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    重庆时时彩最新技巧: 一种BRDT蛋白抑制剂在雄性抗生育中的应用.pdf

    关 键 词:
    一种 BRDT 蛋白 抑制剂 雄性 抗生 中的 应用
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    摘要
    申请专利号:

    CN201610009457.8

    申请日:

    2016.01.07

    公开号:

    CN105597100A

    公开日:

    2016.05.25

    当前法律状态:

    授权

    有效性:

    有权

    法律详情: 授权|||实质审查的生效IPC(主分类):A61K 45/00申请日:20160107|||公开
    IPC分类号: A61K45/00; A61K31/4184; A61P15/16; G06F19/00(2011.01)I; G01N33/68 主分类号: A61K45/00
    申请人: 国家卫生计生委科学技术研究所
    发明人: 王慧萍; 高娜娜
    地址: 100081 北京市海淀区大慧寺路12号
    优先权:
    专利代理机构: 北京中誉威圣知识产权代理有限公司 11279 代理人: 孟祥斌;朱萍
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201610009457.8

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2018.08.21|||2016.10.12|||2016.05.25

    法律状态类型:

    授权|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种BRDT蛋白抑制剂在雄性抗生育中的应用,具体地本发明公开了一种BRDT蛋白小分子抑制剂在雄性抗生育中的应用,同时本发明还公开了一种以BRDT为靶标,利用计算机辅助虚拟筛选的理性化筛选抗生育药物的方法。

    权利要求书

    1.一种BRDT蛋白抑制剂在制备雄性抗生育药物组合物中的用途。
    2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于,所述蛋白抑制剂与BRDT的溴结
    构域相结合。
    3.根据权利要求1或2所述的用途,其特征在于所述BRDT蛋白抑制剂为BRDT
    蛋白的小分子抑制剂。
    4.根据权利要求3所述的用途,其特征在于,所述小分子抑制剂为T225。
    5.一种抗生育药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包括T225或其药学上
    可接受的盐或其异构体或其水合物或溶剂化物。
    6.根据权利要求5所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物还包括药
    学上可接受的稀释剂、赋形剂、粘合剂、润滑剂、矫味剂、表面活性剂、包衣材
    料等中的一种或几种。
    7.根据权利5或6所述的药物组合物,其特征在于,所述药物组合物的受体为
    人。
    8.一种筛选权利要求1-4任一项所述BDRT蛋白抑制剂的方法,其特征在于,
    筛选步骤如下:
    (1)构建人BRDT小分子抑制剂药效团模型
    从PDB数据库下载人BRDT与JQ1共结晶活性构象的三维立体结构文件,
    输入到DiscoveryStudio3.0的药效团构建???,利用DiscoveryStudio3.0对
    BRDT活性构象立体结构进行加氢和除水的处理,设置各参数,根据乙酰-赖氨
    酸结合口袋JQ1和BRDT的相互作用方式识别活性位点,然后依据和受体的相
    互作用模式对所有的作用位点进行聚类,得到可用于虚拟筛选的药效团模型;
    (2)使用利平斯基五规则和ADMET预测对化合物库进行类药性预测;
    (3)基于药效团模型对化合物库进行虚拟筛选
    将构建好的药效团模型作为3D提问结构输入对大型化合物数据库进行高通
    量虚拟筛选,保留匹配一半以上药效特征元素的化合物,然后再次通过利平斯基
    五规则进行过滤;
    (4)基于分子对接对化合物库进行虚拟筛选
    利用Libdock进行对接研究,采用相同的BRDT的活性构象的三维结构和
    Charmm力场,定义对接位点,将JQ1对接到BRDT活性位点,以对接构象是否
    满足催化机制为依据进行打分函数的选择和参数优化;
    (5)体外蛋白水平的筛选
    使用BRDTBromodomainTR-FRETAssay试剂盒进行化合物的体外检测;
    (6)对阳性化合物与BRDT蛋白进行量效关系检测;
    (7)对阳性化合物进行分子对接检测;
    (8)对阳性化合物进行ADMET预测。
    9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,步骤(1)中的参数设置为:亲脂
    性位点密度参数为15,极性位点参数为20;最小结构特征的参数为4,最大参
    数特征的参数为6。
    10.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,步骤(4)中的对接位点定义为
    一个以活性位点为中心的直径的球形,这个球形足以覆盖BRDT与JQ1结合
    位点的关键氨基酸残基。

    说明书

    一种BRDT蛋白抑制剂在雄性抗生育中的应用

    技术领域

    本发明涉及生物医学领域,更具体地,本发明涉及一种BRDT蛋白抑制剂
    在雄性抗生育中的应用。

    背景技术

    在避孕节育技术发展如此成熟的今天,抗男性生育的避孕方式一直是生殖领
    域的薄弱环节。目前研发的男性节育药包括激素类和非激素类,激素类男性节育
    药以下丘脑-垂体-睾丸轴的负反馈调节为基础,主要机制为:外源性睾酮反馈性
    抑制黄体生成激素和卵泡刺激素分泌;降低睾丸内睾酮的分泌水平,抑制精子发
    生。非激素类男性节育候选物较多,作用机制包括干扰支持细胞功能;抑制顶体
    酶、阻滞离子通道及影响精子活力表达等。但是迄今为止尚无成熟产品问世,有
    效节育方法仅有体外排精、避孕套和输精管绝育术。

    睾丸特异性含溴结构域蛋白(BRDT)是一种组织特异性的与染色质相关联
    的蛋白质,它参与了睾丸中精子生成的染色质重组过程,在粗线期精母细胞、双
    线期精母细胞和精子细胞中表达,在减数分裂之后,BRDT通过成对的乙?;?
    赖氨酸识别??榛蜾褰峁褂蚴垢叨纫阴;淖榈鞍字刈?。它能够调节精母细胞中
    的基因表达,并能促进减数分裂之后圆形精子细胞染色质核仁的形成和维持核仁
    的结构状态。此外,BRDT在精子细胞伸长过程中其重要作用,BRDT的BD1
    是精子细胞完成减数分裂所必需的因子。BRDT作为一种组织特异性蛋白,作为
    抗生育药物的作用靶点具有潜在的应用价值。

    JQ1是于2012年美国贝勒医学院的研究者发现的一种小分子化合物,可以
    与人BRDT结合并以时间和剂量依赖性干扰精子的生成,它作用于减数分裂期
    及减数分裂后期的精子细胞,导致精子生成和运动能力受阻。尽管JQ1的抗生育
    作用具有良好的可逆性,但是它可能出现生物利用度低的缺点,因此仍需要开发
    以BRDT为靶标的新的化合物,但是我国目前尚无关于BRDT抑制剂的研究,
    积极开发BRDT抑制剂具有重要的意义。

    发明内容

    本发明的目的在于提供一种BRDT蛋白抑制剂在男性抗生育中的应用,为
    了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:

    本发明提供了一种BRDT蛋白抑制剂在制备雄性抗生育药物组合物中的用
    途。

    进一步,所述蛋白抑制剂与BRDT的溴结构域相结合。

    进一步,所述蛋白抑制剂为BRDT蛋白的小分子抑制剂。

    进一步,所述小分子抑制剂为T225。

    本发明提供了一种抗生育药物组合物,所述药物组合物包括T225或其药学
    上可接受的盐或其异构体或其水合物或溶剂化物,只要具有T225的活性即可。
    所述药学上可接受的盐包括但不限于碱金属盐或碱土金属盐如钠盐、钾盐、钙盐、
    镁盐、钙盐;氢卤酸盐如氢氟酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐和氢碘酸盐;无机酸盐
    如硝酸盐、高氯酸盐、硫酸盐和磷酸盐;有机酸盐如甲酸盐、醋酸盐、丙酸盐、
    草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、柠檬
    酸盐、酒石酸盐、碳酸盐、苦味酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐;有机碱盐如甲胺盐、
    乙胺盐、单乙醇铵盐、二乙醇铵盐、三乙醇铵盐、环己基胺盐;氨基酸盐如谷氨
    酸盐、天冬氨酸盐、赖氨酸盐。

    进一步,所述抗生育药物组合物还包括药学上可接受的稀释剂、赋形剂、粘
    合剂、润滑剂、矫味剂、表面活性剂、包衣材料等中的一种或几种。这类试剂包
    括(但并不限于):稀释剂如乳糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、水等;粘合
    剂如单糖浆、淀粉、预胶化淀粉、糊精、麦芽糖糊精、蔗糖、阿拉伯胶、明胶、
    甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、聚乙烯醇、聚乙二醇、聚乙烯比咯烷
    酮、海藻酸及海藻酸盐、黄原胶、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素;润滑剂如
    硬脂酸锌、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇、硼
    酸粉末、氢化植物油、硬脂富马酸钠、月桂醇硫酸钠、聚氧乙烯单硬脂酸酯、十
    二烷基硫酸镁、单月桂蔗糖酸酯、月桂醇硫酸镁;矫味剂如甘露醇、木糖醇、甜
    菊甙、乳糖、果糖、蔗糖、蛋白糖、麦芽糖醇、甘草甜素、环己氨基磺酸钠、明
    胶、阿斯巴甜、香蕉香精、菠萝香精、香兰素、香橙香精、桔子香精、薄荷香精、
    人参香精、草莓香精、枸橼酸、柠檬酸;表面活性剂如聚氧化乙烯山梨聚糖脂肪
    酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘油酯、十六烷醇;包衣材料如明胶、阿拉伯
    胶、海藻酸盐、壳聚糖、羧甲基纤维素盐、醋酸纤维素酞酸酯、乙基纤维素、甲
    基纤维素、羟丙甲基纤维素、丙烯酸树脂类、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙
    二醇。

    所述药物组合物还可包括填充剂如淀粉、蔗糖、甘露醇(粒状或粉状)、木
    糖醇、山梨醇、麦芽糖、赤藓糖、微晶纤维素、聚合糖、偶合糖、葡萄糖、乳糖、
    糊精;崩解剂如交联乙烯吡咯烷酮、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基甲基、交联羧
    甲基纤维素钠、大豆多糖、干淀粉、海藻酸钠、海带多糖粉末、琼脂粉末、碳酸
    钙和碳酸氢钠等;湿润剂如甘油;吸收促进剂季铵化合物、十二烷基硫酸钠等;
    吸附载体如淀粉、乳糖、斑脱土、硅胶、高岭土和皂粘土;泡腾剂如苹果酸、柠
    檬酸或枸橼酸与碳酸氢钠或碳酸钠等;稳定剂如人类血清蛋白、L-氨基酸、糖及
    纤维素衍生物;糖类如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖等单糖,甘露醇、纤维醇、
    木糖醇等糖醇,蔗糖、麦芽糖、乳糖等二糖;葡聚糖、羟丙基淀粉、硫化软骨素、
    透明质酸等多聚糖。纤维素衍生物如甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、
    羟丙基纤维素、羟丙甲基纤维素及羟甲基纤维素钠。

    所述抗生育药物组合物的接受体为雄性哺乳动物,如人、猴、鼠、兔等。优
    选的,所述哺乳动物为人。

    所述抗生育药物组合物可以通过任何途径给予受体,所述途径包括(但不限
    于)腹腔内给药、静脉内给药、肌内给药、皮下给药、皮内给药、口服给药、鼻
    内给药、肺内给药、直肠内给药。

    优选的,所述抗生育药物组合物的给药方式为口服。

    本发明所述的药物组合物的核心可以制备成以下形式:粗颗粒、细颗粒、珠
    子、球体珠、圆粒、涂覆珠、涂覆圆粒、涂覆颗粒,以及药学上可接受的形状和
    尺寸。这些可以多种造粒方法与其他方法来制作,诸如湿式与干式造粒法。所述
    抗生育药物组合物的单位剂型可以使用多种形式,代表性的剂型包括固体剂型如
    片剂、丸剂、粉剂、干粉剂、颗粒、胶囊等;液态剂型如溶液、悬浮液、乳状液、
    糖浆、酏剂等。

    本发明提供了一种筛选上述BDRT蛋白抑制剂的方法,其特征在于,筛选步
    骤如下:

    (1)构建人BRDT小分子抑制剂药效团模型

    从PDB数据库下载人BRDT与JQ1共结晶活性构象的三维立体结构文件,
    输入到DiscoveryStudio3.0的药效团构建???,利用DiscoveryStudio3.0对
    BRDT活性构象立体结构进行加氢和除水的处理,设置各参数,根据乙酰-赖氨
    酸结合口袋JQ1和BRDT的相互作用方式识别活性位点,然后依据和受体的相
    互作用模式对所有的作用位点进行聚类,得到可用于虚拟筛选的药效团模型;

    (2)使用利平斯基五规则和ADMET预测对化合物库进行类药性预测;

    (3)基于药效团模型对化合物库进行虚拟筛选

    将构建好的药效团模型作为3D提问结构输入对大型化合物数据库进行高通
    量虚拟筛选,保留匹配一半以上药效特征元素的化合物,然后再次通过利平斯基
    五规则进行过滤;

    (4)基于分子对接对化合物库进行虚拟筛选

    利用Libdock进行对接研究,采用相同的BRDT的活性构象的三维结构和
    Charmm力场,定义对接位点,将JQ1对接到BRDT活性位点,以对接构象是否
    满足催化机制为依据进行打分函数的选择和参数优化;

    (5)体外蛋白水平的筛选

    使用BRDTBromodomainTR-FRETAssay试剂盒进行化合物的体外检测;

    (6)对阳性化合物与BRDT蛋白进行量效关系检测;

    (7)对阳性化合物进行分子对接检测;

    (8)对阳性化合物进行ADMET预测。

    进一步,步骤(1)中的参数设置为:亲脂性位点密度参数为15,极性位点
    参数为20;最小结构特征的参数为4,最大参数特征的参数为6。

    进一步,步骤(4)中的对接位点定义为一个以活性位点为中心的直径
    的球形,这个球形足以覆盖BRDT与JQ1结合位点的关键氨基酸残基。

    本发明的优点和有益效果:

    本发明首次建立了一种理性化筛选男性抗生育药物的方法,以人BRDT为
    靶点,利用计算机辅助虚拟筛选,减少了人力、物力,缩短了实验周期,大大降
    低了药物研究成本。

    本发明首次发现了针对BRDT的一种小分子抑制剂T225,所述小分子抑制
    剂能与BRDT的溴结构域特异性结合,安全、有效、可逆的实现男性抗生育的
    目的。

    附图说明

    图1显示了BRDT抑制剂的最终药效团模型,其中,图A显示了实验计算得到的最
    佳药效团模型;图B显示了药效团模型的3D空间关系和几何参数。

    图2显示了药效团模型的结构特征,其中,图A显示了药效团模型和起作用的氨
    基酸残基,图B显示了药效团模型与JQ1的匹配结果;图C显示了药效团模型同
    BRDT-JQ1晶体复合物的匹配结果。

    图3显示了BRDT的活性位点,其中条带代表BRDT蛋白链。

    图4显示了JQ1和BRDT的对接图,其中条带代表BRDT蛋白链,棒状结构代表JQ1。

    图5显示了JQ1与BRDT蛋白的量效关系。

    图6显示了化合物T225的结构式。

    图7显示了化合物T225与BRDT蛋白的量效关系。

    图8显示了化合物T225的ADMET性质预测。

    具体的实施方式

    下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。本发明的实施例仅用
    于解释本发明而不用于限制本发明的范围。

    下述实施例中所使用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。

    实施例1药效团模型的构建

    1、方法

    从PDB数据库下载人BRDT与JQ1共结晶活性构象的三维立体结构文件输
    入到DiscoveryStudio3.0软件;利用DiscoveryStudio3.0的药效团构建??楣菇?br />基于BRDT与JQ1复合物相互作用方式的药效团模型,移除水分子、添加氢键
    形成受体结构;设定各参数条件,将最小结构特征和最大结构特征的参数分别设
    置为4和6,亲脂性位点密度参数设为15,极性位点参数设为20;根据乙酰-赖
    氨酸结合口袋JQ1和BRDT的相互作用方式识别活性位点,对所有的作用位点
    进行聚类,得到用于虚拟筛选的药效团模型;分析最终的药效团模型的作用残基
    及结构特征;

    2、结果

    BRDT抑制剂的最终药效团模型如图1所示,该药效团模型包含5个特征元
    素、一个氢键供体特征(HBD)、4个疏水作用结构特征和14个排除体积特征。
    药效团模型的结构特征如图2所示,在该药效团模型中起作用的氨基酸残基有保
    守氨基酸残基ASN109、ILE115、LEU61、PHE52、MET118、ASP114,JQ1与
    该药效团特征能够很好的匹配,JQ1的三唑环与BRDT活性中心的保守氨基酸残
    基Asn109之间形成的氢键,四个疏水结构特征H1、H2、H3和H4分别与JQ1
    的甲基、噻吩环、苯环和叔丁基相匹配。这些疏水结构特征对应于BRDT活性
    位点的疏水区域,该疏水区域主要由氨基酸残基Trp50、Pro51、Phe52、Leu61、
    Leu63、Leu115和Met118组成。

    实施例2类药性预测

    1、材料

    中国医学科学院医药生物技术研究所国家新药(微生物)筛选实验室的化合
    物数据库和自主研发的微生物天然产物数据库MNPD。

    2、方法

    使用利平斯基五规则对来自化合物库的80000个化合物进行筛选,筛除有毒
    性基团和活性基团的化合物;对经过利平斯基五规则筛选的化合物进行水溶性、
    人类小肠吸收性、血耐屏障透过性、细胞色素P4502D6抑制性、肝脏毒性、血
    浆蛋白结合率的性质预测,选择相对分子质量在500以下、计算脂水分配系数
    CLgP小于5、氢键给体不超过5个、氢键受体不超过10个的化合物,使得所筛
    选出的化合物拥有良好吸收性可溶性、非肝脏毒性、不同级别血脑屏障透过性和
    血浆蛋白结合性。

    3、结果

    利用利平斯基五规则筛选出78300个化合物,对化合物性质进行ADMET预
    测,进一步筛选出76984个化合物进行后续的研究。

    实施例3基于药效团模型的虚拟筛选

    将构建好的药效团模型作为3D提问结构输入经利平斯基五规则过滤和
    ADMET预测的化合物数据库(76984)进行高通量虚拟筛??;保留匹配一半以
    上药效特征元素的化合物;最终筛选出270个符合条件的化合物。

    实施例4基于分子对接的虚拟筛选

    1、受体的准备

    (1)清理修复蛋白

    在FilesExplorer中打开人BRDT的PDB文件4FLP;

    在“ProtocolsExplorer”中打开“GeneralPurpose”,双击“PrepareProtein”;
    打开“InputProtein”,选中4FLP蛋白质分子,将BuildLoops,Protonate都选
    为True;

    点击运行按钮开始配体优化,一个新的运行档将在工作浏览器中出现;

    结果分析:输出档中包括:均方差文件4FLP_RMSD.log;
    力场文件4FLP_charmm.log;预测的pK值文件4FLP.pK;处理好的蛋白质结构
    文件4FLP_prep.dsv;滴定曲线数据文件4FLP.csv;输入档中包括:需要优化的
    蛋白质文件4FLP.dsv;执行的命令文件Protocol.pr_xml。

    (2)定义受体分子

    在系统视图中,打开档4FLP_prep.dsv;

    展开<Cell>,点击选择4FLP_prep;

    在工具浏览器中从下拉列表中选择并打Receptor-LigandInteractions工具面
    板;

    在DefineandEditBindingSite工具面板下的Define工具组中点“Define
    SelectedMoleculeasReceptor”将前面选择的蛋白分子4FLP定义为受体分子。

    (3)定义活性位点

    因4FLP是BRDT与小分子化合物JQ1共结晶的三维晶体结构,从图中将小
    分子配体JQ1删去,BRDT的活性位点就暴露出来,选择活性区域的球直径为
    命名为4FLP_res1。

    2、配体准备

    (1)导入化合物数据库的结构文件secA270在流程浏览器中,打开General
    Purpose,双击PrepareLigands;

    (2)在打开的PrepareLigands方法中修改参数,在“InputLigands”中输入
    secA270,其他参数采用默认值;

    (3)点击运行按钮开始配体优化;

    (4)在输出档中的配体档secA270是选定的参数应用于配体后的结果;

    (5)在输入档中的secA270是需要优化的配体;Protocol.pr_xml是执行的指
    令。

    3、分子对接

    (1)在DS窗口中打开蛋白和配体文件

    在DS文件浏览器中,打开文件4FLP_prot.dsv;

    在DS档浏览器中找到优化后的配体数据文件secA270.sd,将其拖拽到受
    体蛋白所在的三维窗口。

    (2)对受体及配体分子赋力场参数

    从工具浏览器的下拉列表中选择“Receptor-LigandInteractions”;

    打开“Receptor-LigandInteractions”工具栏;

    在SimulateStructures|Forcefield工具栏中从下拉列表中选择;CHARmM点
    击ApplyForcefield,给受体及小分子配体赋力??;

    配体赋好力场后工具浏览器的力场状态显示为:4FLP_prottypedwith
    CHARMm;

    打开刚性对接流程,在参数浏览器中点击InputTypedProteinMolecule参
    数,然后从下拉菜单中选择4FLP_prot:1err_prot;

    点击InputLigands从下拉菜单中选择secA270:All;

    点击InputSiteSphere参数格,从下拉菜单中选择对接区域的坐标;

    点击SelectedResidues参数格,从下拉菜单中选择“4FLP_res1”,这一操
    作将选择活性部位的一组氨基酸残基,这些氨基酸残基已经预先被选上且定义为
    4FLP_res1组;

    展开GenerateProteinConformations参数组,点击MaximumNumber参数,
    输入数值2;

    展开GenerateLigandConformations参数组,点击ConformationMethod参
    数,从下拉菜单中选择fast方法;

    展开Docking参数,点击参数MaxHitstoSave设置最多保存结果为3。

    (3)在流程工具栏,点击运行按钮,等待对接完成。

    4、分子对接结果浏览

    在工作浏览器中,双击刚完成的任务;

    在视图窗口中打开Report.htm文件,在Html窗口中的输出文件(Output
    Files)部分,点击ViewResults连结,打开对接结果;

    点击卷标启动结果窗口按“CTRL+1”隐藏流程浏览器和作业浏览器,按
    CTRL+H打开系统视图;

    在系统视图中,勾选SBD_Receptor,蛋白所有氨基酸残基都显示出来;

    点击浏览表格浏览器中上下键浏览对接的配体构象,随着鼠标点击表格浏览
    器中的不同配体对接姿态,视图窗口中的配体对接姿态会随之更新;

    在工具浏览器中从下拉列表中选择Receptor-LigandInteractions;

    在VisualizeReceptor-ligandInteractions工具面板下点击Receptorligand
    HydrogenBonds;

    在视图窗口中,受体原子与配体对接状态间的氢键通过绿线显示出来;

    在表格浏览器中,继续点击剩下的配体对接姿态,这样对接姿态将被添加到
    系统视图中并逐一在图形视图中显示出来;

    4FLP_res1参数识别出的氨基酸残基侧链构象将随着配体姿态的变化而变
    化。

    5、分析配体对接结果

    在窗口中打开4FLP配体的晶体构象,按CTRL+1使DiscoveryStudio浏览
    器恢复通常状态。在档浏览器中找到A链的Site1,右键点击,选择OpenWith
    |3DWindow,4FLP配体的晶体构象将在一个新的三维窗口中打开。

    在DS三维窗口中打开所有对接产生的对接构象,在档浏览器中,打开对
    接作业输出文件夹。将晶体构象定义为结构比较的参考构象,在系统视图中,点
    击第一个配体构象(4FLP配体)选择它,这个构象即对应晶体构象。从菜单中
    选择Structure|RMSD|SetReference,将4FLP晶体构象设置为RMSD计算的
    参考构象。

    在菜单中选择Structure|RMSD|HeavyAtoms,逐个排查和计算对接产生的
    姿态与晶体姿态的差异。

    6、结果

    BRDT蛋白的活性位点如图3所示,JQ1与BRDT的活性口袋按照libdock
    ??榻卸越尤缤?所示,得分值为118.924,以此分值作为确定阳性化合物的
    标准。将初筛得到的270个化合物与BRDT的活性口袋按照libdock对接方式进
    行虚拟对接,筛选出打分值高于阳性对照的化合物为125个。

    实施例5JQ1与BRDT的量效关系

    1、方法

    将JQ1化合物进行3倍梯度稀释;将5μl样品与10μlBRDT溴结构域铕螯
    合物混合,室温下孵育15min进行预平衡;加入5μl的BRDT溴结构域配体/APC
    受体混合物引发反应;将板子用铝箔密封在室温孵育1h,检测620nm和670nm
    发射光的数值。

    2、结果

    实验结果如图5所示,随着JQ1浓度的增大,JQ1对人BRDT蛋白结合的
    抑制作用增加,其IC50为133nM。

    实施例6化合物蛋白水平筛选

    1、待测样品预处理

    (1)取5mg纯品化合物溶到500μlDMSO中;

    (2)筛选的化合物样品用1×TR-FRETAssayBuffer稀释10倍。

    (3)阳性化合物JQ1用1×TR-FRETAssayBuffer溶解至四倍的终浓度
    10μM。

    2、化合物的检测

    (1)将5μl样品与10μlBRDT溴结构域铕螯合物混合,室温下孵育15min
    进行预平衡;

    (2)加入5μl的BRDT溴结构域配体/APC受体混合物引发反应,反应体系
    如下面表1所示;

    表1筛选模型检测体系


    (3)将板子用铝箔密封在室温孵育1h,检测620nm和670nm发射光的数
    值。

    3、数据分析

    以TR-FRET比值(670nm发射光/620nm发射光)计算样品与BRDT蛋白的
    亲和力,TR-FRET比值越低,样品与BRDT蛋白的亲和力越强。

    4、结果

    定义化合物浓度为100μM时抑制率大于30%的化合物为阳性化合物,经过
    筛选,得到一抑制率为44.39%的化合物T225,结构式如图6所示。

    实施例7T225与BRDT蛋白的量效关系

    1、方法

    将T225化合物进行2倍倍比的稀释;将5μl样品与10μlBRDT溴结构域铕
    螯合物混合,室温下孵育15min进行预平衡;加入5μl的BRDT溴结构域配体/APC
    受体混合物引发反应;将板子用铝箔密封在室温孵育1h,检测620nm和670nm
    发射光的数值。

    2、结果

    实验结果如图7所示,随着T225浓度的增大,T225对人BRDT蛋白结合
    的抑制作用增加,其IC50为32.12±0.63μM。

    实施例8T225与BRDT活性位点的分子对接

    按照实施例4所述的方法,进行T225与BRDT蛋白活性位点的分子对接;
    结果T225与BRDT蛋白活性位点的虚拟对接分数为119.362。

    实施例9T225的ADMET性质预测

    1、导入T225化合物文件

    在文件菜单中新建BRDT_inhibitors.sd文件,使用DS3.0的“构建与编辑”
    ??楣够?个已知结构的BRDT抑制剂,构画完成后显示在BRDT_inhibitors
    MoleculeWindow中。

    2、选择计算性质,运行计算流程

    在protocols浏览器中,打开ADMET文件夹,双击ADMETDescriptors,
    打开参数浏览器。在“InputLigands”右边的栅格中,选择“BRDT_inhibitors”,
    选择T225化合物。在“ADMETDescriptors”右边栅格中勾选所有性质,此操作
    将计算T225化合物的所有ADMET性质。

    3、运行预测

    点击Protocolstoolbar中的运行按钮开始预测,等待运行完成后,双击任务
    浏览器中刚完成的作业,打开Report.htm,点击该档中Output部分的ViewResults
    连结,打开计算的结果。

    4、分析预测结果

    结果档中包含了预测的6种ADMET性质(25℃下水溶解度、血脑屏障通透
    性、细胞色素P4502D6抑制性、肝毒性、人类肠道吸收性和血浆蛋白结合率)
    的数值和该数值所对应的级别。

    5、结果

    实验结果如图8所示,纵坐标从0到3依次代表很好、适中、差和极差,从
    图中可以看出化合物T225的血脑屏障通透性(BBB)相对较差,人类肠道吸收
    性(HIA)较好,在25℃水溶解度(SOL)较差,无细胞色素P4502D6抑制性。

    上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对
    于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明
    进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的?;し段?。

    关于本文
    本文标题:一种BRDT蛋白抑制剂在雄性抗生育中的应用.pdf
    链接地址://www.4mum.com.cn/p-5886150.html
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