室温下放置30分钟。然后,分
    别取含3.0μmolT-2毒素核酸适体(Apt)的杂交缓冲溶液40μL和3.0μmol信号探针ssDNA
    的杂交缓冲溶液40μL置于2ml离心管中,在37℃下杂交1小时,生成T-2毒素核酸适体-信
    号探针杂交物(Apt-ssDNA)。

    在37℃下,分别依次将浓度为0~1.0ng/mL的T-2毒素添加到Apt-ssDNA溶液
    中,T-2毒素与T-2毒素核酸适体反应,生成核酸适体-T-2毒素,释放出ssDNA。这时,体系中
    有ssDNA、剩余(未反应的)APT-ssDNA和核酸适体-T-2毒素等物质。

    加入10μL缓冲溶液(缓冲溶液组成为50mMTris-HCl,10mMMgCl2,10mM
    (NH4)2SO4,pH7.5),然后加入dNTP(10mM)18μL。再向体系中加入2μLPhi29DNA聚合
    酶(10u/μl),在37℃下反应15分钟,使得以T-2毒素核酸适体-信号探针杂交序列(Ap-
    ssDNA)为摸板扩增成双链DNA。在65℃下保持10分钟使Phi29DNA去活。

    再向该反应体系中加入2μLExoIII核酸外切酶(20u/μL),在37℃下反应30分
    钟,使选择性地将双链DNA水解成单核苷酸而清除双链DNA,单链探针ssDNA不水解而保留下
    来。

    向反应液中加入25μL1mmol硝酸银和180μL柠檬酸钠缓冲液(10mM,pH7.0)。
    然后,混合物在室温下避光或暗室中放置10分钟后,在快速搅拌下,加入100μL浓度为200μM
    的新制备的硼氢化钠溶液。然后在45℃下反应5~10min。将溶液转移至微量比色皿,测定
    体系的荧光强度,进行T-2毒素的定量测定,结果如图1所示。

    线性范围0.008–0.20ng/mL,检测限5pg/mL,回收率在95.5~105.7%。其它真菌毒
    素、维生素C、葡萄糖等生物小分子T-2毒素的检测无干扰。

    <110>湖南科技大学

    <120>T-2毒素的检测方法及检测试剂盒

    <160>2

    <210>1

    <211>67

    <212>DNA

    <213>T-2毒素核酸适体

    <400>1

    5’CAGCTCAGAAGCTTGATCCTGTATATCAAGCATCGCGTGTTTACACATGCGAGAGGTGAAGACTCGC-3’



    <210>2

    <211>35

    <212>DNA

    <213>单链信号探针

    <400>2

    5’-CCCCCCACACCCGATCCCCCCCGCGAGTCTTCACC-3’

    关 键 词:
    T2 毒素 检测 方法 试剂盒
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