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    重庆时时彩玩的时间: 一种抗猪蓝耳病的中药复方、提取方法、浓度和效果测定.pdf

    关 键 词:
    一种 抗猪蓝耳病 中药 复方 提取 方法 浓度 效果 测定
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    摘要
    申请专利号:

    CN201610046350.0

    申请日:

    2016.01.22

    公开号:

    CN105596446A

    公开日:

    2016.05.25

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):A61K 36/71申请日:20160122|||公开
    IPC分类号: A61K36/71; A61K36/65; A61P31/14; A61P37/04; G01N33/50 主分类号: A61K36/71
    申请人: 佛山科学技术学院
    发明人: 王丙云; 冼琼珍; 刘樱; 陈志胜; 陈胜锋; 计慧琴
    地址: 528000 广东省佛山市禅城区江湾一路18号
    优先权:
    专利代理机构: 广州新诺专利商标事务所有限公司 44100 代理人: 许英伟
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201610046350.0

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2016.06.22|||2016.05.25

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明所述一种抗猪蓝耳病的中药复方、提取方法、浓度和效果测定,包含如下药物及其重量份:青蒿3份、穿心莲2份、板蓝根2份和赤芍1份,提取方法:水浸泡1h,浸泡加水量为中药复方重量4倍,然后再加入中药复方重量4倍的水量,煎煮20-30min,过滤得第一次煮液;再加入中药复方重量的5倍的水量,煎煮20min,过滤得第二次煮液;合并2次煮液,于烧杯中加热蒸煮,定容至20ml,每毫升相当于0.4g生药;置凉,用离心机以转速为3000r/min离心10min,取上层清液存200ml容量瓶中,用NaHCO3溶液调pH值至7.0,经高压灭菌分装于4℃保存备用。本发明具有扶正培本、调整机体阴阳平衡、增强免疫力、清热解毒、活血化瘀和固本解表等功效,能够直接或通过调节机体免疫力影响病毒的复制。

    权利要求书

    1.一种抗猪蓝耳病的中药复方,其特征在于,包含如下药物及其重量份:青
    蒿3份、穿心莲2份、板蓝根2份和赤芍1份。
    2.根据权利要求1所述一种抗猪蓝耳病的中药复方,其特征在于,按照配制
    8克中药复方为标准,包含如下药物及其重量比例:青蒿3克、穿心莲2
    克、板蓝根2克和赤芍1克。
    3.根据权利要求1或2所述一种抗猪蓝耳病的中药复方的提取方法,其特征
    在于,包括以下步骤:
    (1)按青蒿3g、穿心莲2g、板蓝根2g和赤芍1g,称取各中药,组成8g
    中药复方;
    (2)按照步骤(1)的配方称量配方药,水浸泡1h,浸泡加水量为中药复方
    重量的4倍,然后再加入中药复方重量4倍的水量,煎煮20-30min,过滤得第
    一次煮液;再加入中药复方重量的5倍的水量,煎煮20min,过滤得第二次煮液;
    (3)合并2次煮液,于烧杯中加热蒸煮,定容至20ml,每毫升相当于0.4g
    生药;
    (4)置凉,用离心机以转速为3000r/min离心10min,取上层清液存200ml
    容量瓶中,用NaHCO3溶液调pH值至7.0,经高压灭菌分装于4℃保存备用。
    4.根据权利要求1所述一种抗猪蓝耳病的中药复方的浓度测定,其特征在
    于,对Marc-145细胞安全浓度的测定:
    取Marc-145细胞长成单层的96孔培养板,弃原液,PBS洗涤1次,以
    DMEM完全培养液对中药原液作2倍倍比稀释至第10孔,每孔100μL,第
    11、12孔为细胞对照,各稀释度重复4孔,37℃、CO2培养箱培养至72h,每
    天观察细胞的形态变化及生长状况,72h后弃去培养液,以PBS液洗涤1次,
    加入MTT液20μL/孔,37℃继续培养4h后弃MTT液,加入DMSO150μL/
    孔,恒温振荡10min待结晶全部溶解,490nm波长下测定OD值;
    根据公式以OD值计算不同浓度复方中药对细胞的生长抑制率,细胞生长
    抑制率=(细胞对照组OD值﹣药物组OD值)/细胞对照组OD值,并结合CPE
    观察结果来判断复方中药毒性的大小,当生长抑制率为0则表明该中药对细胞
    无毒性作用,结合复方中药的起始浓度,来确定其最大安全浓度。
    5.根据权利要求1所述一种抗猪蓝耳病的中药复方的浓度测定,其特征
    在于,猪蓝耳病病毒的半数毒性浓度(TCID50)的测定:
    将待测病毒按10倍比系列稀释至10-10,按100μL/孔的剂量加入长至单
    层Marc-145细胞的96孔板,最后2列作细胞对照组,各组重复8孔,37℃吸
    附1.5h后弃病毒液,各孔加入DMEM维持液100μL,CO2培养箱37℃培养;
    每天观察细胞病变作用(CPE),72-96h后,以MTT法测定各孔OD值,
    根据下述公式计算:病毒对细胞的生长抑制率=(细胞对照组OD值﹣病毒对
    照组OD值)/细胞对照组OD值,采用Reed-Muench两氏法,计算病毒的半数
    毒性浓度(TCID50),即距离比例=(高于50%的细胞生长抑制率-50%)/(高
    于50%的细胞生长抑制率-低于50%的细胞生长抑制率),Log2TC50=距离比例
    ×稀释度对数之间的差+高于50%细胞生长抑制率的对数。
    6.根据权利要求4所述一种抗猪蓝耳病的中药复方体外抗PRRSV效果的
    测定,其特征在于,以中药复方步骤(4)得到的最大安全浓度为起始浓度,以
    培养液对中药进行2倍稀释,共4个浓度,每浓度重复8孔,PRRSV液稀释度
    为100TCID50,并设细胞对照和病毒对照组,CO2培养箱37℃培养,每天观察细
    胞CPE情况,待细胞培养至72h后,以MTT法测定各孔OD值,根据公式计
    算:中药对感染病毒的Marc-145细胞的?;ぢ剩?药物组OD值-病毒对照组OD
    值)/(细胞对照组OD值-病毒对照组OD值);
    1.加药方式
    采用三种加药方式:
    方式一、复方中药对病毒的阻断作用(先加中药再加病毒)
    在Marc-145细胞长至单层的96孔培养板加入以安全浓度起始的复方中药
    液,100μL/孔,37℃培养4h后弃药液,按100μL/孔量,加入100TCID50PRRSV
    液,37℃培养2h后弃病毒液,每孔加DMEM维持液100μL;
    方式二、复方中药对病毒的抑制作用(先加病毒再加中药)
    在已长满单层Marc-145细胞的96孔板,加入100TCID50PRRSV液,每孔
    100μL,37℃培养2h后弃病毒液,再加入以安全浓度起始的中药复方液,100
    μL/孔,37℃培养4h,弃药液,每孔加DMEM维持液100μL;
    方式三、中药对病毒的直接杀灭作用(中药与病毒同时加入)
    配制以中药安全浓度起始,倍比稀释且含100TCID50病毒液的不同浓度中药
    复方培养液,加入已长满单层细胞的96孔培养板,100μL/孔,37℃培养4h后
    弃药液,每孔加DMEM液100μL;
    2.数据处理及药物评价
    用SPSS19.0软件进行统计分析,先计算各中药不同浓度下的平均OD值
    (以表示),根据公式计算对细胞的?;ぢ?,最后以中药对细胞?;ぢ?br />来评价中药的效果,细胞?;ぢ试酱笤蛩得饕┪锟筆RRSV作用越强。

    说明书

    一种抗猪蓝耳病的中药复方、提取方法、浓度和效果测定

    技术领域

    本发明属于兽用中药领域,涉及一种体外抗猪蓝耳病病毒的中药复方、提取方法、浓度和效果测定。

    背景技术

    猪蓝耳病(亦称猪繁殖与呼吸系统综合征)是由猪繁殖与呼吸系统综合征病毒(PRRSV)引起猪的以繁殖障碍和呼吸道症状为主要特征的一种高度传染性疾病。该病既能垂直传染又能水平传播,能够引起妊娠母猪发热、厌食、流产、早产、木乃伊胎、弱仔及诱发仔猪和育成猪的多种呼吸系统疾病。1996年郭宝清等人确定了其在我国的存在,PRRS具有传播迅速、流行广泛和毒株变异能力强的特点,该病对养猪业造成严重威胁和巨大经济损失,防治主要靠疫苗预防,目前尚无有效药物,其综合防制有很大难度。

    发明内容

    本发明克服了现有技术中的缺点,提供了一种抗猪蓝耳病的中药复方、提取方法、浓度和效果测定,其对猪蓝耳病等病毒性疾病的预防和治疗有较好的作用,而且具有毒副作用少、残留低、资源丰富等优势。

    为了解决上述技术问题,本发明是通过以下技术方案实现的:

    一种抗猪蓝耳病的中药复方,包含如下药物及其重量份:青蒿3份、穿心莲2份、板蓝根2份和赤芍1份。

    进一步,按照配制8克中药复方为标准,包含如下药物及其重量比例:青蒿3克、穿心莲2克、板蓝根2克和赤芍1克。

    一种抗猪蓝耳病的中药复方的提取方法,包括以下步骤:

    (1)按青蒿3g、穿心莲2g、板蓝根2g和赤芍1g,称取各中药,组成8g中药复方;

    (2)按照步骤(1)的配方称量配方药,水浸泡1h,浸泡加水量为中药复方重量的4倍,然后再加入中药复方重量4倍的水量,煎煮20-30min,过滤得第一次煮液;再加入中药复方重量的5倍的水量,煎煮20min,过滤得第二次煮液;

    (4)合并2次煮液,于烧杯中加热蒸煮,定容至20ml,每毫升相当于0.4g生药;

    (4)置凉,用离心机以转速为3000r/min离心10min,取上层清液存200ml容量瓶中,用NaHCO3溶液调pH值至7.0,经高压灭菌分装于4℃保存备用。

    对Marc-145细胞安全浓度的测定:

    取Marc-145细胞长成单层的96孔培养板,弃原液,PBS洗涤1次,以DMEM完全培养液对中药原液作2倍倍比稀释至第10孔,每孔100μL,第11、12孔为细胞对照,各稀释度重复4孔,37℃、CO2培养箱培养至72h,每天观察细胞的形态变化及生长状况,72h后弃去培养液,以PBS液洗涤1次,加入MTT液20μL/孔,37℃继续培养4h后弃MTT液,加入DMSO150μL/孔,恒温振荡10min待结晶全部溶解,490nm波长下测定OD值;

    根据公式以OD值计算不同浓度复方中药对细胞的生长抑制率,细胞生长抑制率=(细胞对照组OD值﹣药物组OD值)/细胞对照组OD值,并结合CPE观察结果来判断复方中药毒性的大小,当生长抑制率为0则表明该中药对细胞无毒性作用,结合复方中药的起始浓度,来确定其最大安全浓度。

    进一步,猪蓝耳病病毒的半数毒性浓度(TCID50)的测定:

    将待测病毒按10倍比系列稀释至10-10,按100μL/孔的剂量加入长至单层Marc-145细胞的96孔板,最后2列作细胞对照组,各组重复8孔,37℃吸附1.5h后弃病毒液,各孔加入DMEM维持液100μL,CO2培养箱37℃培养;

    每天观察细胞病变作用(CPE),72-96h后,以MTT法测定各孔OD值,根据下述公式计算:病毒对细胞的生长抑制率=(细胞对照组OD值﹣病毒对照组OD值)/细胞对照组OD值,采用Reed-Muench两氏法,计算病毒的半数毒性浓度(TCID50),即距离比例=(高于50%的细胞生长抑制率-50%)/(高于50%的细胞生长抑制率-低于50%的细胞生长抑制率),Log2TC50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%细胞生长抑制率的对数。

    进一步,以中药复方步骤(4)得到的最大安全浓度为起始浓度,以培养液对中药进行2倍稀释,共4个浓度,每浓度重复8孔,PRRSV液稀释度为100TCID50,并设细胞对照和病毒对照组,CO2培养箱37℃培养,每天观察细胞CPE情况,待细胞培养至72h后,以MTT法测定各孔OD值,根据公式计算:中药对感染病毒的Marc-145细胞的?;ぢ剩?药物组OD值-病毒对照组OD值)/(细胞对照组OD值-病毒对照组OD值);

    1.加药方式

    采用三种加药方式:

    方式一、复方中药对病毒的阻断作用(先加中药再加病毒)

    在Marc-145细胞长至单层的96孔培养板加入以安全浓度起始的复方中药液,100μL/孔,37℃培养4h后弃药液,按100μL/孔量,加入100TCID50PRRSV液,37℃培养2h后弃病毒液,每孔加DMEM维持液100μL;

    方式二、复方中药对病毒的抑制作用(先加病毒再加中药)

    在已长满单层Marc-145细胞的96孔板,加入100TCID50PRRSV液,每孔100μL,37℃培养2h后弃病毒液,再加入以安全浓度起始的中药复方液,100μL/孔,37℃培养4h,弃药液,每孔加DMEM维持液100μL;

    方式三、中药对病毒的直接杀灭作用(中药与病毒同时加入)

    配制以中药安全浓度起始,倍比稀释且含100TCID50病毒液的不同浓度中药复方培养液,加入已长满单层细胞的96孔培养板,100μL/孔,37℃培养4h后弃药液,每孔加DMEM液100μL;

    2.数据处理及药物评价

    用SPSS19.0软件进行统计分析,先计算各中药不同浓度下的平均OD值(以表示),根据公式计算对细胞的?;ぢ?,最后以中药对细胞?;ぢ世雌兰壑幸┑男Ч?,细胞?;ぢ试酱笤蛩得饕┪锟筆RRSV作用越强

    与现有技术相比,本发明的有益效果是:

    本发明所述一种抗猪蓝耳病的中药复方、提取方法、浓度和效果测定具有扶正培本、调整机体阴阳平衡、增强免疫力、清热解毒、活血化瘀和固本解表等功效,能够直接或通过调节机体免疫力影响病毒的复制。

    具体实施方式

    以下对本发明的优选实施例进行说明,应当理解,此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明,并不用于限定本发明。

    本发明所述一种体外抗猪蓝耳病病毒的中药复方,按照配制8克中药复方为标准,包含如下药物及其重量比例:青蒿3克、穿心莲2克、板蓝根2克和赤芍1克。

    下述实施例中所用实验材料如下:

    (一)细胞与病毒

    细胞:Marc-145细胞,由华南农业大学兽医微生物学与免疫学实验室惠赠,按常规方法传代、培养;猪蓝耳病病毒(PRRSV)由华南农业大学兽医学院惠赠。

    (二)主要试剂

    胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM培养液均为HyClone产品;二甲基亚砜(DMSO)购自GIBICO公司;噻唑蓝(MTT)为SIGMA产品,以无Ca2+、Mg2+的PBS液配制成5mg/mL,过滤除菌分装,-20℃避光保存备用。

    (三)中药的提取

    采用水煎煮方法进行粗提,具体步骤是:

    1.按青蒿2g、穿心莲2g、板蓝根2g和赤芍1g重量份称取各中药,组成8g中药复方;

    (2)按照配方称量配方药,加水浸泡1h,第一次加水量8倍,煎煮20-30min,过滤煮液;第二次加水量5倍,煎煮20min,过滤煮液。

    (3)合并2次煮液,于烧杯中加热蒸煮,定容至20ml,每毫升相当于0.4g生药(即400mg/mL);

    (4)置凉,3000r离心10min,取上层清液存200ml容量瓶中,用NaHCO3溶液调pH值至7.0,静高压灭菌分装于4℃保存备用。

    中药复方对Marc-145细胞安全浓度和猪蓝耳病病毒的半数毒性浓度(TCID50)的测定。

    1.复方中药对Marc-145细胞安全浓度的测定

    取Marc-145细胞长成单层的96孔培养板,弃原液,PBS洗涤1次,以DMEM完全培养液对中药原液作2倍倍比稀释至第10孔,每孔100μL,第11、12孔为细胞对照,各稀释度重复4孔,37℃、CO2培养箱培养至72h,每天观察细胞的形态变化及生长状况。72h后弃去培养液,以PBS液洗涤1次,加入MTT液20μL/孔,37℃继续培养4h后弃MTT液,加入DMSO150μL/孔,恒温振荡10min待结晶全部溶解,490nm波长下测定OD值。

    根据公式以OD值计算不同浓度复方中药对细胞的生长抑制率,细胞生长抑制率=(细胞对照组OD值﹣药物组OD值)/细胞对照组OD值,并结合CPE观察结果来判断复方中药毒性的大小,当生长抑制率为0则表明该中药对细胞无毒性作用,结合复方中药的起始浓度,来确定其最大安全浓度。

    2.猪蓝耳病病毒的半数毒性浓度(TCID50)的测定

    将待测病毒按10倍比系列稀释至10-10,按100μL/孔的剂量加入长至单层Marc-145细胞的96孔板,最后2列作细胞对照组,各组重复8孔,37℃吸附1.5h后弃病毒液,各孔加入DMEM维持液100μL,CO2培养箱37℃培养。

    每天观察细胞病变作用(CPE),72-96h后,以MTT法测定各孔OD值。根据下述公式计算:病毒对细胞的生长抑制率=(细胞对照组OD值﹣病毒对照组OD值)/细胞对照组OD值。采用Reed-Muench两氏法,计算病毒的半数毒性浓度(TCID50),即距离比例=(高于50%的细胞生长抑制率-50%)/(高于50%的细胞生长抑制率-低于50%的细胞生长抑制率)。Log2TC50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%细胞生长抑制率的对数。

    3.数据处理

    用SPSS19.0软件进行统计分析,先计算不同浓度的中药复方的平均OD值(以表示),根据公式计算对细胞的抑制率或?;ぢ?。

    (1)复方中药对细胞的安全浓度

    根据公式以OD值计算不同浓度复方中药对细胞的生长抑制率,并结合CPE观察结果来判断复方中药毒性的大小,当生长抑制率为0则表明该中药对细胞无毒性作用,结合复方中药的起始浓度,来确定其最大安全浓度。

    2.1复方中药对细胞的安全浓度

    根据公式以OD值计算不同浓度复方中药对细胞的生长抑制率,并结合CPE观察结果来判断复方中药毒性的大小,当生长抑制率为0则表明该中药对细胞无毒性作用,结合复方中药的起始浓度,来确定其最大安全浓度(结果见表1)。

    表1复方中药对Marc-145细胞的生长抑制率(%)及安全浓度(mg/mL)

    中药复方的安全浓度为0.781。

    2.2PRRSVTCID50

    不同稀释倍数的病毒对Marc-145细胞的生长抑制率,见表2。根据Reed-Muench两氏法计算距离比例=(70.4-50)/(50-9.7)=0.3355,㏒TCID50=0.336×(-1)+(-4)=-4.336,即PRRSV的TCID50为10-4.336/0.1mL。

    表2PRRSV对Marc-145细胞的生长抑制率%(n=8)

    复方中药体外抗PRRSV效果的测定

    以复方中药最大安全浓度为起始浓度,以培养液对中药进行2倍稀释,共4个浓度,每浓度重复8孔,PRRSV液稀释度为100TCID50,并设细胞对照和病毒对照组。CO2培养箱37℃培养,每天观察细胞CPE情况,待细胞培养至72h后,以MTT法测定各孔OD值。根据公式计算:中药对感染病毒的Marc-145细胞的?;ぢ剩?药物组OD值-病毒对照组OD值)/(细胞对照组OD值-病毒对照组OD值)。

    1.加药方式

    采用三种加药方式:

    方式一、复方中药对病毒的阻断作用(先加中药再加病毒)

    在Marc-145细胞长至单层的96孔培养板加入以安全浓度起始的复方中药液,100μL/孔,37℃培养4h后弃药液,按100μL/孔量,加入100TCID50PRRSV液,37℃培养2h后弃病毒液,每孔加DMEM维持液100μL。

    方式二、复方中药对病毒的抑制作用(先加病毒再加中药)

    在已长满单层Marc-145细胞的96孔板,加入100TCID50PRRSV液,每孔100μL,37℃培养2h后弃病毒液,再加入以安全浓度起始的复方中药液,100μL/孔,37℃培养4h,弃药液,每孔加DMEM维持液100μL。

    方式三、中药对病毒的直接杀灭作用(中药与病毒同时加入)

    配制以中药安全浓度起始,倍比稀释且含100TCID50病毒液的不同浓度复方中药培养液,加入已长满单层细胞的96孔培养板,100μL/孔,37℃培养4h后弃药液,每孔加DMEM液100μL。

    2.数据处理及药物评价

    用SPSS19.0软件进行统计分析,先计算各中药不同浓度下的平均OD值(以表示),根据公式计算对细胞的?;ぢ?,最后以中药对细胞?;ぢ世雌兰壑幸┑男Ч?,细胞?;ぢ试酱笤蛩得饕┪锟筆RRSV作用越强。

    2.3复方中药抗PRRSV的三种作用方式药效

    表3复方中药体外抗PRRSV三种作用方式的细胞?;ぢ?%)

    从表3可以看出,中药复方抑制作用方式的细胞?;ぢ士纱?00%,表明中药复方可明显抑制病毒的繁殖,中药复方对病毒具有较好的阻断作用和直接杀灭作用。

    最后应说明的是:以上仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换,但是凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的?;し段е?。

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