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    重庆时时彩前三重码: 纳米银增强的比率型FRET探针及其制备方法与应用.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201610150965.8

    申请日:

    2016.03.16

    公开号:

    CN105606580A

    公开日:

    2016.05.25

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 21/64申请日:20160316|||公开
    IPC分类号: G01N21/64 主分类号: G01N21/64
    申请人: 南京大学
    发明人: 许丹科; 李慧
    地址: 210093 江苏省南京市仙林大道163号
    优先权:
    专利代理机构: 南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204 代理人: 肖明芳
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201610150965.8

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2018.01.12|||2016.06.22|||2016.05.25

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了纳米银增强的比率型FRET探针,它以十面体的纳米银球为内核,银球外表面键合有三种不同的核酸链形成荧光共振能量转移探针。本发明还公开了上述探针的制备方法和应用。此探针的特点是当存在目标物时,515nm和565nm处的荧光强度会同时发生变化,而两个波长下荧光强度的比值与目标物的浓度存在一定的线性关系。此种定量检测的方式不仅可以提高检测的灵敏度而且可以避免假阳性信号和外界环境的干扰。本发明还公开了包含上述探针的试剂盒及其在检测PDGF-BB中的应用。本方法检测PDGF-BB的线性范围为3.12ng/mL-200ng/mL,检测限低,特异性好。

    权利要求书

    1.纳米银增强的比率型FRET探针,其特征在于,它以直径为50nm的十面体纳
    米银为内核,十面体纳米银外表面键合有三种核酸链;
    其中,
    A链为:
    A-FITC:5'-SHC6-AAAAAAAAAAAGGTACGGATCTGCG-FITC-3';或者
    A-AlexFluor488:5'-SHC6-AAAAAAAAAAAGGTACGGATCTGCG-AlexFluor
    488-3';
    B链为:5'-GTGCCGTAGCCTGCGCAGATCCGTACCT-3'
    C链为:5'-Cy3-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-BHQ-2-3'。
    2.权利要求1所述的纳米银增强的比率型FRET探针的制备方法,其特征在于,
    它包括如下步骤:
    (1)将柠檬酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、L-精氨酸、硝酸银加入至高纯水中,然后加入
    硼氢化钠混合均匀,其中柠檬酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、L-精氨酸、硝酸银、硼氢化钠
    的摩尔比为(1~99):(0.1~9):(0.1~9):(0.1~9):(1~99),高纯水的质量是聚乙烯吡咯烷酮质量的
    100~999倍,置于12W-120W的蓝色LED灯下照射6-94h得到十面体的纳米银Ag10NPs
    溶液;
    (2)将A链、B链、C链按摩尔比(1~99):(1~99):(1~99)加入步骤(1)得到的Ag10NPs
    溶液中,A链、B链、C链三条链的总体积与Ag10NPs的体积为之比为1:(10-100);
    (3)向步骤(2)得到的混合体系中加入1~5mol/L氯化钠溶液,静置2~4小时,重复
    加入氯化钠溶液与静置的步骤1~4次,使得氯化钠的终浓度为0.1~0.3mol/L;
    (4)将步骤(3)得到的混合体系静置6~24小时;
    (5)将步骤(4)得到的溶液经离心去除上清,取沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬,重复
    离心与重悬的步骤2~4次,1×PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的
    0.1~5倍;最后离心得到的沉淀用1×PBSM缓冲溶液重悬即得备用探针。
    3.根据权利要求2所述的纳米银增强的比率型FRET探针的制备方法,其特征在
    于,步骤(5)中,所述的离心条件为6000~15000rpm条件下离心8~20分钟。
    4.权利要求1所述的纳米银增强的比率型FRET探针在制备检测PDGF-BB的试剂
    中的应用。
    5.一种用于检测PDGF-BB的试剂盒,其特征在于,该试剂盒包含如下试剂:权利
    要求1所述的纳米银增强的比率型FRET探针、磷酸盐缓冲液、PDGF-BB蛋白、牛血
    清白蛋白、96孔荧光板。
    6.权利要求5所述的用于检测PDGF-BB的试剂盒在制备检测PDGF-BB试剂中的
    应用。
    7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,利用检测PDGF-BB的试剂盒检测
    PDGF-BB含量的具体方法,依次顺序包括如下步骤:
    (1)配制溶液:
    缓冲溶液:将20×PBS用二次水稀释20倍至1×PBS,然后加入1mM氯化镁制备
    得到1×PBS;将1×PBS稀释10倍成为0.1×PBS,然后加入0.3M氯化钠和1mM氯化
    镁制备得到0.3MPBSM;将0.1g牛血清白蛋白溶解于100mL1×PBS溶液中得到
    1mg/mLBSA,加入1mM氯化镁得到1mg/mLBSAM溶液;在0.3MPBSM溶液中加
    入1mg/mLBSA得到0.3MBSAM;
    阴性对照:1mg/mLBSA;
    权利要求1所述的纳米银增强的比率型FRET探针;
    (2)将比率型FRET探针分别与不同浓度的PDGF-BB溶液以及待测样本混合反应
    50分钟;
    (3)用BioTeK酶标仪直接扫描,激发波长为470nm,发射波长为515nm和565nm,
    通过同时计算515nm和565nm的荧光强度比值来定量分析目标蛋白质的浓度,不同浓
    度的PDGF-BB溶液对应不同的比值,得到PDGF-BB标准曲线,由标准曲线计算得到
    样品中PDGF-BB的浓度。

    说明书

    纳米银增强的比率型FRET探针及其制备方法与应用

    技术领域

    本发明属于生物检测技术领域,具体涉及纳米银增强的比率型FRET探针及其制备
    方法和在检测PDGF-BB中的应用。

    背景技术

    荧光检测由于其具有灵敏的检测特性,因此受到广泛的关注和应用。荧光共振能量
    转移(FluorescenceResonanceEnergyTransfer,FRET)是一种十分灵敏且应用广泛的荧
    光技术,可以用于目标分子浓度测定,分子之间相互作用测定以及催化活性测定等等。
    基于FRET的传感方法比传统的免疫分析方法更为简单方便,既不需要清洗分离等繁琐
    的步骤,也不需要加入催化剂或其他辅助试剂。十面体纳米银相比球形纳米银
    (CN103525815A,CN104569420A)具有更优良的增强荧光特性,可以显著提高荧光
    检测的灵敏度。利用十面体纳米银增强荧光的特性发展新的基于FRET的传感分析方法
    实现蛋白质的灵敏准确检测是十分有意义的。目前基于FRET探针检测蛋白质的文献十
    分稀少,我们曾发展了一种基于纳米银的单通道FRET技术用于蛋白质的检测(Anal.Chem.
    2013,85,4492-4499)。在本专利中,为了进一步增加FRET技术的准确性和抗干扰性,我们
    发展了基于双通道模式的FRET传感探针(即比率型FRET探针)用于蛋白质的分析检测。

    发明内容

    本发明所要解决的技术问题是提供一种纳米银增强的比率型FRET探针,用于
    PDGF-BB的灵敏准确检测。

    本发明还要解决的技术问题,是提供包含上述比率型FRET探针的制备方法。

    本发明还要解决的技术问题,是提供上述探针在检测PDGF-BB中的应用。

    为解决上述技术问题,本发明采用的技术方案如下:

    纳米银增强的比率型FRET探针,它以直径为50nm的十面体纳米银为内核,十面
    体纳米银外表面键合有三种核酸链;

    其中,

    A链为:

    A-FITC:5'-SHC6-AAAAAAAAAAAGGTACGGATCTGCG-FITC-3';或者

    A-AlexFluor488:5'-SHC6-AAAAAAAAAAAGGTACGGATCTGCG-AlexFluor
    488-3';

    B链为:5'-GTGCCGTAGCCTGCGCAGATCCGTACCT-3'

    C链为:5'-Cy3-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-BHQ-2-3'。

    此探针的特点是当存在目标物时,515nm和565nm处的荧光强度会同时发生变
    化,而两个波长下荧光强度的比值与目标物的浓度存在一定的线性关系。此种定量检测
    的方式不仅可以提高检测的灵敏度而且可以避免假阳性信号和外界环境的干扰。

    上述纳米银增强的比率型FRET探针的制备方法,它包括如下步骤:

    (1)将柠檬酸钠、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、L-精氨酸、硝酸银加入至高纯水中,然
    后加入硼氢化钠混合均匀,其中柠檬酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、L-精氨酸、硝酸银、硼
    氢化钠的摩尔比为(1~99):(0.1~9):(0.1~9):(0.1~9):(1~99),高纯水的质量是聚乙烯吡咯烷酮
    质量的100~999倍,置于12W-120W的蓝色LED灯下照射6-94h得到十面体的纳米银
    Ag10NPs溶液;

    (2)将A链、B链、C链按摩尔比(1~99):(1~99):(1~99)加入步骤(1)得到的Ag10NPs
    溶液中,A链、B链、C链三条链的总体积与Ag10NPs的体积为之比为1:(10-100);

    (3)向步骤(2)得到的混合体系中加入1~5mol/L氯化钠溶液,静置2~4小时,重复
    加入氯化钠溶液与静置的步骤1~4次,使得氯化钠的终浓度为0.1~0.5mol/L;

    (4)将步骤(3)得到的混合体系静置6~24小时;

    (5)将步骤(4)得到的溶液经离心去除上清,取沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬,重复
    离心与重悬的步骤2~4次(优选2次),1×PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混
    合体系体积的0.1~5倍;最后离心得到的沉淀用1×PBSM缓冲溶液重悬即得备用探针。

    步骤(1)中,柠檬酸钠、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、L-精氨酸、硝酸银、硼氢化钠的优
    选的摩尔比为30:0.9:1:4:16。

    步骤(1)中,水和PVP的优选质量比为194:1。

    步骤(1)中,一般来说,LED灯的功率越高,需要的时间越短,功率每增加一倍,
    光照的时间减少一半。优选在24W的蓝色LED灯下照射48h。

    步骤(2)中,A链、B链、C链优选按摩尔比1:1:1加入步骤(1)得到的Ag10NPs溶液
    中,三条链的浓度分别为1-50μM,其最佳浓度为10μM。

    步骤(2)中,A链、B链、C链三条链的总体积与Ag10NPs的体积为之比优选为1:13。

    步骤(3)中,优选向步骤(2)得到的混合体系中加入2mol/L氯化钠溶液,静置2小时。

    步骤(3)中,优选重复加入氯化钠溶液与静置的步骤3次,使得氯化钠的终浓度为
    0.3mol/L。

    步骤(4)中,优选将步骤(3)得到的混合体系静置12小时。

    步骤(5)中,所述的1×PBS缓冲溶液的配方如下:137mMNaCl,2.7mMKCl,10mM
    Na2HPO4·12H2O,2mMKH2PO4,溶剂为水。

    步骤(5)中,1×PBS缓冲溶液每次的加入体积优选为待加入的混合体系体积的1倍。

    步骤(5)中,所述的1×PBSM配方为1×PBS和1mmol/LMgCl2的混合物。

    步骤(5)中,所述的离心条件为6000~15000rpm条件下离心8~20分钟,优选离心条
    件为12000rpm,12分钟。

    上述纳米银增强的比率型FRET探针在制备检测PDGF-BB的试剂中的应用也在本
    发明的?;し段е?。

    一种用于检测PDGF-BB的试剂盒,该试剂盒包含如下试剂:权利要求1所述的纳
    米银增强的比率型FRET探针、磷酸盐缓冲液、PDGF-BB蛋白、牛血清白蛋白、96孔
    荧光板。

    上述用于检测PDGF-BB的试剂盒在制备检测PDGF-BB试剂中的应用也在本发明
    的?;し段е?。

    其中,利用检测PDGF-BB的试剂盒检测PDGF-BB含量的具体方法,依次顺序包
    括如下步骤:

    (1)配制溶液:

    缓冲溶液:将20×PBS用二次水稀释20倍至1×PBS,然后加入1mM氯化镁制备
    得到1×PBS;将1×PBS稀释10倍成为0.1×PBS,然后加入0.3M氯化钠和1mM氯化
    镁制备得到0.3MPBSM;将0.1g牛血清白蛋白溶解于100mL1×PBS溶液中得到
    1mg/mLBSA,加入1mM氯化镁得到1mg/mLBSAM溶液;在0.3MPBSM溶液中加
    入1mg/mLBSA得到0.3MBSAM;

    阴性对照:1mg/mLBSA;

    上述纳米银增强的比率型FRET探针;

    (2)将比率型FRET探针分别与不同浓度的PDGF-BB溶液以及待测样本混合反应
    50分钟;

    (3)用BioTeK酶标仪直接扫描,激发波长为470nm,发射波长为515nm和565nm,
    通过同时计算515nm和565nm的荧光强度比值来定量分析目标蛋白质的浓度,不同浓
    度的PDGF-BB溶液对应不同的比值,得到PDGF-BB标准曲线,由标准曲线计算得到
    样品中PDGF-BB的浓度。

    有益效果:本发明的比率型FRET探针既不需要使用抗体,也不需要形成夹心结构,
    直接加入待测物,就能呈现变化,从而定性或定量分析目标物。利用FRET技术可以实
    现对PDGF-BB的灵敏和准确检测,对PDGF-BB的分析范围为3.12ng/mL-200ng/mL,且
    特异性好不仅避免了假阳性信号的产生而且减少了外界环境对检测的干扰,信号采集方
    式简单快速。

    附图说明

    图1比率型FRET探针的合成与检测PDGF-BB的示意图。

    图2Ag-Alex探针以及银增强的FRET探针的荧光光谱图。

    图3检测到PDGF-BB的结果图,其中,(a)是比率型FRET探针检测PDGF-BB
    的特异性,(b)是三种不同探针检测PDGF-BB的结果图。

    图4不同浓度PDGF-BB与荧光强度关系图,其中,(a)FRET探针为12.5μL,(b)
    比率型FRET探针为6.2μL。

    具体实施方式

    根据下述实施例,可以更好地理解本发明。然而,本领域的技术人员容易理解,实
    施例所描述的内容仅用于说明本发明,而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的
    本发明。

    实施例1:银增强的FRET探针的合成

    (1)将柠檬酸钠(15mL,50mM)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP,1.5mM,15mL)、L-精氨
    酸(2.5mL,10mM)、硝酸银(10mL,10mM)加入至高纯水(175mL)中,然后加入硼
    氢化钠(0.8mL,500mM)混合均匀置于24W的蓝色LED灯下照射48h得到十面体的纳
    米银Ag10NPs溶液;

    (2)将A链、B链、C链按摩尔比1:1:1加入步骤(1)得到的Ag10NPs溶液中,A链、
    B链、C链三条链浓度和体积为分别10μM,12.5μL,纳米银的体积为0.5mL。

    所述的A链、B链、C链分别如下:

    A链为:

    A-AlexFluor488:5'-SHC6-AAAAAAAAAAAGGTACGGATCTGCG-AlexFluor
    488-3';

    B链为:5'-GTGCCGTAGCCTGCGCAGATCCGTACCT-3'

    C链为:5'-Cy3-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-BHQ-2-3'。

    (3)向步骤(2)得到的混合体系中加入2mol/L氯化钠溶液,静置2小时,重复加入
    氯化钠溶液与静置的步骤2次,使得氯化钠的终浓度为0.3mol/L;

    (4)将步骤(3)得到的混合体系静置12小时;

    (5)将步骤(4)得到的溶液经离心去除上清,取沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬,重复离心
    与重悬的步骤2次,1×PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的1倍;
    最后离心得到的沉淀用1×PBSM缓冲溶液重悬即得备用探针Ag-Alex/Cy3/BHQ-2。探针
    的荧光光谱图如图2。

    实施例2:银增强的FRET探针的合成

    (1)将柠檬酸钠(15mL,50mM)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP,1.5mM,15mL)、L-精氨
    酸(2.5mL,10mM)、硝酸银(10mL,10mM)加入至高纯水(175mL)中,然后加入硼
    氢化钠(0.8mL,500mM)混合均匀置于24W的蓝色LED灯下照射48h得到十面体的纳
    米银Ag10NPs溶液;

    (2)将A链、B链、C链按摩尔比1:1:1加入步骤(1)得到的Ag10NPs溶液中,A链、
    B链、C链三条链浓度和体积为分别10μM,12.5μL,纳米银的体积为0.5mL。

    所述的A链、B链、C链分别如下:

    A链为:

    A-FITC:5'-SHC6-AAAAAAAAAAAGGTACGGATCTGCG-FITC-3';

    B链为:5'-GTGCCGTAGCCTGCGCAGATCCGTACCT-3'

    C链为:5'-Cy3-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-BHQ-2-3'。

    (3)向步骤(2)得到的混合体系中加入2mol/L氯化钠溶液,静置2小时,重复加入
    氯化钠溶液与静置的步骤2次,使得氯化钠的终浓度为0.3mol/L;

    (4)将步骤(3)得到的混合体系静置12小时;

    (5)将步骤(4)得到的溶液经离心去除上清,取沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬,重复离心
    与重悬的步骤2次,1×PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的1倍;
    最后离心得到的沉淀用1×PBSM缓冲溶液重悬即得备用探针Ag-FITC/Cy3/BHQ-2。

    实施例3:

    (1)将柠檬酸钠(15mL,500mM)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP,15mM,15mL)、L-精氨
    酸(2.5mL,100mM)、硝酸银(10mL,100mM)加入至高纯水(175mL)中,然后加入
    硼氢化钠(0.8mL,500mM)混合均匀置于24W的蓝色LED灯下照射94h得到十面体的
    纳米银Ag10NPs溶液;

    (2)将A链、B链、C链按摩尔比1:1:1加入步骤(1)得到的Ag10NPs溶液中,A链、
    B链、C链三条链浓度和体积为10μM,5μL,纳米银的体积为0.5mL。

    所述的A链、B链、C链分别如下:

    A链为:

    A-AlexFluor488:5'-SHC6-AAAAAAAAAAAGGTACGGATCTGCG-AlexFluor
    488-3';

    B链为:5'-GTGCCGTAGCCTGCGCAGATCCGTACCT-3'

    C链为:5'-Cy3-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-BHQ-2-3'。

    (3)向步骤(2)得到的混合体系中加入2mol/L氯化钠溶液,静置2小时,重复加入
    氯化钠溶液与静置的步骤2次,使得氯化钠的终浓度为0.3mol/L;

    (4)将步骤(3)得到的混合体系静置24小时;

    (5)将步骤(4)得到的溶液经离心去除上清,取沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬,重复
    离心与重悬的步骤2次,1×PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的2
    倍;最后离心得到的沉淀用1×PBSM缓冲溶液重悬即得备用探针。

    实施例4:

    (1)将柠檬酸钠(15mL,5mM)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP,0.15mM,15mL)、L-精氨
    酸(2.5mL,1mM)、硝酸银(10mL,1mM)加入至高纯水(175mL)中,然后加入硼氢
    化钠(0.8mL,50mM)混合均匀置于24W的蓝色LED灯下照射24h得到十面体的纳米
    银Ag10NPs溶液;

    (2)将A链、B链、C链按摩尔比1:1:1加入步骤(1)得到的Ag10NPs溶液中,A链、
    B链、C链三条链浓度和体积为10μM,7.5μL,纳米银的体积为2mL。

    所述的A链、B链、C链分别如下:

    A链为:

    A-AlexFluor488:5'-SHC6-AAAAAAAAAAAGGTACGGATCTGCG-AlexFluor
    488-3';

    B链为:5'-GTGCCGTAGCCTGCGCAGATCCGTACCT-3'

    C链为:5'-Cy3-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-BHQ-2-3'。

    (3)向步骤(2)得到的混合体系中加入2mol/L氯化钠溶液,静置4小时,重复加入
    氯化钠溶液与静置的步骤2次,使得氯化钠的终浓度为0.3mol/L;

    (4)将步骤(3)得到的混合体系静置12小时;

    (5)将步骤(4)得到的溶液经离心去除上清,取沉淀加入1×PBS缓冲溶液重悬,重复
    离心与重悬的步骤2次,1×PBS缓冲溶液每次的加入体积为待加入的混合体系体积的1
    倍;最后离心得到的沉淀用1×PBSM缓冲溶液重悬即得备用探针。

    实施例5:特异性检测

    探针的合成按照实施例1-3合成,

    (1)配制溶液:

    缓冲溶液:将20×PBS用二次水稀释20倍至1×PBS,然后加入1mM氯化镁制备
    得到1×PBS;将1×PBS稀释10倍成为0.1×PBS,然后加入0.3M氯化钠和1mM氯化
    镁制备得到0.3MPBSM;将0.1g牛血清白蛋白溶解于100mL1×PBS溶液中得到
    1mg/mLBSA,加入1mM氯化镁得到1mg/mLBSAM溶液;在0.3MPBSM溶液中加
    入1mg/mLBSA得到0.3MBSAM;

    阴性对照:1mg/mLBSA;

    上述纳米银增强的比率型FRET探针;

    (2)将比率型FRET探针分别与不同待测物如PDGF-AB,PDGF-BB,PDGF-AA,
    2%serum混合反应50分钟;

    (3)用BioTeK酶标仪直接扫描,激发波长为470nm,发射波长为515nm和565nm。
    通过同时计算515nm和565nm的荧光强度比值来定量分析目标物的浓度,其反应的原
    理图如图1,实验结果如图3a。按照实施例1制备的FRET探针对PDGF-AA,PDGF-AB
    以及血清的非特异性吸附小,对PDGF-BB具有高亲和性。

    实施例6:灵敏度分析

    对照探针Ag-Alex/Cy3的制备方法:

    (1)将A链、B链、C对照链按摩尔比1:1:1加入步骤(1)得到的Ag10NPs溶液中,
    A链、B链、C对照链三条链浓度和体积为10μM,12.5μL,纳米银的体积为0.5mL。

    所述的A链、B链、C对照链分别如下:

    A链为:

    A-AlexFluor488:5'-SHC6-AAAAAAAAAAAGGTACGGATCTGCG-AlexFluor
    488-3';

    B链为:5'-GTGCCGTAGCCTGCGCAGATCCGTACCT-3'

    C对照链为:5'-Cy3-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3'。

    其他步骤按照实施例1-3合成不同探针。

    对照探针Alex/Cy3/BHQ-2的制备方法:

    将(1)将A链、B链、C对照链按摩尔比1:1:1混合反应1h,A链、B链、C对照
    链三条链浓度和体积为10μM,12.5μL,反应后将其稀释至于本专利探针相同的浓度。

    所述的A链、B链、C对照链分别如下:

    A链为:

    A-AlexFluor488:5'-SHC6-AAAAAAAAAAAGGTACGGATCTGCG-AlexFluor
    488-3';

    B链为:5'-GTGCCGTAGCCTGCGCAGATCCGTACCT-3'

    C对照链为:5'-Cy3-CAGGCTACGGCACGTAGAGCATCACCATGATCCTG-3'。

    分析三种探针Ag-Alex/Cy3,Ag-Alex/Cy3/BHQ-2以及Alex/Cy3/BHQ-2检测蛋白质
    PDGF-BB的灵敏度。

    按照实施例4的操作步骤,

    (1)将不同FRET探针与待测物PDGF-BB混合反应50分钟;

    (2)用BioTeK酶标仪直接扫描,激发波长为470nm,发射波长为515nm和565nm。
    通过同时计算515nm和565nm的荧光强度比值来分析不同探针的灵敏度,实验结果如
    图3b。结果显示,本专利制备的Ag-Alex/Cy3/BHQ-2探针具有更高的灵敏度。

    实施例7:检测PDGF-BB含量的方法

    探针的合成按照实施例1-3合成,

    (1)将比率型FRET探针分别与不同浓度的PDGF-BB混合反应50分钟;

    (2)用BioTeK酶标仪直接扫描,激发波长为470nm,发射波长为515nm和565nm。
    通过同时计算515nm和565nm的荧光强度比值来定量分析目标蛋白质的浓度,不同浓
    度的PDGF-BB溶液对应不同的比值,得到PDGF-BB标准曲线,由标准曲线计算得到
    样品中PDGF-BB的浓度。不同体积的探针得到的PDGF-BB的标准曲线如图4。

    本发明将比率型FRET探针应用于PDGF-BB的分析检测中,当PDGF-BB的浓度在
    3.12ng/mL-200ng/mL之间,荧光信号强度与浓度具有很好的相关性,相关系数为
    0.989。本本方法能大大提高荧光检测的灵敏度,不仅可以避免假阳性信号的产生而且可
    以防止外界环境的干扰,信号采集方式简单快速。



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    纳米 增强 比率 FRET 探针 及其 制备 方法 应用
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