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    重庆时时彩万能2码: 一种魔芋基因组含量值的快速测定方法.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201510959683.8

    申请日:

    2015.12.21

    公开号:

    CN105606518A

    公开日:

    2016.05.25

    当前法律状态:

    撤回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的视为撤回 IPC(主分类):G01N 15/14申请公布日:20160525|||实质审查的生效IPC(主分类):G01N 15/14申请日:20151221|||公开
    IPC分类号: G01N15/14 主分类号: G01N15/14
    申请人: 武汉大学
    发明人: 盛佳婧; 刁英; 钟琳; 胡中立
    地址: 430072 湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学
    优先权:
    专利代理机构: 武汉科皓知识产权代理事务所(特殊普通合伙) 42222 代理人: 常海涛
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201510959683.8

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2019.01.25|||2016.06.22|||2016.05.25

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的视为撤回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种魔芋基因组含量值的快速测定方法。该方法包括如下步骤:取魔芋幼嫩叶片,玉米白化幼嫩叶片为内参;将魔芋、玉米的幼嫩叶片剪碎后加到细胞核提取液中,用刀片垂直切碎后用400目的尼龙网过滤除去悬浮物;过滤后的细胞悬液离心后弃上清液;沉淀用MgSO4缓冲液重悬;往细胞悬液中加入RNAse和PI染料混匀后避光染色;再于流式细胞仪上分析测定。本发明针对魔芋的多聚糖粘性在制样试剂中加入PVP,加入PVP后的细胞核提取液更易过滤,溶液褐化现象减轻,重悬效果更好,使得操作更简单,结果更为准确。本发明操作简便、易行,对于基因组含量值的测量准确可信,适用于多品种大数量的魔芋的基因组含量值测定。

    权利要求书

    1.一种魔芋细胞核提取液,其特征在于:每1.5mL魔芋细胞核提取液的配制如下:取5.55mgKCL,3.69mgMgSO4,1.8mgHepes,36.3μL10%TritonX-100,0.5gPVP,用蒸馏水溶解至1.5mL。2.权利要求1所述的魔芋细胞核提取液在魔芋基因组含量测定中的应用。3.一种魔芋基因组含量值的快速测定方法,其特征在于包括如下步骤:(1)取魔芋幼嫩叶片,玉米白化幼嫩叶片为内参;(2)将魔芋、玉米的幼嫩叶片混合剪碎后加到权利要求1所述的魔芋细胞核提取液中,用刀片垂直切碎后过滤除去悬浮物;(3)过滤后的细胞悬液离心后弃上清液;(4)离心后的沉淀用MgSO4缓冲液重悬;每445μLMgSO4缓冲液的配制为:取5.55mgKCL,3.69mgMgSO4,1.8mgHepes,用蒸馏水溶解至445μL;(5)往细胞重悬液中加入RNAse和PI染料,混匀后避光染色;(6)染色后的细胞悬液于流式细胞仪下测定。4.根据权利要求3所述的魔芋基因组含量值的快速测定方法,其特征在于包括如下步骤:(1)取魔芋幼嫩叶片0.5g,玉米白化幼嫩叶片0.2g作为内参;(2)将魔芋、玉米的幼嫩叶片混合剪碎后加到1.5mL细胞核提取液中,用刀片垂直切碎后再用400目的尼龙网过滤除去悬浮物;(3)过滤后的细胞悬液于3000rpm下离心1.5分钟,弃上清液;(4)离心后的沉淀于445μLMgSO4缓冲液重悬;(5)往细胞重悬液中加入50μL50μg/mL的RNAse和5μL50μg/mL的PI染料,混合均匀,避光下染色15分钟;(6)染色后的细胞悬液于流式细胞仪下测定;采用488nm的蓝光激发,收集通道的荧光,检测PI的发射荧光强度;每个待测样本至少收集1万个细胞,每个样本重复测定3次以上;魔芋基因组含量值由下列公式得出:魔芋基因组含量值=内参基因组含量值*魔芋流式荧光强度/内参流式荧光强度。

    说明书

    一种魔芋基因组含量值的快速测定方法

    技术领域

    本发明属于基因工程领域,具体涉及一种魔芋基因组含量值的快速测定方法。

    背景技术

    魔芋(Amorphophallus)属天南星科(Areaceae)魔芋属多年生草本植物,主要栽培种为花魔芋(Amorphophalluskonjac)、白魔芋(Amorphophallusalbus)、田阳魔芋(AmorphophalluscorrugatusN.E.Brown)、西盟魔芋(AmorphophalluskrauseiEngler)、攸乐魔芋(AmorphophallusyuloensisH.Li)和勐海魔芋(AmorphophalluskachinensisEngl.EtGenrm)六种,广泛分布于湖北、云南、四川等长江流域。魔芋的变态茎宿存于地下,通常呈球形、扁球形或柱状球形,营养十分丰富,含淀粉35%,蛋白质3%,以及多种维生素和钾、磷、硒等矿物质元素,还含有人类所需要的魔芋多糖,即葡萄甘露聚糖达45%以上,并具有低热量、低脂肪和高纤维素的特点。魔芋因其块茎内富含葡甘聚糖(Konjacglucomannan)、各种人体必需氨基酸和微量元素而广泛用于食品、医药、保健、农业、化工、纺织、石油钻探等领域,具有极大的商业价值、食品价值与药用价值。

    目前关于魔芋的细胞学研究主要集中在染色体计数及核型分析上,国内外报道魔芋的染色体数目为2n=24、26、28、32等,其中大部分为2n=26。近来韦松基和温标才报道了桂平魔芋(AmorphophalluscoaetaneusS.Y.LiuetS.J.Wei)染色体的数目及核型分析结果:染色体数目2n=26,核型公式为2n=2x=26=20m+6sm,属“2B”型,将其与魔芋属其他种类的核型比较,说明桂平魔芋为较原始的物种。目前对于魔芋染色体带型的研究仅限于利用Giemsa带型来探讨部分魔芋种的进化。而因魔芋种类较多,基因组较大,且细胞多含多聚糖而粘性过大导致其细胞学实验的难度性,对于魔芋的基因组含量值大小,一直鲜少有报道?;蜃楹恐底魑镏只∈?,其大量、快速、准确的确定有利于魔芋后续基因组学方向的研究。

    流式细胞术(FlowCytometry,FCM)是20世纪70年代发展起来的一种高精度检测技术,起初主要用于医学和动物学,包括细胞凋亡、肿瘤学、免疫学和血液学等的研究。20世纪80年代,Galbraith等首次将流式细胞术用于植物细胞周期检测和细胞核DNA含量测定,开辟了流式细胞术应用于植物研究的先河。由于该技术在植物研究中具有多功能、高精度、大通量等特点,目前已在多种植物体上得到实现。流式细胞术作为一种快速测定基因组含量值的方法具有高效、准确等优点。

    发明内容

    本发明的目的在于提供了一种魔芋基因组值的快速测定方法,该方法操作简便、易行,对于基因组含量值的测量准确可信,适用于多品种大数量的魔芋的基因组含量值测定、比较分析。

    为了实现上述的目的,本发明采用以下技术措施:

    一种魔芋细胞核提取液,每1.5mL的配制如下:取5.55mgKCL,3.69mgMgSO4,1.8mg4-羟乙基哌嗪乙磺酸(Hepes),36.3μL10%TritonX-100,0.5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP),用蒸馏水溶解至1.5mL。

    所述的魔芋细胞核提取液在基因组含量测定中的应用。

    一种魔芋基因组含量值的快速测定方法,包括如下步骤:

    (1)取魔芋幼嫩叶片,玉米白化幼嫩叶片为内参。

    (2)将魔芋、玉米的幼嫩叶片混合剪碎后加到上述魔芋细胞核提取液中,用刀片垂直切碎后过滤除去悬浮物。

    (3)过滤后的细胞悬液离心后弃上清液。

    (4)离心后的沉淀用MgSO4缓冲液重悬。每445μLMgSO4缓冲液的配制为:取5.55mgKCL,3.69mgMgSO4,1.8mgHepes,用蒸馏水溶解至445μL。

    (5)往细胞重悬液中加入核糖核酸酶(RNAse)和碘化丙啶(PI)染料,混匀后避光染色。

    (6)染色后的细胞悬液于流式细胞仪下测定。

    优选的,所述的魔芋基因组含量值的快速测定方法,包括如下步骤:

    (1)取魔芋幼嫩叶片约0.5g,玉米白化幼嫩叶片0.2g作为内参。

    (2)将魔芋、玉米的幼嫩叶片混合剪碎后加到1.5mL魔芋细胞核提取液中,用锋利的刀片垂直切碎后再用400目的尼龙网过滤除去悬浮物。

    (3)过滤后的细胞悬液于3000rpm下离心1.5分钟,弃上清液。

    (4)离心后的沉淀于445μLMgSO4缓冲液重悬,置于冰上备用。

    (5)往细胞重悬液中加入50μLRNAse(50μg/mL)和5μLPI染料(50μg/mL),混合均匀,避光下染色15分钟。

    (6)染色后的细胞悬液于流式细胞仪下测定。采用488nm的蓝光激发,收集通道的荧光,检测PI的发射荧光强度。每个待测样本至少收集1万个细胞。每个样本重复测定3次以上。测定所得的图像和数据由流式细胞仪自带软件进行处理分析。魔芋基因组含量值由下列公式得出:魔芋基因组含量值=内参基因组含量值*魔芋流式荧光强度/内参流式荧光强度。

    本发明与现有技术相比,具有以下优点和效果:

    (1)本发明与现有技术相比,效率更高,检测更为准确。

    (2)本发明针对魔芋的多聚糖粘性在制样试剂中加入PVP,加入PVP后的细胞核提取液更易过滤,溶液褐化现象减轻,重悬效果更好,使得操作更简单,结果更为准确。

    (3)本发明能够快速地测定魔芋基因组含量值,为后续的多样性、进化研究打下基础。

    具体实施方式

    以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均在常规生化试剂商店购买。

    实施例1

    (1)配制魔芋细胞核提取液:取5.55mgKCL,3.69mgMgSO4,1.8mgHepes,36.3μL10%TritonX-100,0.5gPVP,用蒸馏水溶解至1.5mL。

    配制MgSO4缓冲液:取5.55mgKCL,3.69mgMgSO4,1.8mgHepes,用蒸馏水溶解至445μL。

    (2)分别取花魔芋、红魔芋幼嫩叶片约0.5g,玉米白化幼嫩叶片约0.2g作为内参。

    (3)分别将花魔芋、红魔芋的幼嫩叶片与玉米的幼嫩叶片混合剪碎后加到1.5mL细胞核提取液中,用锋利的刀片垂直切碎后再用400目的尼龙网过滤除去悬浮物。

    (4)过滤后的细胞悬液于3000rpm下离心1.5分钟,弃离心上清液。

    (5)离心后的沉淀于445μLMgSO4缓冲液重悬,往置于冰上备用。

    (6)往细胞重悬液中加入50μLRNAse酶(50μg/mL)和,5μLPI染料(50μg/mL),避光下染色15分钟。

    (7)染色后的细胞悬液于流式细胞仪下测定。采用488nm的蓝光激发,收集通道的荧光,检测PI的发射荧光强度。每个待测样本至少收集1万个细胞。每个样本重复测定3次以上。测定所得的图像和数据由流式细胞仪自带软件进行处理分析。

    魔芋基因组值由下列公式得出:魔芋基因组值=内参基因组值(5.2pg)*魔芋流式荧光强度(花魔芋约26632,红魔芋约39018)/内参流式荧光强度(11949)。

    结果:所测花魔芋、红魔芋基因组含量基本集中在两个区域附近,分别为12pg左右和17pg左右,根据之前报道的染色体核型分析结果我们知道魔芋基本存在二倍体和三倍体两种核型,因此本发明可以判定花魔芋为二倍体,基因组含量约为11.59pg;红魔芋为三倍体,基因组含量约为16.98pg。

    上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的?;し段е?。

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    一种 魔芋 基因组 量值 快速 测定 方法
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