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    重庆时时彩新手教程: 一种测定交联透明质酸钠凝胶中二巯基聚乙二醇残留的方法.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201510979778.6

    申请日:

    2015.12.22

    公开号:

    CN105606602A

    公开日:

    2016.05.25

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):G01N 21/78申请日:20151222|||公开
    IPC分类号: G01N21/78; G01N21/31 主分类号: G01N21/78
    申请人: 上海景峰制药有限公司
    发明人: 叶湘武; 曹邦静; 付爱玲; 罗斌
    地址: 200120 上海市宝山区罗新路50号
    优先权:
    专利代理机构: 上海天翔知识产权代理有限公司 31224 代理人: 吕伴
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201510979778.6

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2016.06.22|||2016.05.25

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及一种测定交联透明质酸钠凝胶中二巯基聚乙二醇(PEG-dithiol)残留的检测方法,依据Ellman’s试剂与巯基反应生成的化合物与PEG-dithiol的含量在412nm处呈线性关系的原理建立了一种操作简单、快速的交联凝胶中PEG-dithiol残留的检测方法。该检测方法在40-200μg/ml范围内具有良好的线性关系,尤其可用于大分子交联凝胶的检测。

    权利要求书

    1.一种测定交联透明质酸钠凝胶中二巯基聚乙二醇的方法,其特征在
    于,包括以下步骤:
    (1)磷酸盐缓冲液的制备:取无水磷酸氢二钠912mg,一水合磷酸二氢
    钠300mg,加水使溶解成500ml,得到pH值为7.4的磷酸盐缓冲液;
    (2)PEG-dithiol对照品溶液的制备:精密称取二巯基聚乙二醇对照品
    40mg,置20ml量瓶中,加pH值为7.4的磷酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度,
    摇匀;精密量取5ml,置25ml量瓶中,加pH值为7.4的磷酸盐缓冲液稀释至
    刻度,制成浓度为0.4mg/ml的PEG-dithiol对照品溶液;
    (3)醋酸盐缓冲液的制备:取11.55ml冰醋酸,定容至1000ml,得到浓
    度为0.2mol/L醋酸;称取16.4g无水醋酸钠或27.2g三水合醋酸钠溶于
    1000ml水中,得到浓度为0.2mol/L醋酸钠;取148ml浓度为0.2mol/L醋酸
    溶液与352ml浓度为0.2mol/L醋酸钠溶液混匀,得到pH为5.0、浓度为
    0.2mol/L醋酸盐缓冲液;
    (4)酶溶液的制备:称取simga公司出品的809U/mg透明质酸酶30mg,
    加pH值为5.0、浓度为0.2mol/L醋酸盐缓冲液溶解制成10ml酶溶液;
    (5)样品溶液制备:取交联透明质酸钠凝胶1.0g,加1.0ml步骤(4)
    制备的酶溶液,置37℃降解2.0h,使凝胶降解成样品溶液备用;
    (6)反应缓冲液制备:称取35.814g十二水合磷酸氢二钠,加水溶解使
    成100ml,得到浓度为1mol/L磷酸氢二钠溶液;称取15.601g二水合磷酸二
    氢钠,加水溶解使成100ml,得到浓度为1mol/L的磷酸二氢钠溶液;吸取
    9.32ml的浓度为1mol/L磷酸氢二钠溶液及0.68ml的浓度为1mol/L的磷酸二
    氢钠溶液加水稀释至90ml,混匀,用氢氧化钠试液调pH值至8.0,加水定至
    100ml,得到pH值为8.0、浓度为0.1mol/L磷酸钠溶液;称取0.03724gEDTA
    至pH值为8.0、浓度为0.1mol/L磷酸钠溶液中,混匀,得到pH值为8.0、
    浓度为0.1mol/L反应缓冲液;
    (7)DTNB溶液的制备:称取40mgDTNB,加步骤(6)制备的反应缓冲
    液溶解制成DTNB溶液备用;
    (8)标准曲线的制备:精密量取步骤(2)制备的PEG-dithiol对照品
    溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8ml、1.0ml置1.5ml离心管中,依次加入pH值
    为7.4磷酸盐缓冲液至1.0ml,混匀;分取上述溶液各0.5ml,加0.5ml步骤
    (4)制备的酶溶液,混匀,37℃放置约2.0h,再分别步骤(6)制备的反应
    缓冲液5.0ml,涡旋混匀,加入步骤(7)制备的DTNB溶液0.2ml,混匀,室
    温放置15分钟;以对照品溶液0ml经上述方法制备的溶液为空白,在412nm
    的波长处测定吸光度,以对照品溶液的浓度对相应的吸光度计算回归方程;
    (9)交联透明质酸钠凝胶PEG-dithiol残留的测定:取步骤(5)制备
    所得的样品溶液1.0ml,按步骤(8)加入步骤(6)制备的反应缓冲液和步骤
    (7)制备的DTNB溶液反应15分钟,在412nm的波长处测定吸光度,根据回
    归方程计算交联透明质酸钠凝胶中PEG-dithiol的残留。
    2.如权利要求1所述的测定交联透明质酸钠凝胶中二巯基聚乙二醇的方
    法,其特征在于,所述步骤(4)中制备的酶溶液为2400U/ml酶溶液。
    3.如权利要求1所述的测定交联透明质酸钠凝胶中二巯基聚乙二醇残留
    的方法,其特征在于:可测定的PEG-dithiol的分子量为3400Da。

    说明书

    一种测定交联透明质酸钠凝胶中二巯基聚乙二醇残留的方法

    技术领域:

    本发明涉及生物化学、药物化学与药物分析技术领域,具体涉及一种测
    定交联透明质酸钠凝胶中二巯基聚乙二醇残留的方法。

    背景技术:

    二巯基聚乙二醇,在目前公开的文献中,尚无其毒理数据。鉴于产品的
    使用安全性考虑,有必要对产品中残留的PEG-dithiol进行残留量限度检测。
    目前未有文献报道此物质含量或残余量的检测方法。

    发明内容:

    本发明的目的是提供一种测定交联透明质酸钠凝胶中二巯基聚乙二醇残
    留的检测方法,以解决二巯基聚乙二醇残留所导致的安全性问题,该方法检
    测准确,检验成本、检验效率高、检验工作开展方便。

    为实现本发明的目的,本发明所采用的技术方案是:

    一种测定交联透明质酸钠凝胶中二巯基聚乙二醇的方法,其特征在于,
    包括以下步骤:

    (1)磷酸盐缓冲液的制备:取无水磷酸氢二钠912mg,一水合磷酸二氢
    钠300mg,加水使溶解成500ml,得到pH值为7.4的磷酸盐缓冲液;

    (2)PEG-dithiol对照品溶液的制备:精密称取二巯基聚乙二醇对照品
    40mg,置20ml量瓶中,加pH值为7.4的磷酸盐缓冲液溶解并稀释至刻度,
    摇匀;精密量取5ml,置25ml量瓶中,加pH值为7.4的磷酸盐缓冲液稀释至
    刻度,制成浓度为0.4mg/ml的PEG-dithiol对照品溶液;

    (3)醋酸盐缓冲液的制备:取11.55ml冰醋酸,定容至1000ml,得到浓
    度为0.2mol/L醋酸;称取16.4g无水醋酸钠或27.2g三水合醋酸钠溶于
    1000ml水中,得到浓度为0.2mol/L醋酸钠;取148ml浓度为0.2mol/L醋酸
    溶液与352ml浓度为0.2mol/L醋酸钠溶液混匀,得到pH为5.0、浓度为
    0.2mol/L醋酸盐缓冲液;

    (4)酶溶液的制备:称取simga公司出品的809U/mg透明质酸酶30mg,
    加pH值为5.0、浓度为0.2mol/L醋酸盐缓冲液溶解制成10ml酶溶液;

    (5)样品溶液制备:取交联透明质酸钠凝胶1.0g,加1.0ml步骤(4)
    制备的酶溶液,置37℃降解2.0h,使凝胶降解成样品溶液备用;

    (6)反应缓冲液制备:称取35.814g十二水合磷酸氢二钠,加水溶解使
    成100ml,得到浓度为1mol/L磷酸氢二钠溶液;称取15.601g二水合磷酸二
    氢钠,加水溶解使成100ml,得到浓度为1mol/L的磷酸二氢钠溶液;吸取
    9.32ml的浓度为1mol/L磷酸氢二钠溶液及0.68ml的浓度为1mol/L的磷酸二
    氢钠溶液加水稀释至90ml,混匀,用氢氧化钠试液调pH值至8.0,加水定至
    100ml,得到pH值为8.0、浓度为0.1mol/L磷酸钠溶液;称取0.03724gEDTA
    至pH值为8.0、浓度为0.1mol/L磷酸钠溶液中,混匀,得到pH值为8.0、
    浓度为0.1mol/L反应缓冲液;

    (7)DTNB溶液的制备:称取40mgDTNB,加步骤(6)制备的反应缓冲
    液溶解制成DTNB溶液备用;

    (8)标准曲线的制备:精密量取步骤(2)制备的PEG-dithiol对照品
    溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8ml、1.0ml置1.5ml离心管中,依次加入pH值
    为7.4磷酸盐缓冲液至1.0ml,混匀;分取上述溶液各0.5ml,加0.5ml步骤
    (4)制备的酶溶液,混匀,37℃放置约2.0h,再分别步骤(6)制备的反应
    缓冲液5.0ml,涡旋混匀,加入步骤(7)制备的DTNB溶液0.2ml,混匀,室
    温放置15分钟;以对照品溶液0ml经上述方法制备的溶液为空白,在412nm
    的波长处测定吸光度,以对照品溶液的浓度对相应的吸光度计算回归方程;

    (9)交联透明质酸钠凝胶PEG-dithiol残留的测定:取步骤(5)制备
    所得的样品溶液1.0ml,按步骤(8)加入步骤(6)制备的反应缓冲液和步骤
    (7)制备的DTNB溶液反应15分钟,在412nm的波长处测定吸光度,根据回
    归方程计算交联透明质酸钠凝胶中PEG-dithiol的残留。

    在本发明的一个优选实施例中,所述步骤(4)中制备的酶溶液为2400U/ml
    酶溶液。

    在本发明的一个优选实施例中,可测定的PEG-dithiol的分子量为
    3400Da。

    本发明的二巯基聚乙二醇的检测方法的检测原理根据二巯基聚乙二醇中
    含有的巯基与DTNB溶液发生反应,产生黄色化合物,此化合物在412nm处会
    产生最大吸收。

    利用本发明的方法检测测定交联透明质酸钠凝胶中二巯基聚乙二醇残
    留,弥补目前二巯基聚乙二醇作为交联剂无法监控其残留量的缺点,特别适
    合大分子交联凝胶残留的检测。

    具体实施方式

    通过下面给出的本发明的具体实施例可以进一步清楚地了解本发明,但
    它们不是对本发明的限定。

    实施例1

    (1)磷酸盐缓冲液的制备:取无水磷酸氢二钠912mg,一水合磷酸二氢
    钠300mg,加水使溶解成500ml,得到pH7.4的磷酸盐缓冲液。

    (2)PEG-dithiol对照品溶液的制备:精密称取二巯基聚乙二醇对照品
    40mg,置20ml量瓶中,加磷酸盐缓冲液(pH7.4)溶解并稀释至刻度,摇匀。
    精密量取5ml,置25ml量瓶中,加磷酸盐缓冲液(pH7.4)稀释至刻度,制成
    约0.4mg/ml的对照品溶液。

    (3)醋酸盐缓冲液的制备:取11.55ml冰醋酸,定容至1000ml,得到
    0.2mol/L醋酸;称取16.4g无水醋酸钠溶于1000ml水中,得到0.2mol/L醋
    酸钠;取148ml0.2mol/L醋酸溶液与352ml0.2mol/L醋酸钠溶液混匀,得
    到0.2mol/L醋酸盐缓冲液(pH5.0)。

    (4)酶溶液的制备:称取透明质酸酶(simga公司809U/mg)约30mg,
    加0.2mol/L醋酸盐缓冲液(pH5.0)溶解并使成10ml。

    (5)样品溶液制备:取交联透明质酸钠凝胶约1.0g,加1.0ml酶液,置
    37℃降解约2.0h,使凝胶降解成溶液备用。

    (6)反应缓冲液制备:称取35.814g十二水合磷酸氢二钠,加水溶解使
    成100ml,得到1mol/L磷酸氢二钠溶液;称取15.601g二水合磷酸二氢钠,
    加水溶解使成100ml,得到1mol/L的磷酸二氢钠溶液;吸取9.32ml的1mol/L
    磷酸氢二钠溶液及0.68ml的1mol/L的磷酸二氢钠溶液加水稀释至约90ml,
    混匀,用氢氧化钠试液调pH至8.0,加水定至100ml,得到0.1mol/L磷酸钠
    (pH8.0)溶液;称取0.03724gEDTA至0.1mol/L磷酸钠(pH8.0)溶液中,混匀,
    得到0.1mol/L磷酸钠(pH8.0)1mmol/LEDTA反应缓冲液。

    (7)DTNB【5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)】溶液的制备:称取40mg
    DTNB,加0.1mol/L磷酸钠(pH8.0)1mmol/LEDTA反应缓冲液溶解使成10ml,
    临用现配。

    (8)标准曲线的制备:精密量取对照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8ml、
    1.0ml置1.5ml离心管中,依次加入磷酸盐缓冲液(pH7.4)至1.0ml,混匀。
    分取上述溶液各0.5ml,加0.5ml酶液,混匀,37℃放置约2.0h,再分别加
    入0.1mol/L磷酸钠(pH8.0)1mmol/LEDTA反应缓冲液5.0ml,涡旋混匀,加
    入DTNB溶液0.2ml,混匀,室温放置15分钟。以对照品溶液0ml经上述方法
    制备的溶液为空白,在412nm的波长处测定吸光度,以对照品溶液的浓度对
    相应的吸光度计算回归方程。

    (9)交联透明质酸钠凝胶PEG-dithiol残留量的测定:取步骤(5)制
    备所得的样品溶液1.0ml,按步骤(8)加入反应缓冲液和DTNB溶液反应15
    分钟,在412nm的波长处测定吸光度,根据回归方程计算交联透明质酸钠凝
    胶中PEG-dithiol的残留量。

    通过检测得到的吸光度带入直线回归方程换算出浓度。

    方程为:y=0.00099x-0.00539

    其中x:PEG-dithiol的浓度(μg/ml)

    y:吸光度

    但是此方程因每次测试时重新测得,本实例给出的方程仅供参考
    试验结果:

    对三批交联透明质酸钠凝胶中二巯基聚乙二醇的残留进行检测结果见表
    1。

    表1


    从表1可知,本发明的方法对三批交联透明质酸钠凝胶中二巯基聚乙二
    醇的残留进行检测,弥补了目前没有该方法的空白,保证了药品的安全。

    关 键 词:
    一种 测定 交联 透明 质酸钠 凝胶 巯基 聚乙二醇 残留 方法
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