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    重庆时时彩卡奖卡多久: 减弱BACE1和PS1相互作用的物质在制备治疗阿尔茨海默症的组合物中的用途.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201410673701.1

    申请日:

    2014.11.21

    公开号:

    CN105596349A

    公开日:

    2016.05.25

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):A61K 31/56申请日:20141121|||公开
    IPC分类号: A61K31/56; A61P25/28; A61K49/00; G01N33/68 主分类号: A61K31/56
    申请人: 中国科学院上海生命科学研究院
    发明人: 裴钢; 赵简; 崔进; 王海波; 王欣; 谢欣
    地址: 200031 上海市徐汇区岳阳路319号
    优先权:
    专利代理机构: 上海专利商标事务所有限公司 31100 代理人: 陈静
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201410673701.1

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2016.06.22|||2016.05.25

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及减弱BACE1和PS1相互作用的物质在制备治疗阿尔茨海默症的组合物中的用途。首次揭示减弱BACE1和PS1间相互作用的物质是一类对BACE1和γ-分泌酶的活性没有影响但能特异性抑制Aβ产生的新型分泌酶调节剂,可作为抗阿尔茨海默症类药物。

    权利要求书

    1.减弱β位淀粉样前体蛋白裂解酶1和早老蛋白1之间相互作用的物质在
    制备下调Aβ的组合物中的用途;较佳地,所述的Aβ包括:总Aβ,Aβ42,Aβ40
    和/或Aβ38。
    2.减弱β位淀粉样前体蛋白裂解酶1和早老蛋白1之间相互作用的物质在
    制备治疗阿尔茨海默症的组合物中的用途。
    3.如权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述的减弱β位淀粉样前
    体蛋白裂解酶1和早老蛋白1之间相互作用的物质包括:3α-木通萜酸。
    4.如权利要求1或2所述的用途,其特征在于,所述的减弱β位淀粉样前
    体蛋白裂解酶1和早老蛋白1之间相互作用的物质是对β位淀粉样前体蛋白裂
    解酶1和γ-分泌酶的活性无影响的物质。
    在另一优选例中,所述的减弱β位淀粉样前体蛋白裂解酶1和早老蛋白1
    之间相互作用的物质不包括对β位淀粉样前体蛋白裂解酶1和γ-分泌酶的活性
    产生影响的物质。
    5.一种用于治疗阿尔茨海默症或用于下调Aβ的药物组合物,其特征在于,
    所述的组合物包括:减弱β位淀粉样前体蛋白裂解酶1和早老蛋白1之间相互
    作用的物质和药学上可接受的载体。
    在另一优选例中,所述的减弱β位淀粉样前体蛋白裂解酶1和早老蛋白1
    之间相互作用的物质在药物组合物中的含量是有效量的。
    6.如权利要求5所述的药物组合物,其特征在于,所述的减弱β位淀粉样
    前体蛋白裂解酶1和早老蛋白1之间相互作用的物质包括:3α-木通萜酸;较佳
    地,所述的减弱β位淀粉样前体蛋白裂解酶1和早老蛋白1之间相互作用的物
    质是对β位淀粉样前体蛋白裂解酶1和γ-分泌酶的活性无影响的物质。
    7.一种用于治疗阿尔茨海默症或用于下调Aβ的药盒,其特征在于,所述
    的药盒中包括:容器,以及装于该容器中的权利要求5或6所述的药物组合物。
    8.一种筛选治疗阿尔茨海默症的潜在物质或下调Aβ的潜在物质的方法,
    其特征在于,所述方法包括:
    (1)将候选物质与β位淀粉样前体蛋白裂解酶1与早老蛋白1相互作用的体
    系接触;
    (2)检测候选物质对β位淀粉样前体蛋白裂解酶1与早老蛋白1相互作用的
    影响;
    若所述候选物质可抑制β位淀粉样前体蛋白裂解酶1与早老蛋白1相互作
    用,则表明该候选物质是治疗阿尔茨海默症的潜在物质或下调Aβ的潜在物质。
    9.如权利要求8所述的方法,其特征在于,在测试组中,将候选物质加
    入到β位淀粉样前体蛋白裂解酶1与早老蛋白1相互作用的体系中;和/或
    步骤(2)包括:检测测试组的体系中β位淀粉样前体蛋白裂解酶1与早老蛋
    白1相互作用情况,并与对照组比较,其中所述的对照组是不添加所述候选物
    质的β位淀粉样前体蛋白裂解酶1与早老蛋白1相互作用的体系;
    如果测试组中β位淀粉样前体蛋白裂解酶1与早老蛋白1的相互作用在统
    计学上弱于对照组,就表明该候选物质是治疗阿尔茨海默症的潜在物质或下调
    Aβ的潜在物质。
    10.如权利要求8或9所述的方法,其特征在于,所述的体系选自:细胞
    体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

    说明书

    减弱BACE1和PS1相互作用的物质在制备治疗阿尔茨海默症的组合物中的用途

    技术领域

    本发明涉及生物医学领域,更具体地,本发明涉及减弱BACE1和PS1相互
    作用的物质在制备治疗阿尔茨海默症的组合物中的用途。

    背景技术

    阿尔茨海默症(Alzheimer’sDisease,AD)是一种中枢神经系统退行性疾病,
    是造成老年痴呆的最主要病因之一?;颊吡俅脖硐治现δ苷习?、记忆力衰退、
    人格异常等。AD的主要病理学特征为病人大脑内形成的致密淀粉样蛋白斑块
    (Senileplaques)和神经纤维丝缠结(NeurofibrillaryTangles,NFTs)。在AD病例中,
    家族遗传性病例约占5%,对这类例的研究显示,APP、PSEN1和PSEN2基因上
    的突变与AD发病直接相关,其他绝大部分散发病例的致病机理尚不清楚。对于
    阿尔茨海默症发病原因最重要的假说是β-淀粉样蛋白假说,该假说认为淀粉样蛋
    白斑块的主要成分Aβ在AD的疾病发生过程中起根本性作用。在复杂的遗传因素
    和环境因素长期作用下,神经细胞异常地大量产生Aβ,积累形成Aβ寡聚体和淀
    粉样蛋白斑块。Aβ通过一系列级联反应(包括自由基反应、线粒体氧化损伤和异常
    的炎症反应等),直接或间接地作用于神经元和胶质细胞,导致突触功能异常和神
    经元损伤,同时引起小胶质细胞和星型胶质细胞激活,加速神经纤维丝缠结的形
    成。此外,Aβ寡聚体与突触功能异常的关系尤其密切,可以抑制突触的长时程增
    强,从而损伤突触的可塑性及记忆的形成。而对于Aβ的异?;?,除了由分泌酶
    剪切活性的异常调节所导致,还极有可能是因神经系统不能对产生的Aβ进行有效
    清除。

    Aβ是I型跨膜蛋白APP经过β-分泌酶和γ-分泌酶顺序剪切后的产物。淀粉
    样蛋白前体蛋白APP在细胞内有两种代谢途径:1)α-分泌酶在Aβ序列内剪切
    APP,生成sAPPα和C83,C83被γ-分泌酶继续剪切后产生长度较短的肽段P3片
    段。2)APP经BACE1剪切生成的C99肽段继续被γ-分泌酶剪切产生有35至43
    个氨基酸残基的淀粉样蛋白肽段,其中具有40个氨基酸残基的Aβ40占肽段组成
    的绝大部分,而能够引起致密淀粉样斑块的聚集的Aβ42则只占10%。β-分泌酶是
    一种I型天冬氨酸蛋白酶,在大脑神经元中有丰富的表达,亚细胞定位富集于具
    有较低pH的内体、高尔基体小泡等酸性亚细胞结构。γ-分泌酶是由Presenilin,
    Nicastrin,APH1(AnteriorPharynxDefective1)和Pen-2(PresenilinEnhancer-2)四
    种跨膜蛋白组装形成的蛋白复合体,目前认为这四种组分为构成具有天冬氨酸蛋
    白酶活性的γ-分泌酶所必需,其中,Presenilin是γ-分泌酶复合体的蛋白酶催化亚
    基。β-分泌酶和γ-分泌酶在生理条件下都有多种底物,并且这些底物的剪切产物
    在神经发育过程以及神经元功能等多方面的信号调节都发挥了重要功能。而β-分
    泌酶和γ-分泌酶也可能通过蛋白质间相互作用形成剪切复合体对于APP发挥蛋白
    水解功能。

    目前通过FDA批准在多国上市的用于AD临床治疗的药物分为两类,第一类
    属于乙酰胆碱酯酶抑制剂,包括多奈哌齐,利斯的敏和加兰他敏,能通过抑制乙
    酰胆碱的降解,增加胆碱能神经递质传递,改善认知;第二类是美金刚,它是一
    个NMDA受体的非竞争性拮抗剂,被认为可以?;ど窬馐芄劝彼峤榈嫉纳窬?br />毒性。但是它们都只能起到暂时缓解症状的作用,无法从根本上治疗阿尔茨海默
    症。近期处于研发或者临床实验阶段的抗AD药物包括分泌酶调节物(γ-secretase
    modulators,GSMs)、Aβ寡聚体形成抑制剂、抗炎症药物、神经递质调节剂、降
    低胆固醇的药物以及抗氧化药物等。除此之外,Aβ免疫疗法以及激素疗法等治疗
    方法也正被用于临床研究和实验。γ-分泌酶抑制剂也属于一类分泌酶调节物,一直
    受到广泛关注和研究,它们能够通过抑制γ-分泌酶的天冬氨酸蛋白酶活性而减少
    Aβ产生,但因其对γ-分泌酶其他剪切底物(如Notch、E-cadherin等)的剪切抑制等
    毒副作用而在临床实验中疗效甚微。

    综上,本领域迫切需要进一步开发对于AD的临床治疗有效但副作用较低的
    药物。

    发明内容

    本发明的目的在于提供减弱BACE1和PS1相互作用的物质在制备治疗阿尔
    茨海默症的组合物中的用途。

    在本发明的第一方面,提供减弱β位淀粉样前体蛋白裂解酶1(BACE1)和早
    老蛋白1(PS1)之间相互作用的物质在制备治疗阿尔茨海默症的组合物(药物)中的
    用途。

    在本发明的另一方面,提供减弱β位淀粉样前体蛋白裂解酶1和早老蛋白1
    之间相互作用的物质在制备下调(细胞水平)Aβ的组合物(药物)中的用途;较佳地,
    所述的Aβ包括:(细胞内)总Aβ,Aβ42,Aβ40和/或Aβ38。

    在一个优选例中,所述的减弱β位淀粉样前体蛋白裂解酶1和早老蛋白1之
    间相互作用的物质包括:3α-木通萜酸(3α-Akebonoicacid)。

    在另一优选例中,所述的减弱β位淀粉样前体蛋白裂解酶1和早老蛋白1之
    间相互作用的物质是对β位淀粉样前体蛋白裂解酶1和γ-分泌酶的活性无影响的
    物质。

    在另一优选例中,所述的减弱β位淀粉样前体蛋白裂解酶1和早老蛋白1之
    间相互作用的物质不包括对β位淀粉样前体蛋白裂解酶1和γ-分泌酶的活性产生
    影响的物质。

    在本发明的另一方面,提供一种用于治疗阿尔茨海默症或用于下调Aβ的药
    物组合物,所述的组合物包括:减弱β位淀粉样前体蛋白裂解酶1和早老蛋白1
    之间相互作用的物质和药学上可接受的载体。

    在一个选例中,所述的减弱β位淀粉样前体蛋白裂解酶1和早老蛋白1之间
    相互作用的物质在药物组合物中的含量是有效量的。

    在另一优选例中,所述的减弱β位淀粉样前体蛋白裂解酶1和早老蛋白1之
    间相互作用的物质包括:3α-木通萜酸;较佳地,所述的减弱β位淀粉样前体蛋白
    裂解酶1和早老蛋白1之间相互作用的物质是对β位淀粉样前体蛋白裂解酶1和γ-
    分泌酶的活性无影响的物质。

    在本发明的另一方面,提供一种用于治疗阿尔茨海默症或用于下调Aβ的药
    盒,所述的药盒中包括:容器,以及装于该容器中的所述的药物组合物。

    在本发明的另一方面,提供一种筛选治疗阿尔茨海默症的潜在物质或下调
    Aβ(细胞内Aβ水平)的潜在物质的方法,所述方法包括:

    (1)将候选物质与β位淀粉样前体蛋白裂解酶1与早老蛋白1相互作用的体系
    接触;

    (2)检测候选物质对β位淀粉样前体蛋白裂解酶1与早老蛋白1相互作用的影
    响;

    若所述候选物质可抑制(包括:减弱、阻断或解离)β位淀粉样前体蛋白裂解酶
    1与早老蛋白1相互作用,则表明该候选物质是治疗阿尔茨海默症的潜在物质或下
    调Aβ的潜在物质。

    在一个优选例中,在测试组中,将候选物质加入到β位淀粉样前体蛋白裂解
    酶1与早老蛋白1相互作用的体系中;和/或

    步骤(2)包括:检测测试组的体系中β位淀粉样前体蛋白裂解酶1与早老蛋白
    1相互作用情况,并与对照组比较,其中所述的对照组是不添加所述候选物质的β
    位淀粉样前体蛋白裂解酶1与早老蛋白1相互作用的体系;

    如果测试组中β位淀粉样前体蛋白裂解酶1与早老蛋白1的相互作用在统计
    学上弱于(优选显著弱于,如弱20%以上,较佳的弱50%以上;更佳的弱80%以上)
    对照组,就表明该候选物质是治疗阿尔茨海默症的潜在物质或下调Aβ的潜在物
    质。

    在另一优选例中,所述的候选物质包括(但不限于):小分子化合物,针对β
    位淀粉样前体蛋白裂解酶1和/或早老蛋白1或其上下游蛋白或通路设计的调控β
    位淀粉样前体蛋白裂解酶1和/或早老蛋白1的表达、活性、作用方式、作用时间
    的物质。

    在另一优选例中,采用免疫沉淀法,酵母双杂交法,荧光素酶报告基因法,
    荧光共振能量转移法,Split-TEV法等方法来确定β位淀粉样前体蛋白裂解酶1与
    早老蛋白1相互作用的强弱。

    在另一优选例中,所述的体系选自:细胞体系(或细胞培养物体系)、亚细胞体系
    (或亚细胞培养物体系)、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

    在另一优选例中,所述方法还包括:对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验
    和/或动物试验,以从候选物质中进一步选择和确定对于治疗阿尔茨海默症或下调
    Aβ有用的物质。

    本发明的其它方面由于本文的公开内容,对本领域的技术人员而言是显而易
    见的。

    附图说明

    图1、BACE1/PS1相互作用以及分泌酶抑制剂和调节剂对其影响。

    (A)U2OS细胞检测瞬时过表达的CFP-PS1与BACE1-YFP蛋白亚细胞共定
    位。

    (B)HEK293T细胞检测瞬时过表达的PS1(FL(全长))和PS1-NTF与
    3’HA-BACE1的免疫共沉淀。图中,β-Gal作为免疫沉淀的阴性对照。

    (C)荧光共振能量转移法检测CFP-PS1/APH1aL-YFP,CFP-PS1/NCT-YFP,
    CFP-PS1/BACE1-YFP,BACE1-CFP/YFP-PS1之间的能量转移效率,以CFP-YFP
    作为阳性对照,BACE1-CFP/YFP作为阴性对照。

    (D)在HEK293MSR细胞中用Split-TEV法检测蛋白间相互作用,
    NTEV-KvBeta1/Kv1.1-CTEV作为阳性对照,NTEV-KvBeta1/APH1aL-CTEV和
    NTEV-KvBeta1/BACE1-CTEV作为阴性对照,检测
    PS1-NTF-NTEV/APH1aL-CTEV,APH1aL-NTEV/PS1-NTF-CTEV,
    PS1-NTF-NTEV/BACE1-CTEV,BACE1-NTEV/PS1-NTF-CTEV相互作用信号。

    (E)检测γ-分泌酶抑制剂L-685,458和BMS-708163,BACE1抑制剂
    BSI-IV(BACE1inhibitorIV,购自Calbiochem),γ-分泌酶调节剂E2012(由银杏树
    药业合成)对于PS1/BACE1在Split-TEV实验中的相互作用信号影响以及在细胞
    Aβ42产生的抑制作用?;衔锞?μM浓度处理细胞。

    图2、3α-木通萜酸(3α-Akebonoicacid)对于PS1/BACE1相互作用和细胞产
    生Aβ的影响。

    (A)3α-Akebonoicacid化学结构式。

    (B)10μM浓度下3α-Akebonoicacid对于NTEV-KvBeta1/Kv1.1-CTEV和
    PS1-NTF-NTEV/BACE1-CTEV在Split-TEV实验中相互作用信号的影响。Vehicle:
    溶液对照。

    (C)10μM浓度下3α-Akebonoicacid对于HEK293APPswe细胞产生总体Aβ
    的影响,作为对照的γ-分泌酶抑制剂L-685,458和BACE1抑制剂BSI-IV(BACE1
    inhibitor-IV)使用1μM浓度处理细胞,进行化合物处理4小时后收集细胞培液上
    清,ELISA检测培液样品中总体Aβ水平。

    (D)3α-Akebonoicacid对于PS1-NTF-NTEV/BACE1-CTEV的Split-TEV信号、
    HEK293APPswe细胞和SK-N-SH-APPswe细胞(图注SKAPPswe)产生总体Aβ水平
    的浓度曲线。

    (E)免疫共沉淀法检测化合物对于PS1/BACE1相互作用的影响,使用3μM浓
    度化合物处理细胞,图示5次重复实验的定量统计结果。

    (F)荧光共振能量转移法检测化合物对于PS1/BACE1相互作用的影响,使用3
    μM浓度化合物处理细胞,图示3次重复实验的统计结果(误差线代表标准误;
    *p<0.05,**p<0.01)。

    图3、3α-Akebonoicacid对于β-分泌酶和γ-分泌酶底物剪切活性的影响。

    (A)3α-Akebonoicacid处理4小时对于HEK293APPswe细胞产生Aβ40,Aβ42
    和Aβ38的抑制作用。

    (B)3α-Akebonoicacid处理4小时对于HEK293APPswe细胞中APPswe剪切中
    间产物sAPPα/sAPPβ和C99/C83的影响。γ-分泌酶抑制剂L-685,458和BACE1
    抑制剂BSI-IV(BACE1inhibitor-IV)使用1μM浓度处理细胞,作为对照。
    3α-Akebonoicacid使用1μM,3μM和10μM浓度处理细胞。

    (C)体外孵育检测化合物对BACE1和γ-分泌酶对于各自荧光底物剪切活性的
    影响,γ-分泌酶抑制剂L-685,458和BACE1抑制剂BSI-IV(BACE1inhibitor-IV)
    使用10μM浓度处理细胞,作为对照。3α-Akebonoicacid使用30μM。图示5次
    重复实验统计结果。

    (D)C99-GVP实验检测化合物对于γ-分泌酶剪切活性即报告基因强度的影
    响。

    (E)NotchΔE-GVP实验检测化合物对于γ-分泌酶剪切活性即报告基因强度的
    影响。在以上报告基因实验中,浓度梯度的3α-Akebonoicacid和L-685,458处理
    瞬时过表达报告基因质粒的HEK293T16-18小时后收细胞进行检测。

    (F)化合物对于NICD产生的影响。HEK293T细胞瞬时过表达myc-NotchΔE
    质粒后24小时给予化合物处理,γ-分泌酶抑制剂L-685,458和BACE1抑制剂
    BSI-IV(BACE1inhibitor-IV)使用10μM浓度处理细胞,作为对照;3α-Akebonoic
    acid使用3μM,10μM和30μM浓度处理细胞。

    (G)化合物对于E-cadherin剪切产生的CTF-1/CTF-2影响。收集A431细胞提
    取膜组分后进行化合物体外孵育,γ-分泌酶抑制剂L-685,458和BACE1抑制剂
    BSI-IV(BACE1inhibitor-IV)使用10μM浓度处理细胞,作为对照;3α-Akebonoic
    acid使用3μM,10μM和30μM浓度处理细胞(图中所示免疫印迹结果为3-5次
    重复实验中的代表性结果,统计结果中的误差线代表标准。*p<0.05,**p<0.01)。

    具体实施方式

    本发明人经过广泛的研究,发现减弱BACE1和PS1间相互作用的物质能够降
    低细胞水平的Aβ产生,而对于BACE1和γ-分泌酶的活性没有明显抑制作用。因
    此,减弱BACE1和PS1间相互作用的物质可以成为一类对BACE1和γ-分泌酶的
    活性没有影响但能特异性抑制Aβ产生的新型分泌酶调节剂,从而作为抗阿尔茨海
    默症(AD)类药物。

    BACE1及PS1

    BACE1是本领域技术人员熟知的,β-淀粉样蛋白是通过几种酶的活性而形成,
    其中包括一种是BACE1。大部分的阿尔茨海默氏症患者均有BACE1水平增高,
    转而导致了更多的脑损害β-淀粉样蛋白。

    一般地,人源BACE1蛋白具有GenBank登录号NM_012104.3所示的氨基酸
    序列,其编码序列参见GenBank登录号NM_012104.3所示的序列。

    早老蛋白1(presenilin1,PS1)是本领域技术人员熟知的,其是近年来确定的导
    致阿尔茨海默症发病的因素之一,人早老蛋白1定位于染色体14q24.3座位
    (D14S43、D14S71、D14S77),其是含有467个氨基酸残基的多次跨膜蛋白,定位
    于内质网、内质网到高尔基体转运中间物、高尔基体的顺面以及细胞表面。PS1
    作为γ分泌酶复合体的重要组成部分,不仅参与胚胎发育的调控,并且参与βAPP
    代谢途径、Notch信号通路、E-cadherin细胞间相互作用、Wnt信号通路及GH受
    体信号通路等的调控。

    一般地,人源PS1蛋白具有GenBank登录号NM_000021所示的氨基酸序列,
    其编码序列参见GenBank登录号NM_000021所示的序列。

    筛选方法

    在得知了所述的BACE1与PS1相互作用降低细胞水平Aβ直接相关后,可以
    基于该机制来筛选抑制(包括:减弱、阻断或解离)BACE1与PS1相互作用的物质,
    将筛选获得的物质作为可以治疗阿尔茨海默症的潜在药物。

    因此,本发明提供一种筛选可用于筛选治疗阿尔茨海默症的潜在物质或下调
    Aβ的潜在物质的方法,所述的方法包括:将候选物质与BACE1与PS1相互作用
    的体系接触;和检测候选物质对BACE1与PS1相互作用的影响;若所述候选物质
    可抑制(包括:减弱、阻断或解离)BACE1与PS1相互作用,则表明该候选物质
    是可用于治疗阿尔茨海默症的潜在物质或下调Aβ(细胞内Aβ水平)的潜在物质。

    在本发明的优选方式中,在进行筛选时,为了更易于观察到BACE1与PS1
    相互作用的改变,还可设置对照组,所述的对照组可以是不添加所述候选物质的
    BACE1与PS1相互作用的体系。

    所述的体系包括(但不限于):溶液体系、亚细胞体系、细胞(细胞培养物)体
    系、组织体系、器官体系、或动物体系。

    在本发明中,检测蛋白质与蛋白质之间相互作用以及相互作用的强弱可采用
    多种本领域技术人员熟知的技术,比如GST沉降技术(GSTPull-Down)、噬菌体展
    示技术、酵母双杂交系统、荧光素酶报告基因技术或免疫共沉淀技术等等。本发
    明对于检测候选物质对BACE1与PS1相互作用的强弱的方法没有特别的限制,所
    述方法优选的是:免疫沉淀法,酵母双杂交法,荧光素酶报告基因法,荧光共振
    能量转移法,Split-TEV法,所述方法的一些实施形式在本发明的实施例中有描述。
    通??梢陨柚貌患尤牒蜓∥镏实亩哉?,从而通过将测试组与对照组进行比较来确
    定候选物质是否对于抑制BACE1与PS1相互作用是有用的。

    作为本发明的优选方式,所述的方法还包括:对获得的潜在物质进行进一步
    的细胞实验和/或动物试验,以进一步选择和确定对于治疗阿尔茨海默症或下调Aβ
    真正有用的物质。

    另一方面,本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可用于治疗阿尔茨海默
    症或下调Aβ的潜在物质。这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库,以便于人们
    最终可以从中筛选出能够对于治疗阿尔茨海默症或对于下调Aβ真正有用的物质。

    减弱BACE1和PS1之间相互作用的物质及其药物组合物

    本发明还提供了一类减弱BACE1和PS1之间相互作用的物质,所述物质可由
    前述的筛选方法获得,这些物质可以用于制备治疗阿尔茨海默症的组合物(药物)。

    本发明人从BACE1和PS1的相互作用入手,建立了高通量筛选系统,筛选到
    了能够减弱BACE1和PS1间相互作用的小分子3α-木通萜酸(3α-Akebonoicacid)。
    因此,作为本发明的优选方式,所述的减弱BACE1和PS1之间相互作用的物质是
    3α-Akebonoicacid,经验证其能显著地降低细胞水平的Aβ(总Aβ,Aβ38,Aβ40
    和/或Aβ42)量。并且,经验证3α-Akebonoicacid对β位淀粉样前体蛋白裂解酶1
    和γ-分泌酶的活性无影响,这将产生较小的副作用。

    本发明还提供了一种药物组合物,它含有有效量(如0.000001-50wt%;较佳
    的0.00001-20wt%;更佳的,0.0001-10wt%)的减弱BACE1和PS1之间相互作用的
    物质,以及药学上可接受的载体。

    本发明的药物组合物可直接用于哺乳动物。此外,还可同时与其它治疗剂或辅剂
    联合使用。

    通常,可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质
    中,其中pH通常约为5-8,较佳地,pH约为6-8。

    如本文所用,术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组
    合物中。术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。如本
    文所用,术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的
    且可被人和/或动物所接受的量。

    如本文所用,“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度
    不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的,即具有合理的效益/风险比的物质。
    术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体,包括各种赋形剂和稀释
    剂。

    所述的药学上可接受的载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、
    甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配,本发明的药物组合
    物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过
    常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造?;钚猿煞值母┝?br />是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。

    本发明所述的减弱BACE1和PS1之间相互作用的物质的有效量可随给药的模式
    和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技
    术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于:所述
    的减弱BACE1和PS1之间相互作用的物质的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、
    半衰期等;患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给
    药的途径等。通常,当本发明的减弱BACE1和PS1之间相互作用的物质每天以约
    0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予,
    能得到令人满意的效果。例如,由治疗状况的迫切要求,可每天给予若干次分开
    的剂量,或将剂量按比例地减少。

    下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明
    本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,
    通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著,分子克隆实验指南,第三版,科学出
    版社,2002中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。

    以下实施例中,所述的瞬时过表达蛋白种属以及序列如表1。扩增各蛋白的
    编码序列所用的引物如表2。

    表1


    表2



    实施例1、PS1/BACE1之间的相互作用以及化合物对相互作用的影响

    1.免疫荧光染色检测PS1和BACE1蛋白亚细胞共定位

    1.1.实验目的

    用免疫荧光染色实验检测PS1和BACE1蛋白的亚细胞共定位。

    1.2.实验原理

    在PS1的N端和BACE1的C端分别融合青色荧光蛋白CFP和黄色荧光蛋白
    YFP,利用瞬时过表达的方法转染U2OS细胞系(购自ATCC),采集荧光蛋白相应
    波长范围的图像,分析PS1和BACE1蛋白的亚细胞共定位情况。

    1.3实验样品

    瞬时过表达CFP-PS1和BACE1-YFP的U2OS细胞。

    瞬时过表达CFP-PS1的重组质粒的构建:以表2中提供的引物分别扩增CFP
    和PS1的编码序列,将两条编码序列相连接,插入到pcDNA3的EcoRI/XbaI中。

    瞬时过表达BACE1-YFP的重组质粒的构建:以表2中提供的引物分别扩增
    YFP和BACE1的编码序列,将两条编码序列相连接,插入到pcDNA3的EcoRI/XbaI
    中。

    1.4实验方法

    1.4.1U2OS细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养于含有5%二氧化
    碳的37℃细胞培养箱。

    1.4.2胰酶消化后悬浮的U2OS细胞铺于放有盖玻片的6孔板16-18小时后,
    进行脂质体转染。

    1.4.3过表达CFP-PS1和BACE1-YFP的质粒分别转染或共转染48小时后,
    细胞用4%多聚甲醛于室温固定15分钟,用1%BSA/PBS漂洗3次后即用封片剂
    封片,细胞样品随后用激光共聚焦显微镜观察并获得图像。

    2.免疫共沉淀法检测PS1和BACE1蛋白间相互作用

    2.1实验目的

    利用免疫共沉淀法检测PS1和BACE1蛋白间相互作用;加入受试化合物处理
    后检测化合物对于免疫共沉淀效率的影响,即对PS1和BACE1蛋白相互作用的影
    响。

    2.2实验原理

    细胞瞬时过表达3’端融合HA标签的BACE1和PS1或PS1-NTF(PS1自剪切
    后的N段),将偶联HA抗体的琼脂糖凝胶与细胞裂解液孵育,3’HA-BACE1会被
    抗体识别而沉淀于琼脂糖凝胶,用缓冲液清洗去除非特异性结合的蛋白后,将沉
    淀于琼脂糖凝胶的蛋白用SDS-PAGE上样缓冲液洗脱并进行免疫印迹检测;带有
    Flag标签的免疫共沉淀按照同样方法进行,使用偶联Flag抗体的琼脂糖凝胶进行
    孵育。若PS1与BACE1之间存在相互作用,则在最终洗脱得到的样品中能够检测
    到PS1或PS1-NTF的存在。

    2.3实验样品

    瞬时过表达PS1和BACE1的HEK293T细胞。

    实验前将化合物溶于DMSO(二甲亚砜)配制母液,使用时用培养液稀释至所需
    浓度。

    瞬时过表达PS1(全长(FL))的重组质粒构建:人工合成编码PS1(FL)(GeneBank
    登录号NM_000021)的核苷酸序列,插入到pcDNA3.1载体(Invitrogen)的HindIII
    和XhoI位点中。

    瞬时过表达PS1-NTF的重组质粒构建:人工合成PS1-NTF的核苷酸序列(全
    长PS1编码序列的第1-873bp),插入到pcDNA3.1载体(Invitrogen)的HindIII和XhoI
    位点中。

    瞬时过表达3’HA-BACE1的重组质粒由UniversityofPennsylvania,Schoolof
    Medicine的RobertW.Doms教授提供。

    2.4实验方法

    2.4.1HEK293T细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养于含有5%二
    氧化碳的37℃细胞培养箱。

    2.4.2胰酶消化后悬浮的HEK293T细胞铺于60mm培养皿后采用磷酸钙法转
    染。

    2.4.3过表达3’端融合HA标签的BACE1的质粒和过表达3’端融合Flag的
    PS1或PS1-NTF的质粒共转染36小时后给予所需浓度的化合物处理。

    2.4.4化合物处理细胞16-18小时后,以预冷的PBS洗两遍,离心收集细胞,
    加入裂解液(50mMHEPESpH7.5、150mMNaCl、5mMEDTA、10%甘油、
    1%CHAPSO和蛋白酶抑制剂)吹散细胞团块后于4℃裂解1小时。

    2.4.5细胞裂解完毕后,以12,000g于4℃离心15分钟。取上清,加入偶联抗
    体的琼脂糖凝胶于4℃孵育4小时然后以8,000g于4℃离心收集琼脂糖凝胶,用
    裂解缓冲液洗3次后加入60μLSDS-PAGE上样缓冲液洗脱蛋白质。

    2.4.6用免疫印迹杂交方法检测免疫沉淀产物。对于免疫印迹,通过
    IRDye800CW偶联二抗激发远红外荧光,由Odyssey远红外图像系统取得图像。

    3.荧光共振能量转移法检测PS1和BACE1蛋白间相互作用

    3.1实验目的

    利用1中构建的用于表达的CFP-PS1蛋白和BACE1-YFP蛋白的质粒检测二
    者间荧光共振能量转移效率,检测PS1和BACE1蛋白间相互作用以及化合物对于
    PS1和BACE1蛋白间相互作用的影响。

    3.2实验原理

    CFP作为荧光供体,YFP作为荧光受体,当二者相互靠近时会发生荧光共振
    能量转移。将待检测蛋白与CFP和YFP融合构建成重组蛋白,瞬时过表达后用激
    光共聚焦显微镜采集图像;用荧光受体蛋白的激发光对其进行光漂白,统计光漂
    白前后荧光供体蛋白的荧光强度变化即荧光共振能量转移效率。

    3.3实验样品

    瞬时过表达APH1aL-YFP的质粒构建:以表2中提供的引物分别扩增APH1aL
    和YFP的编码序列,将两条编码序列相连接,插入到pcDNA3的EcoRI/XbaI中。

    瞬时过表达NCT-YFP的质粒构建:以表2中提供的引物分别扩增NCT和YFP
    的编码序列,将两条编码序列相连接,插入到pcDNA3的NotI/XbaI中。

    瞬时过表达BACE1-CFP的质粒构建:以表2中提供的引物分别扩增BACE1
    和CFP的编码序列,将两条编码序列相连接,插入到pcDNA3的EcoRI/XbaI中。

    瞬时过表达YFP-PS1的质粒构建:以表2中提供的引物分别扩增YFP和PS1
    的编码序列,将两条编码序列相连接,插入到pcDNA3的HindIII/XhoI中。

    瞬时过表达CFP-YFP的质粒构建:以表2中提供的引物分别扩增CFP和YFP
    的编码序列,将两条编码序列相连接,插入到pcDNA3的EcoRI/XbaI中。

    瞬时过表达CFP-X和X-YFP蛋白(X代表的蛋白见图2)的HEK293细胞。

    实验前将化合物溶于DMSO(二甲亚砜)配制母液,使用时用培养液稀释至所需
    浓度。

    3.4实验方法

    3.4.1HEK293细胞用含有10%胎牛血清的MEM培养基培养于含有5%二氧化
    碳的37℃细胞培养箱。

    3.4.2胰酶消化后悬浮的HEK293细胞铺于含有盖玻片的6孔板后采用脂质体
    法转染。

    3.4.3过表达CFP-X和X-YFP的质粒共转染36小时后给予所需浓度的化合物
    处理。

    3.4.4化合物处理16-18小时后,细胞用4%多聚甲醛于室温固定15分钟,用
    1%BSA/PBS漂洗3次后即用封片剂封片。细胞样品随后用激光共聚焦显微镜观察
    并获得图像,以光漂白法统计荧光共振能量转移效率:FRETefficiency=(FCFP,
    after-FCFP,before)/FCFP,after。

    4.Split-TEV法检测PS1和BACE1蛋白间相互作用

    4.1.实验目的

    用Split-TEV实验检测化合物对PS1/BACE1相互作用的抑制活性。

    4.2.实验原理

    将以γ-分泌酶的催化中心PS1和BACE1这两个蛋白分别融合在烟草蚀纹病毒
    的TEV蛋白酶的C端和N端上;如果这两个蛋白有相互作用,那么C、N两端会
    接近,TEV蛋白酶发挥活性,剪切释放转录因子然后启动报告基因荧光素酶Firefly
    的表达,其活性反映上游蛋白相互作用。

    4.3.实验样品

    实验前将化合物溶于DMSO(二甲亚砜)配制母液,使用时用培养液稀释至所需
    浓度。

    Split-TEV实验所使用的HEK293-MSR细胞、对照质粒(NTEV-KvBeta1,
    Kv1.1-CTEV,转录因子质粒ERT2-tev-LexA-Gal4和报告基因质粒
    LexA-op-F-lucF-luciferase)和所有载体(p4062,p4063和p3639)获自Sanofi-Aventis
    Recherche&Development公司。待检测蛋白质粒构建策略如表3所示。

    表3.Split-TEV实验质粒构建使用引物与酶切位点


    4.4.实验方法

    4.4.1HEK293-MSR细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养于含有5%
    二氧化碳的37℃细胞培养箱。

    4.4.2胰酶消化后悬浮的HEK293-MSR细胞采用FugeneHD进行转染,以
    2.5×104/孔细胞密度铺板于96孔板。

    4.4.3培养4小时后给予化合物处理。实验前将溶解于DMSO的化合物母液用
    PBS配制成最终浓度的10倍,取10μl/孔加入96孔板处理细胞。

    4.4.4化合物处理细胞16-18小时后,使用SteadyGlo试剂盒(Promega)检测荧
    光素酶活性。

    5.实验结果

    1.PS1/BACE1蛋白间相互作用的验证以及经典分泌酶抑制剂和调节剂对于
    相互作用的影响

    在免疫荧光实验中本发明人发现,CFP-PS1与BACE1-YFP具有明显的呈小点
    状的亚细胞共定位(图1A),提示可能PS1与BACE1的相互作用对于APP剪切产
    生Aβ的过程具有重要作用,进一步可能在AD发病过程中具有调节作用。

    在1%CHAPSO去垢剂条件下进行PS1(FL,全长)和PS1-NTF(自剪切成熟后
    的PS1N段)免疫共沉淀实验,结果能够检测到PS1全长和PS1-NTF都能够与
    BACE1发生共沉淀(图1B)。说明PS1和BACE1在亚细胞空间定位上彼此接近,
    PS1能够与BACE1发生相互作用,并且PS1-NTF即可与BACE1发生相互作用。

    为了证实二者空间距离足以发生相互作用并量化PS1/BACE1相互作用,本发
    明人用分别融合了CFP和YFP这一对荧光蛋白的待检测蛋白作为荧光能量的供体
    和受体,进行了荧光共振能量转移实验(FRET,图1C)。结果显示PS1与BACE1
    之间的能量转移效率与γ-分泌酶复合体内部组分之间(PS1与APH1aL,PS1与NCT)
    的能量转移效率相当。

    同时,在Split-TEV实验中,本发明人也得到类似的实验结果(图1D),发现
    PS1与BACE1之间存在显著相互作用,这一相互作用的信号与PS1/APH1aL之间
    的相互作用强弱接近。

    L-685,458(购自Calbiochem)和BMS-708163(购自SelleckChemicals)是两个γ-
    分泌酶抑制剂,E2012(由银杏树药业合成)是γ-分泌酶调节剂,它们都通过结合于
    γ-分泌酶催化亚基PS1的不同位点,对于γ-分泌酶的催化活性发货抑制或调节作
    用。BSI-IV(BACE1inhibitorIV)是β-分泌酶的抑制剂,能够结合与BACE1的催化
    中心抑制其底物剪切。本发明人用Split-TEV实验检测了这些化合物对于
    PS1/BACE1相互作用的影响,在1μM浓度下,这些化合物均能够显著抑制Aβ42
    的产生;然而,它们对于PS1/BACE1的Split-TEV相互作用信号并没有抑制(图1E)。

    实施例2、化合物对Aβ产生的影响

    1.实验目的

    用酶联免疫吸附法检测化合物处理后细胞产生Aβ水平的变化。

    2.实验原理

    HEK293APPswe细胞株(HEK293细胞内转染3’HA-APPswe表达质粒并使用抗
    生素筛选后得到稳定表达APPswe的细胞株)和SK-N-SH-APPswe细胞株(SK-N-SH
    细胞购自ATCC,经过转染3’HA-APPswe表达质粒并使用抗生素筛选后得到稳定
    表达APPswe的细胞株)能够稳定表达人源APPswedish突变体,APPswedish蛋白
    能够被细胞内源的BACE1和γ-分泌酶剪切产生Aβ,受试化合物处理后用ELISA
    法能够检测Aβ产生水平的变化。

    HA-APPswe质粒如下构建:以HEK293细胞总RNA为模板,以
    5’-AGCGATATCGATGCTGCCCGGTTTGGC-3’和5’-ATGCTCTAGATTA
    GGCGTAGTCGGGGACGTCGTAGGGGTAGTTCTGCATCTGCTCAAAG-3’为引
    物通过逆转录-PCR扩增获得APP编码序列,并且在其3’端带有HA抗原表位通
    过引物设计引入以便于检测。通过EcoRV/XbaI双酶切位点将APP编码序列克隆
    入pcDNA3.1载体,突变为“Swedish”突变体(K670M/N671L)。

    3.实验样品

    实验前将化合物溶于DMSO,配制母液,使用时用培养液稀释至所需浓度。

    4.实验方法

    4.1HEK293APPswe和SK-N-SH-APPswe细胞均用含有10%胎牛血清的
    DMEM培养基培养于含有5%二氧化碳的37℃细胞培养箱。

    4.2胰酶消化后悬浮的细胞以2.5×104/孔细胞密度铺板于96孔板。

    4.3培养16-18小时后细胞换液同时给予药物处理。实验前将溶解于DMSO的
    化合物母液用PBS配制成最终浓度的10倍,取10μl/孔加入96孔板处理细胞。

    4.4药物处理8小时后收集培液,按照依科赛生物有限公司试剂盒所提供的实
    验方法进行总Aβ、Aβ40和Aβ42检测;按照IBL公司试剂盒所提供的实验方法进
    行Aβ38检测。

    5.结果

    基于PS1-NTF-NTEV/BACE1-CTEV在Split-TEV实验中的相互作用信号,本
    发明人建立了高通量筛选系统,经过大量的前期筛选工作,筛选到小分子化合物
    3α-Akebonoicacid(结构式如图2A),在10μM浓度下它能够显著抑制
    PS1-NTF-NTEV/BACE1-CTEV的相互作用信号,而对于对照组
    NTEV-KvBeta1/Kv1.1-CTEV的相互作用没有明显影响(图2B)。

    同时,该化合物能够在10μM浓度下降低细胞水平的总Aβ水平(图2C)。

    为了进一步验证该化合物对于相互作用和细胞总Aβ水平的验证,本发明人对
    细胞进行了浓度梯度化合物处理,并且同时用SKAPPswe稳转细胞株验证了化合
    物的抑制效率,结果表明,化合物3α-Akebonoicacid对于
    PS1-NTF-NTEV/BACE1-CTEV的相互作用信号、HEK293APPswe和SKAPPswe
    两种稳转细胞株的总体Aβ产生水平都有浓度依赖的抑制作用,IC50≤3μM(图2D)。
    在这一化合物浓度的处理下,用免疫共沉淀法(图2E)和荧光共振能量转移法(图2F)
    检测PS1和BACE1之间的相互作用也能够得到类似的效果,并且其抑制效率与对
    照组相比具有显著性差异。

    因此,3α-木通萜酸(Akebonoicacid)能够减弱PS1/BACE1相互作用并降低细
    胞水平Aβ的产生。

    实施例3、化合物对分泌酶底物剪切的影响

    1.化合物对分泌酶剪切APPswe的影响

    1.1实验目的

    受试化合物处理细胞后,用免疫印迹法检测HEK293APPswe细胞的
    APPswedish蛋白剪切中间产物的水平。

    1.2实验原理

    HEK293APPswe细胞,其稳定表达的人源APP蛋白swedish突变体,能够被
    细胞内源的BACE1和α-分泌酶剪切产生sAPPβC99和sAPPαC83,C99和C83
    进一步被γ-分泌酶剪切。

    1.3.实验样品

    实验前将化合物溶于DMSO,配制母液,使用时用培养液稀释至所需浓度。

    1.4.实验方法

    1.4.1HEK293APPswe细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养于含有
    5%二氧化碳的37℃细胞培养箱。

    1.4.2胰酶消化后悬浮的细胞铺板于12孔板。

    1.4.3培养16-18小时后细胞换液同时给予药物处理。实验前将溶解于DMSO
    的化合物母液用DMEM配制成最终浓度,弃去12孔板的培液,加入含有化合物
    的培液。

    1.4.4药物处理4小时后收集培液,用于检测sAPPβ和sAPPα。

    1.4.5药物处理后的细胞以预冷的PBS洗两遍,离心收集,加入裂解液(50mM
    HEPESpH7.5、150mMNaCl、5mMEDTA、10%甘油、1%TritonX-100和蛋白酶
    抑制剂)吹散细胞团块后于4℃裂解1小时,BCA法蛋白定量后加入4×SDS-PAGE
    上样缓冲液。

    1.4.6免疫印迹法检测培液样品中的sAPPβ和sAPPα蛋白片段,细胞裂解液
    样品中的C99和C83蛋白片段。

    2.化合物对γ-分泌酶底物剪切NotchΔE的影响

    2.1实验目的

    受试化合物处理细胞后,用免疫印迹法检测细胞产生的NICD水平。

    2.2实验原理

    在HEK293T细胞中瞬时过表达myc-NotchΔE蛋白,作为γ-分泌酶底物可被
    剪切产生NICD;化合物处理细胞后,用免疫印迹法检测细胞产生NICD的水平。

    瞬时过表达myc-NotchΔE蛋白的质粒由WashingtonUniversity的Raphael
    Kopan教授提供。

    2.3.实验样品

    实验前将受试化合物溶于DMSO,配制母液,使用时用培养液稀释至所需浓
    度。

    2.4.实验方法

    2.4.1瞬时过表达myc-NotchΔE蛋白的HEK293T细胞用含有10%胎牛血清的
    DMEM培养基培养于含有5%二氧化碳的37℃细胞培养箱。

    2.4.2胰酶消化后悬浮的细胞铺板于12孔板,16-18小时后进行磷酸钙转染。

    2.4.3培养16-18小时后细胞换液同时给予药物处理。实验前将溶解于DMSO
    的化合物母液用DMEM配制成最终浓度,弃去12孔板的培液,加入含有化合物
    的培液。

    2.4.4药物处理4小时后以预冷的PBS洗两遍,离心收集,加入裂解液(50mM
    HEPESpH7.5、150mMNaCl、5mMEDTA、10%甘油、1%TritonX-100和蛋白酶
    抑制剂)吹散细胞团块后于4℃裂解1小时,BCA法蛋白定量后加入4×SDS-PAGE
    上样缓冲液。

    2.4.5免疫印迹法检测细胞裂解液样品中的myc-NotchΔE蛋白和NICD蛋白片
    段。

    3.化合物对γ-分泌酶底物剪切E-Cadherin的影响

    3.1实验目的

    化合物处理细胞后,用免疫印迹法检测细胞E-Cadherin以及剪切底物产生的
    水平。

    3.2实验原理

    A431细胞(ATCC)内源的E-Cadherin的剪切中间产物产生E-CadCTF-1能够
    被γ-分泌酶剪切产生E-CadCTF-2?;衔锎硐赴笥妹庖哂〖7觳?br />E-Cadherin,CTF-1和CTF-2的水平。

    3.3.实验样品

    实验前将化合物溶于DMSO,配制母液,使用时用培养液稀释至所需浓度。

    3.4.实验方法

    3.4.1A431细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养于含有5%二氧化
    碳的37℃细胞培养箱。

    3.4.2用预冷的PBS漂洗细胞后,以细胞刮收集10cm培养皿的细胞,离心收
    集。

    3.4.3加入低渗缓冲液(5mMTris-HClpH7.4,5mMEDTA,5mMEGTA),
    用29G胰岛素针反复抽吸以破碎细胞,800g于4℃离心10分钟,取上清。

    3.4.4BCA法测定上清蛋白浓度,取160μg总蛋白作为一个反应的起始量,
    25000g于4℃离心60分钟,弃上清。

    3.4.5膜沉淀用反应缓冲液(50mMTris-HClpH6.8,2mMEDTA,0.25%
    CHAPSO)重悬后,加入所需化合物母液至所需浓度,于37℃金属浴孵育4小时。

    3.4.6孵育结束后将样品置于冰上以终止反应,加入4×SDS-PAGE样品缓冲
    液,免疫印迹法检测E-Cadherin,CTF-1和CTF-2的水平。

    4.结果:3α-Akebonoicacid能够减少不同的Aβ肽段产生但不抑制分泌酶活

    基于3α-Akebonoicacid化合物对细胞产生的总体Aβ具有抑制作用,本发明
    人进一步考察了细胞中三种主要的Aβ肽段——Aβ40、Aβ42和Aβ38产生,实验
    结果发现3α-Akebonoicacid化合物对于这三种Aβ肽段均有浓度依赖的抑制作用,
    并且IC50均在3μM左右(图3A)。这一结果提示化合物对于APP的剪切具有调
    节作用,通过抑制BACE1剪切APP或γ-分泌酶剪切C99/C83而抑制多种Aβ肽
    段的整体产生水平。然而,在APP剪切中间产物的检测实验中,本发明人发现化
    合物处理后,无论是全长的APPswe,经α-分泌酶或BACE1剪切产生的sAPPα和
    sAPPβ,抑或是经α-分泌酶或BACE1剪切产生作为γ-分泌酶直接底物的C99/C83
    片段,均没有发生积累或减少(图3B)。提示3α-Akebonoicacid并不对分泌酶剪切
    APP的活性具有直接抑制作用。

    实施例4、化合物对γ-分泌酶底物融合报告基因剪切的影响

    1.实验目的

    利用C99-GVP和NotchΔE-GVP报告基因系统检测化合物对于细胞内源γ-分
    泌酶活性的作用。

    2.实验原理

    C99-GVP和NotchΔE-GVP是融合了GVP转录元件的两个重组蛋白,与C99
    和NotchΔE一样能够被γ-分泌酶剪切,剪切后释放转录元件,启动报告基因Firefly
    表达,报告基因Firefly的活性可反映γ-分泌酶对于C99-GVP和NotchΔE-GVP这
    两个重组底物的剪切活性;同时转染的Renilla作为内参。

    3.实验样品

    3.1瞬时过表达C99-GVP或NotchΔE-GVP报告基因质粒的HEK293T细胞。

    C99-GVP和Notch△E-GVP荧光素酶报告基因系统所有质粒由JohanLundkvist
    教授(KarolinskaInstitutet)提供。Renilla质粒瞬时过表达后作为内参,购自
    Invitrogen。

    3.2实验前将化合物溶于DMSO,配制母液,使用时用培养液稀释至所需浓度。

    4.实验方法

    4.1HEK293T细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养于含有5%二氧
    化碳的37℃细胞培养箱。

    4.2胰酶消化后悬浮的HEK293T细胞采用脂质体法进行转染,以2.5x104/well
    细胞密度铺板于96孔板。

    4.3培养4小时后给予化合物处理。实验前将溶解于DMSO的化合物母液用
    PBS配制成最终浓度的10倍,取10μl/孔加入96孔板处理细胞。

    4.4化合物处理细胞16-18小时后,使用DLR荧光素酶试剂盒(Promega)检
    测荧光素酶活性。

    5.结果

    本发明人也用灵敏度较高的C99-GVP报告基因实验检测了化合物对于γ-分泌
    酶剪切的作用,得到与前面一致的结果,化合物对于γ-分泌酶剪切活性没有影响(图
    3D)。

    γ-分泌酶具有诸多底物,这些底物在被剪切后产生的蛋白片段会在生理过程中
    发挥重要作用(如Notch、E-Cadherin和N-Cadherin),成为影响γ-分泌酶疗效以及
    副作用的重要原因。本发明人为了进一步确证化合物3α-Akebonoicacid对于γ-分
    泌酶其他底物剪切活性的作用,进行了NotchΔE-GVP报告基因实验(图3E)和NICD
    产生实验(图3F)检测其对于Notch剪切的影响,以及E-CadCTF-2产生实验检测
    其对于E-Cadherin剪切的影响(图3G)。实验结果发现,化合物3α-Akebonoicacid
    对于Notch剪切和E-Cadherin剪切均无明显的抑制作用。

    实施例5、体外检测化合物对分泌酶活性的影响

    1.实验目的

    用荧光底物体外检测化合物对于分泌酶剪切活性的作用。

    2.实验原理

    基于APPswe序列设计的β-/γ-分泌酶荧光底物携带两个荧光基团由于彼此靠
    近而相互淬灭,β-/γ-分泌酶荧光底物能够在相应的条件下在体外孵育时被β-/γ-分
    泌酶剪切,剪切后以一定的激发波和发射波检测能够检测到荧光信号的上升,反
    映β-/γ-分泌酶的剪切活性。

    3.实验样品

    实验前将化合物溶于DMSO,配制母液,使用时用培养液稀释至所需浓度。

    β-分泌酶荧光底物(购自Calbiochem,565781),按照2μg/μl浓度溶于DMSO
    配制母液,储存于-20℃。

    γ-分泌酶荧光底物(Calbiochem,565764),按照2μg/μl浓度溶于DMSO配制
    母液,储存于-20℃。

    4.实验方法

    4.1HEK293T细胞用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养于含有5%二氧
    化碳的37℃细胞培养箱。

    4.2用预冷的PBS漂洗细胞后,收集细胞。

    4.3加入低渗缓冲液(5mMTris-HClpH7.4,5mMEDTA,5mMEGTA),用
    29G胰岛素针反复抽吸以破碎细胞,800g于4℃离心10分钟,取上清。

    4.4BCA法测定上清蛋白浓度,取30μg总蛋白作为一个β-分泌酶反应的起始
    量,取120μg总蛋白作为一个γ-分泌酶反应的起始量。25000g于4℃离心60分
    钟,弃上清。

    4.5膜沉淀用反应缓冲液(β-分泌酶反应缓冲液:20ng/μlβ-分泌酶荧光底物,
    50mMNaAC,pH4.5,反应30分钟。γ-分泌酶反应缓冲液:20ng/μlγ-分泌酶荧
    光底物,50mMTris-HClpH6.8,2mMEDTA,0.25%CHAPSO,反应2小时)重
    悬后,加入所需化合物母液至所需浓度,于37℃金属浴孵育。

    4.6孵育结束后将样品置于冰上以终止反应,反应产物加入黑色96孔板用酶
    标仪进行荧光值测定(对于β-分泌酶产物:激发波长λex=430nm,λem=520nm;对
    于γ-分泌酶产物:激发波长λex=355nm,λem=440nm)。

    5.结果

    为了进一步验证受试化合物对于分泌酶活性的影响,本发明人进行了基于分
    泌酶荧光底物的体外酶活实验(图3C),发现不同于分泌酶抑制剂(BACE1抑制剂:
    BSI-IV,γ-分泌酶抑制剂:L-685,458),化合物3α-Akebonoicacid对于BACE1和
    γ-分泌酶活性均无抑制作用。

    实施例6、基于免疫沉淀法筛选治疗阿尔茨海默症的潜在物质

    如实施例1中“2”的方法构建瞬时过表达PS1和BACE1的HEK293T细胞,
    作为筛选试验用的细胞模型。

    建立对照组,即培养瞬时过表达PS1和BACE1的HEK293T细胞,其中不加
    入待筛选的候选物。

    建立测试组,即培养瞬时过表达PS1和BACE1的HEK293T细胞,其中加入
    待筛选的候选物。

    以小分子化合物作为候选物。

    将测试组细胞中PS1和BACE1的相互作用情况与对照组中PS1和BACE1的
    相互作用情况进行比较,如果测试组细胞中PS1和BACE1的相互作用情况在统计
    学上弱于对照组,就表明该候选物是治疗阿尔茨海默症或下调Aβ的潜在物质。

    在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被
    单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本
    领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所
    附权利要求书所限定的范围。







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    减弱 BACE1 PS1 相互作用 物质 制备 治疗 阿尔茨海默症 组合 中的 用途
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