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    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201610055313.6

    申请日:

    2010.11.09

    公开号:

    CN105602889A

    公开日:

    2016.05.25

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):C12N 5/071申请日:20101109|||公开
    IPC分类号: C12N5/071(2010.01)I; C12N5/079(2010.01)I; C12N5/0797(2010.01)I; C07K16/18; G01N33/569; A61K35/30(2015.01)I; A61P25/28; A61P25/00 主分类号: C12N5/071
    申请人: Q医疗公司
    发明人: 罗伯特·桑德罗克; 詹姆斯·T·坎帕内利; 德波拉·A·埃普斯泰因
    地址: 美国犹他州
    优先权: 2009.11.12 US 61/260,441; 2010.04.22 US 61/326,799
    专利代理机构: 中原信达知识产权代理有限责任公司 11219 代理人: 杨青;缑正煜
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201610055313.6

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2016.06.22|||2016.05.25

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明涉及用于哺乳动物来源的神经胶质限制性祖细胞的扩增、鉴定、表征和效能增强的方法和组合物。具体而言,本发明提供了用于产生人源神经胶质限制性祖细胞(GRP)群的方法,所述细胞群具有减少的可能不想要或不期望的细胞表型和/或降低的群细胞中的标准偏差。本发明还提供了用于表征GRP的抗体组和基因表达谱及其在表征GRP细胞中的应用方法。此外,本发明提供了用于使用这些GRP细胞产生星形细胞和/或少突神经胶质细胞、使神经元重新形成髓鞘、以及治疗神经胶质细胞相关的和其它神经变性疾病或障碍或神经系统的损伤或损坏的方法。本发明还提供了A2B5阳性细胞缺失的神经细胞的制造方法。

    权利要求书

    1.一种用于减少GRP细胞群中可能不想要的细胞表型和/或降低GRP细胞群细胞中的标
    准偏差的方法,所述方法包括:
    (a)从能够产生A2B5阳性细胞的哺乳动物组织源中分离A2B5阳性细胞,以及
    (b)A2B5阳性细胞在基质上体外培养的天数(DIV)大于6天。
    2.权利要求1的方法,其还包括将收获的细胞冷冻和融化。
    3.一种用于减少GRP细胞群中可能不想要的细胞表型和/或降低GRP细胞群细胞中的标
    准偏差的方法,所述方法包括:
    (a)将哺乳动物神经组织解离成细胞悬液;
    (b)分离A2B5阳性细胞;
    (c)A2B5阳性细胞在基质上体外培养的天数(DIV)大于6天;以及
    (d)收获培养的细胞。
    4.权利要求3的方法,其还包括将收获的细胞冷冻和融化。
    5.一种用于减少GRP细胞群中可能不想要的细胞表型的方法,所述方法包括将GRP细胞
    群冷冻和融化。
    6.权利要求5的方法,其中将GRP细胞群在冷冻之前培养6DIV或小于6DIV。
    7.权利要求5的方法,其还包括将融化的GRP细胞群另外体外培养的天数(DIV)为3天以
    上。
    8.权利要求6的方法,其还包括将融化的GRP细胞群另外体外培养的天数(DIV)为3天以
    上。
    9.一种用于制造A2B5阳性细胞缺失的哺乳动物神经细胞的方法,所述方法包括:
    (a)从能够产生A2B5阳性细胞的哺乳动物组织源中分离A2B5阳性细胞;以及
    (b)收集在去除A2B5阳性细胞后剩余的细胞。
    10.权利要求9的方法,其中细胞在基质上体外培养的天数(DIV)为1天以上。
    11.权利要求9的方法,其中细胞通过冷冻和融化细胞群来进一步缺失某些细胞类型。
    12.权利要求9的方法,其中A2B5阳性细胞使用磁性活化细胞分选来分离。
    13.权利要求12的方法,其中将细胞两次以上通过包含磁珠的柱,以分离A2B5阳性细
    胞。
    14.权利要求9的方法,其中A2B5阳性细胞使用荧光活化细胞分选或免疫淘选来分离。
    15.权利要求14的方法,其中将细胞两次以上通过荧光活化细胞分选或免疫淘选皿。
    16.一种用于表征GRP细胞的抗体组,所述抗体组包含针对A2B5、GFAP的抗体,和选自
    Olig1、Olig2、O1、PDGFR-α、巢蛋白、NG2、PSA-NCAM、TuJ1、Ki-67和NeuN的一种或多种抗体。
    17.一种用于将细胞鉴定或表征为GRP细胞的方法,所述方法包括用权利要求16的抗体
    组对细胞群进行免疫表型分型,其中大多数细胞对A2B5,以及GFAP、巢蛋白、NG2、PDGFR-α、
    Olig1、Olig2和O1中的一种或多种为阳性,并且大多数细胞对PSA-NCAM、TUJ1、PECAM、CD68
    和NeuN中的一种或多种为阴性。
    18.哺乳动物GRP细胞在制备药物中的应用,所述药物用于在患有与神经元脱髓鞘相关
    的疾病、障碍、损伤或损坏的哺乳动物中增加神经元的髓鞘重新形成,其中所述哺乳动物
    GRP细胞通过包含如下步骤的方法制造:
    (a)仅仅通过选择A2B5阳性细胞从哺乳动物神经组织分离A2B5阳性细胞;
    (b)A2B5阳性细胞在基质上体外培养的天数(DIV)大于6天;以及
    (c)收获培养的细胞;
    或者通过包含如下步骤的方法制造:
    (a)将哺乳动物神经组织解离成细胞悬液;
    (b)仅仅通过选择A2B5阳性细胞来分离A2B5阳性细胞;
    (c)A2B5阳性细胞在基质上体外培养的天数(DIV)大于6天;以及
    (d)收获培养的细胞。
    19.哺乳动物GRP细胞在制备药物中的应用,所述药物用于在哺乳动物中治疗神经变性
    疾病或障碍或神经系统或其一部分的损伤或损坏,其中所述哺乳动物GRP细胞通过权利要
    求18中描述的方法制造。

    说明书

    用于哺乳动物来源的神经胶质限制性祖细胞的扩增、鉴定、表征和效能增强的方法和组合物

    本申请为国际申请日2010年11月9日、国际申请号PCT/US2010/055956于2012年5
    月11日进入中国国家阶段、申请号201080051269.2、发明名称“用于哺乳动物来源的神经胶
    质限制性祖细胞的扩增、鉴定、表征和效能增强的方法和组合物”的分案申请。

    本专利申请要求2010年4月22日提交的序列号为61/326,799的美国临时申请和
    2009年11月12日提交的序列号为61/260,441的美国临时申请的优先权益,所述每个临时申
    请的教导内容在此以其全文引为参考。

    技术领域

    本发明提供了用于制造哺乳动物来源的神经胶质限制性祖细胞(GRP)群的方法,
    以及使用这些细胞的方法,所述细胞群具有减少的可能不想要的细胞表型和/或降低的群
    细胞中的标准偏差。在本发明中还提供了用于表征GRP的抗体组及其在表征GRP细胞中的使
    用方法。

    背景技术

    神经胶质限制性祖细胞(GRP)由它们与抗体A2B5的反应性来确定,所述抗体识别
    c-系列神经节苷脂亚组(Dietrich等,Glia200240:65-77;Rao和Mayer-Proschel,
    Dev.Biol.1997188:48-63;Saito等,J.Neurochem.200178:64-74;Windrem等,
    Nat.Med.200410:93-97)。GRP的其它抗原性特征包括星形细胞标志物胶质原纤维酸性蛋
    白(GFAP)的中度表达和神经元标志物E-CAM(多唾液酸化N-CAM或PSA-NCAM)和β-III微管蛋
    白(TuJ1)的低表达(Dietrich等,Glia200240:65-77;Rao和Mayer-Proschel,
    Dev.Biol.1997188:48-63)。

    在GRP被分离时,它们已经内源性分化至超出神经干细胞的范围,成为定型的谱系
    限制性细胞。尚未观察到GRP诱导或产生畸胎瘤。

    脑和脊髓中非常重要的一类神经元包括那些轴突被包裹在髓磷脂中的神经元。当
    该髓鞘受损时,其生命过程构成神经元轴突周围的绝缘性髓磷脂层的少突神经胶质细胞被
    破坏。脱髓鞘的神经元不能正确传导信号,并最终将死亡。

    当损坏不完全时,内源性修复机制被激活,引起髓鞘重新形成和功能部分或完全
    恢复(Lassmann等,Mult.Scler.19973:133-136;Prineas和Connell,Ann.Neurol.1979
    5:22-31)。这证实了髓鞘重新形成确实能导致功能恢复这一关键点。然而,由于各种疾病或
    创伤而发生脱髓鞘的大多数患者不发生足够的内源性重新形成髓鞘(Prineas等,
    Ann.Neurol.199333:137-151),并且尽管存在大量需求和努力,但在开发能够帮助恢复丧
    失的功能的产品方面几乎没有获得进展。这可以部分归因于为了在体内实现受损的产髓磷
    脂少突神经胶质细胞的再生,必须存在大量信号和复杂的细胞间相互作用。重要的是,在脱
    髓鞘的动物模型中,引起髓鞘重新形成的细胞疗法已被证明是有益的。

    Totoiu等(Exp.Neurol.2004187:254-265)报道了在病毒诱导的鼠MS模型中鼠
    GRP的局部移植物在治疗脊髓病变中的益处。GRP迁移并分化成少突神经胶质细胞,引起看
    起来与轴突保留相关的髓鞘重新形成。他们也观察到运动的改善。后续研究(Hardison等,
    Exp.Neurol.2006197:420-429)证实了鼠GRP能够在炎性T细胞和巨噬细胞两者存在下存
    活并重新形成髓鞘。

    由于髓磷脂碱性蛋白编码基因突变而表现出正常髓磷脂产生缺陷的战栗小鼠
    (shiverermouce)是用于研究外源性细胞移植物对髓磷脂产生的影响的模型。通过战栗小
    鼠中的细胞移植,证实了髓磷脂产生与许多脱髓鞘疾病包括TM和MS以及髓鞘形成障碍相
    关。已显示,人GRP在围产期异种移植后能在战栗小鼠脑中广泛并高效地形成髓鞘(Windrem
    等,Nat.Med.200410:93-97)。证实了分化成区域适合的细胞类型(星形细胞和少突神经胶
    质细胞),并且没有肿瘤的迹象。对这些研究进行了扩展以显示脑和脊髓两者的髓鞘重新形
    成,其在部分移植动物中伴有显著的表型援救(Windrem等,CellStemCell20082:553-
    565)。

    发明内容

    本发明的一个方面涉及用于制造哺乳动物神经胶质限制性祖细胞(GRP)的方法。

    本发明的另一方面涉及用于减少GRP细胞群中的不想要的细胞表型和/或降低GRP
    细胞群细胞中的标准偏差的方法。

    本发明的另一方面涉及用于表征GRP细胞的抗体组,以及使用该抗体组将细胞表
    征为GRP细胞的方法,所述抗体组包含针对c系列神经节苷脂(使用A2B5抗体)、GFAP的抗体
    以及选自Olig1、Olig2、O1、PDGFR-α、巢蛋白(nestin)、NG2、PSA-NCAM、TuJ1、Ki-67和NeuN的
    一种或多种抗体。

    本发明的另一方面涉及可用于表征GRP细胞的基因表达谱。

    本发明的另一方面涉及用于制造A2B5阳性细胞缺失的哺乳动物神经细胞的方法。

    本发明的另一方面涉及用于使用这些制造的哺乳动物GRP细胞产生星形细胞和/
    或少突神经胶质细胞的方法。

    本发明的另一方面涉及用于使用这些制造的哺乳动物GRP细胞在患有与神经元脱
    髓鞘相关的疾病、障碍、损伤和损坏的哺乳动物中增加神经元的髓鞘重新形成的方法。

    本发明的另一方面涉及用于使用这些制造的哺乳动物GRP细胞减少神经胶质瘢痕
    形成的方法。

    本发明的又一方面涉及用于在哺乳动物中使用这些制造的哺乳动物GRP细胞治疗
    神经变性疾病或障碍或神经系统或其一部分的损坏或损伤的方法。

    附图说明

    图1A、1B和1C显示了按照本发明制造的三个独立细胞制备物的试验规模生长曲
    线。

    图2A和2B显示了按照本发明制造的细胞的生产规模生长曲线。

    图3A和3B显示了细胞在悬液与聚L-鸟氨酸处理的表面上的存活率(图3B)以及在
    每次传代和最终收获时的存活率(图3A)的比较。

    具体实施方式

    本发明提供了用于制造哺乳动物神经胶质祖细胞(GRP)的方法。在文献中,GRP也
    被称为神经胶质限制性前体细胞或神经胶质祖细胞。

    本发明的哺乳动物GRP细胞可以源自于能够产生A2B5阳性细胞的任何哺乳动物组
    织源。这样的哺乳动物组织源的实例包括但不限于胚胎/胎儿和成体(包括出生后的所有年
    龄)源,其全都来自于包括但不限于神经、脑、脊髓、视神经、嗅上皮、内分泌腺、皮肤、肌肉、
    脂肪、结缔组织、胎盘、脐带血、血液、骨髓、骨、胚胎干细胞和诱导的多能细胞的组织。所谓
    能够产生A2B5阳性细胞,它指的是包括分化成A2B5阳性细胞的哺乳动物组织源、去分化成
    A2B5阳性细胞的哺乳动物组织源、以及去分化然后分化成A2B5阳性细胞的哺乳动物组织
    源。

    根据本发明,哺乳动物神经胶质限制性祖细胞(GRP)通过从能够产生A2B5阳性细
    胞的哺乳动物组织源中分离A2B5抗体反应性细胞来制造。然后将A2B5阳性细胞在基质上体
    外培养大于6天(DIV)。然后收获培养的细胞。

    在本发明的一个实施方案中,所述方法包括将哺乳动物神经组织例如但不限于胎
    儿尸体前脑组织、胎儿尸体脊髓组织、哺乳动物脑或脊髓活检组织等解离成细胞悬液。在一
    个实施方案中,哺乳动物神经组织在神经管闭合后获得。对于人GRP来说,神经组织在例如
    妊娠约14至约24周时神经管闭合后获得,此时,组织被证实产生一致的产物。按照已知方法
    通过酶法、机械法或酶法与机械法两者进行解离。

    A2B5抗体反应性细胞能通过本技术领域的专业人员已知的各种手段来分离。例
    如,在一个实施方案中,使用磁性活化细胞分选来分离A2B5抗体反应性细胞。例如,使用
    Miltenyi磁珠技术或Dynal磁珠技术或其它已知的适合的抗体分离技术,将细胞在单一
    A2B5抗体标记后的柱上通过??裳〉?,可以使用荧光活化细胞分选或免疫淘选通过标准方
    法来捕获抗体阳性细胞。柱(或FACS或免疫淘选皿)富集A2B5(+)细胞并减少A2B5(-)细胞。
    通过另外的一个或多个柱(或另外的FACS或一个或多个免疫淘选皿)有效减少了中度阳性
    细胞并富集高度阳性细胞。

    然后将A2B5阳性群在体外培养的天数(DIV)大于6天,例如约10-20DIV、15-20DIV、
    至少20DIV和/或长达100DIV以上或至少两次传代,并将培养的细胞收获并冷冻。

    这种制造方法与以前描述的制造方法的区别在于使用了用单一抗体分选所需细
    胞的方法,并且生长从没有传代的6DIV延长到生长长达两次传代或大于6DIV,例如约10-
    20DIV、15-20DIV、至少20DIV或长达100DIV以上。此外,细胞不是在悬液中而是在用于细胞
    附着的基质上生长。

    基质的实例包括但不限于聚L-鸟氨酸、聚L-赖氨酸、和重组或天然的细胞外基质
    分子或其片段,例如但不限于层粘连蛋白、纤粘连蛋白和CELLstartTM(用于附着和扩增人胚
    胎、间充质、和神经干细胞的无异种物质的基质,InvitrogenCorporation,Carlsbad,CA)。

    按照本发明方法制造的细胞的生长曲线、产率和免疫学确定的表型表现出收紧的
    变异性和减少的不想要的细胞表型,而不改变它们的治疗能力。

    在第一次传代之前(6-DIV)、在第二次传代结束(20-DIV;收获)时、和在体外长达
    100天时,相差显微术显示出稳定的形态学表型。对于三种独立的细胞制备物,这种双极至
    多极的形态在制备物之间是一致的。

    按照本发明制造的细胞的试验规模生长曲线显示在图1A至1C中。三种独立的细胞
    制备物分别显示在图1A、1B和1C中,其是在未处理的塑料(“悬液”)上生长和在聚L-鸟氨酸
    处理的组织培养塑料上生长的比较。在基质包被瓶上生长的细胞制备物表现出增加的斜率
    和增加的铺板效率。

    生产规模的生长曲线显示在图2A和2B中。这些曲线与试验规模相似,并证实了在
    20-DIV时收获的细胞未接近衰老。

    通过台盼蓝排除法评估细胞存活率。在悬液与聚L-鸟氨酸处理的表面上存活率的
    比较显示在图3B中,而每次传代和最终收获时的存活率显示在图3A中。在所有情况下,存活
    率平均值超过90%。

    使用识别所期望的表型(神经胶质限制性祖细胞及其后代)以及可能污染的不想
    要的细胞表型(神经元祖细胞、神经元、小神经胶质细胞和内皮细胞)的抗体组,对按照本发
    明制造的细胞进行免疫表型分型。该组中的抗体选自A2B5、GFAP、PDGFR-α、Olig1、Olig2、
    O1、巢蛋白、NG2、PSA-NCAM、TuJ1、Ki-67和/或NeuN。使用该独特抗体组的免疫表型分型显
    示,大于6-DIV时的可能不想要的细胞表型(PSA-NCAM和TuJ1)比6-DIV时减少,并且按照本
    发明方法产生的细胞中的标准偏差降低。

    因此,本发明的另一方面涉及用于减少GRP细胞群中可能不想要的细胞表型和/或
    降低GRP细胞群细胞中的标准偏差的方法,所述方法包括收获大于6-DIV的细胞。通过与在
    6-DIV时收获的细胞进行比较,确定了可能不想要的细胞表型的减少和/或细胞中标准偏差
    的降低。

    还已发现,GRP细胞群的冷冻和融化进一步减少了不想要的表型。在冷冻/融化后,
    所期望的A2B5、GFAP和Ki-67阳性表型得以保留,而不想要的细胞表型(PSA-NCAM和TuJ1)的
    标志物减少大于50%。

    因此,本发明的另一方面涉及用于减少GRP细胞群中可能不想要的细胞表型的方
    法,所述方法包括冷冻和融化GRP细胞群。

    在一个实施方案中,按照本发明制造GRP细胞群,并将其在收获后进一步冷冻和融
    化。

    然而,正如专业技术人员在阅读本公开后将会理解的,可以使用用于制造冷冻前
    GRP的可选方法。例如,在一个实施方案中,通过将A2B5阳性细胞培养6DIV或小于6DIV的方
    法来制造GRP细胞群。然后将培养的细胞收获并冷冻。在融化后,将细胞另外体外培养的天
    数(DIV)为3天以上,以增加细胞数量。

    此外,使用该选定的抗体组的免疫表型分型为表征该细胞治疗剂提供了有用的可
    靠手段。因此,本发明的另一方面涉及用于表征GRP细胞的这种抗体组,以及用于使用该抗
    体组将细胞表征为GRP细胞和/或证明细胞群纯度的方法,所述抗体组包含A2B5、GFAP和选
    自Olig1、Olig2、O1、PDGFR-α、巢蛋白、NG2、PSA-NCAM、TuJ1、Ki-67和NeuN的一种或多种抗
    体。在一个实施方案中,使用抗体组表征细胞是通过首先按照标准流程将细胞铺在盖玻片
    上或多室载片等中,允许其在标准的组织培养条件下生长过夜,然后按照标准程序进行固
    定和染色。使用标准的显微术方法鉴定免疫阳性细胞,并确定对每种抗体阳性的细胞相对
    于细胞总数的百分数(通过泛核染色:DAPI等来确定)。下列使用该抗体组的免疫表型指示
    了是GRP的哺乳动物细胞群:大多数细胞对A2B5以及GFAP、巢蛋白、NG2、PDGFR-α、Olig1、
    Olig2和O1中的一种或多种为阳性,并且大多数细胞对PSA-NCA、TUJ1、PECA、CD68和NeuN中
    的一种或多种为阴性。当在本文中使用时,所谓“大多数”指的是大于50%的细胞对所选抗
    体为阳性或阴性。

    除了细胞产物的免疫细胞化学表征之外,还鉴定了其表达与细胞分离物中可能存
    在的不同细胞类型相关的基因靶。从未纯化的细胞、源自于15个脑组织的在6-DIV时收获的
    GRP细胞和按照本发明的方法产生的GRP细胞中收集基因表达数据。在6-DIV时收获的GRP细
    胞与未纯化的细胞之间,约375个基因显示出至少5倍的表达水平变化(水平增加和降低),
    其P值<0.01。使用这些数据,通过例如芯片/阵列分析、多重RT-PCR和qPCR技术作为鉴定细
    胞群的手段,可以产生并评估基因表达谱。

    在本发明中还提供了用于制造A2B5阳性细胞缺失的哺乳动物神经细胞的方法。在
    该方法中,从能够产生A2B5阳性细胞的哺乳动物组织源中分离A2B5抗体反应性细胞。然后
    收集在去除A2B5抗体反应性细胞后剩余的细胞。在该方法的一个实施方案中,将细胞在基
    质上体外培养的天数(DIV)为1天以上。在该方法中,可以通过细胞群的冷冻和融化将收集
    到的细胞任选进一步缺失某些细胞类型。

    本发明的另一方面涉及用于从按照本发明制造的GRP中产生星形细胞和/或少突
    神经胶质细胞的方法。在该方法中,将按照本发明制造的GRP细胞在促进向星形细胞和/或
    少突神经胶质细胞分化的条件下进行培养。在一个实施方案中,将GRP细胞在促进向星形细
    胞分化的条件下进行培养。促进星形细胞分化的培养基配方的两个非限制性实例包括:1)
    GRP在DMEM/F12、N1或N2增补物、碱性FGF、BMP4中生长,这些生长因子在ng/mL范围或10-
    100ng/mL范围内存在;以及2)在ng/mL范围或10-100ng/mL范围内的DMEM/F12、N1或N2增补
    物、1-10%FBS和碱性FGF。在另一个实施方案中,将GRP细胞在促进向少突神经胶质细胞分
    化的条件下进行培养。促进少突神经胶质细胞分化的培养基配方和条件的两个非限制性实
    例包括:1)GRP在缺少生长因子的DMEM/F12培养基中生长两天,并将细胞转移到增补有在
    ng/mL范围或10-100ng/mL范围内存在的N2、PDGF-AA和在1-100nM范围内的T3的DMEM/F12培
    养基;以及2)GRP生长在增补有在几百nM范围内的N2、T3、在几十μg/mL范围内的N-乙酰半胱
    氨酸和在ng/mL范围或10-100ng/mL范围内的PDGF-AA和CNTF的DMEM/F12培养基中。

    进行了实验并证实,按照本发明方法制备的GRP表现出所选抗原的确定的和可重
    复的表达参数,并且它们在体内环境下分化成星形细胞和少突神经胶质细胞而不是神经元
    的能力也是一致的。此外,实验显示,这些GRP在动物模型中显示出细胞存活、迁移以及分化
    成产髓磷脂的少突神经胶质细胞和星形细胞的特征。这些研究一起证实了,按照本发明方
    法制造的GRP成功地整合、分化成少突神经胶质细胞和星形细胞,并使脑和脊髓的脱髓鞘神
    经组织中的轴突重新形成髓鞘。

    因此,本发明还涉及用于使用按照本发明制造的GRP细胞在哺乳动物体内产生星
    形细胞和少突神经胶质细胞并在患有与神经元脱髓鞘相关的疾病、障碍、损伤或损坏的哺
    乳动物中增加神经元的髓鞘重新形成的方法。使用本技术领域的专业神经外科医生熟悉的
    导管或针,通过包含一次或多次注射的直接实质移植,可以施用在1万和1亿之间的细胞。这
    些移植可以在通过使用颅穿洞术或椎板切除术直接接近神经组织后执行??裳〉?,可以由
    本技术领域的专业介入放射科医生,通过CT引导的经皮递送方法不需直接目测接近神经靶
    组织而将移植物导入脊髓中。此外,可以通过例如腰椎穿刺术或其它适合的方法将细胞施
    用到脑脊液(CSF)而不是直接施用到实质。对于某些疾病来说,施用细胞也可以通过静脉内
    施用。最后,对于这些疾病,使用其它神经细胞类型的几个临床试验目前正在进行之中。在
    这些使用其它神经细胞的临床试验中所使用的类似流程和程序可以由本技术领域的专业
    人员通过常规改造以用于按照本发明制造的GRP。

    证实了根据本发明制造的人GRP在异种移植到体内神经胶质行为模型战栗小鼠
    (Nave,J.Neurosci,Res.199438:607-612)的脑中时的存活、迁移、增殖和分化。战栗小鼠
    具有常染色体隐性突变,所述突变导致这些小鼠不能产生髓磷脂碱性蛋白(BP)。战栗小鼠
    CNS中所形成的内源性少突神经胶质细胞不能装配起密实的髓磷脂(Privat等,
    Neurosci.Lett.197912:107-112)。为了使移植存活率最大化,开发了一种战栗小鼠品系,
    所述小鼠品系还携带了产生成熟的B和T淋巴细胞所必需的蛋白的编码基因Rag2的常染色
    体隐性突变,并因此表现出细胞介导的免疫缺陷(Shinkai等,Cell199268:855-867)。在
    靶向室下区的单一位点处,向新生的双纯合战栗/rag免疫缺陷小鼠移植100,000个人GRP。
    在移植后8或12周,将动物处死,并通过免疫细胞化学评估人GRP及其后代的存活和分布。人
    细胞的广泛分布证明了人GRP在该遗传免疫缺损模型中存活和迁移的能力。使用6DIV和
    20DIVGRP两者,在战栗/rag2小鼠中观察到了类似的体内存活、迁移和分化结果。

    在来自这些小鼠的脑切片中,通过免疫细胞化学方法评估了人GRP的体内分化潜
    力。一组小鼠在移植后第8周处死,而另一组出于人道原因在神经退化导致显著的行动受损
    和频繁的持续抽搐发作时(典型为出生后12至18周)处死。将脑切片用抗髓磷脂碱性蛋白
    (MBP;在战栗小鼠中没有观察到由该抗体识别的完整MBP的表达,因此MBP表达只来自于移
    植的人GRP)和抗人GFAP抗体(其不识别鼠GFAP)染色。尽管不能对星形细胞和少突神经胶质
    细胞的数量进行定量,但是通过在处死后测量MBP和GFAP体内免疫反应性的面积,证实从人
    GRP产生了这两种细胞类型。这些数据详细描述了本发明的人GRP分化成适合的细胞表型的
    能力。

    使用针对在大多数神经元中表达的蛋白NeuN以及人核抗原(HuNA)的抗体,还执行
    了脑切片的双重染色。这些数据从用于确定MBP和GFAP表达的相同动物收集。在8周时处死
    的动物中,人GRP集中在胼胝体附近,并观察到小于0.3%的HuNA/NeuN双阳性细胞。这些细
    胞分化成神经胶质而不是神经元的能力与在神经变性疾病中的应用有关,在所述神经变性
    疾病中,当使用神经干细胞(其产生神经元和神经胶质两者)作为细胞疗法时,报道了伴有
    痛觉异常样过敏的异常轴突萌生(Hofstetter等,Nat.Neurosci.20058:346-353;Macias
    等,Exp.Neurol.2006201:335-348)。

    还在大鼠中评估了人GRP在脊髓内施用后的细胞存活和分布。将1μL体积中的6万
    (60,000)个人GRP移植到处于C-4水平的12只无胸腺大鼠的脊髓中。在三个时间点(移植后
    1、4和12周)的每个时间点处死4只动物。在处死时将动物用聚甲醛灌注,收获它们的脊髓,
    并使用横切片的HuNA抗体染色分析1-cm颈髓中人GRP的存在。在用人细胞移植的无胸腺大
    鼠的脊髓中,在移植后1、4和12周后没有检测到增殖性团块。在4和12周时间点时观察到移
    植的人细胞的存活。人GRP存在于脊髓的整个横截面上,在执行注射的背柱中观察到最大的
    细胞密度。在移植后1周时的4只动物中的1只以及在移植后4和12周时的4只动物中的4只,
    在尸检后有人GRP存在。在4周时,所分析的约2/3的切片具有人GRP(0.63-cm的头尾向范
    围);并且在12周时,所分析的所有切片具有人GRP(1-cm的头尾向范围)。

    确定了按照本发明方法制备的人GRP在使用两种不同细胞剂量脊髓内施用后的细
    胞存活和分布。在移植后28天,通过肉眼尸检没有检测到脊髓异常。使用HuNA和Ki-67抗体
    进行的免疫细胞化学分析揭示,在800,000或1,200,000个总人GRP/动物的任一剂量下,在
    无胸腺大鼠的脊髓中没有增殖性团块。人GRP存在于脊髓的整个横截面上,在执行注射的背
    柱中观察到最大的细胞密度。在用800,000个总细胞注射的动物中,HuNA/Ki-67的共定位非
    常低,并且在所分析的整个1-cm脊髓区段上,在所有用HuNA抗体染色的切片中检测到人
    GRP。在用1,200,000个总细胞注射的大鼠的脊髓中,人GRP细胞密度太高而不能人工计数;
    然而,HuNA/Ki-67共定位的目测评估与在低剂量动物中观察到的相似。

    已建立了用于在Lewis大鼠的脊髓上诱导局灶性炎性脱髓鞘病损的条件。该动物
    模型模拟人类中的横贯性脊髓炎的病理,并被用于确定移植的按照本发明产生的人GRP在
    诱导的局灶性脱髓鞘病损附近存活的能力。该大鼠模型基于已发表的模型
    (Kerschensteiner等,Am.J.Pathol.2004164:1455-1469),并对其进行改良以更可靠地诱
    导局灶性炎性脱髓鞘的临床和组织学迹象。用悬浮在弗氏不完全佐剂中的髓磷脂少突神经
    胶质细胞糖蛋白(MOG)免疫接种成年Lewis大鼠,在10天后,进行T9椎板切除术并注射肿瘤
    坏死因子α、白介素6、干扰素α和溴化乙锭(EtBr)的混合物。在混合物注射后4天,在Lewis大
    鼠背柱中观察到局灶性炎症。在细胞因子和EtBr注射后10-14天,活动性炎症得到极大的缓
    解;然而,该区域广泛的脱髓鞘持续存在。在移植后3、8和14周时检测到移植入该区域中的
    人GRP,头尾向范围长达13mm,表明它们能够在脱髓鞘的病损中存活。

    还评估了按照本发明产生的人GRP在模拟多发性硬化症的炎性环境中的存活。将
    DarkAgouti雌性大鼠(体重150-175克)在尾基处用不完全弗氏佐剂中的10-mgMOG注射。
    大鼠在免疫接种后10-12天时发生临床疾病(EAE分值为2.5-3.0;后肢轻瘫)。从移植人GRP
    细胞的前两天开始,并且在此后每天用10-mg/kg的环孢素AIP注射大鼠。在胸位(T8-T9)处
    执行椎板切除术,并且每只动物接受单次注射,将2-μL盐水中的约150,000个人GRP注射到
    背柱中。动物在出现疾病症状后第2或7天用人GRP移植。在移植后1周、2周和4周时处死动
    物。使用HuNA抗体在靠近移植位点的脊髓的40-μm横切片中检测到移植的人GRP细胞。使用
    OX42抗体检测在炎性应答期间出现的宿主激活的小神经胶质细胞表面上的CD11b。使用苏
    木精和曙红(H&E)染色来确定巨噬细胞和小神经胶质细胞浸润。在移植后1周时,HuNA染色
    紧密定位于使用OX42的免疫染色。注射位点周围的显著H&E染色也表明宿主的巨噬细胞和
    小神经胶质细胞浸润。到移植后2周时,不再观察到HuNA与OX42染色的共定位,但仍能观察
    到H&E染色,尽管不太显著。在疾病发生后2天和7天时注射后,移植的人GRP均能在DA/EAE大
    鼠脊髓中存活长达12周,即所评估的最长时间点。因此,人GRP能够在模拟在人类多发性硬
    化症的炎性病损中存在的条件的条件下存活。

    本文中证实的按照本发明制造的GRP细胞在神经胶质细胞相关的神经变性疾病或
    障碍的多种动物模型中的功效,表明它们在治疗或减轻这些神经变性疾病或障碍的症状中
    的效用。已显示,神经胶质细胞在神经变性疾病肌萎缩性侧索硬化(ALS)的发病机理中发挥
    重要作用(Howland等,PNAS99,1105,1995;Clement等,Science302,113,2003;Rothstein
    等,Ann.Neurol.38,73,1995)。星形细胞在CNS中发挥重要功能,包括脑血管的调控、突触传
    递的调节(例如谷氨酸转运)以及其它效应,包括释放生长因子和为神经元以及神经胶质提
    供营养支持。神经胶质细胞也可以降低或阻止在许多神经变性疾病中引起有害效应的反应
    性星形细胞的形成,并且神经胶质细胞可以降低例如在脊髓损伤和几种神经变性疾病中发
    生的神经胶质瘢痕形成的水平。此外已证实,将随后分化成星形细胞的正常神经胶质细胞
    移植到ALS大鼠模型中,在这种模型中具有神经?;ば?Lepore等,NatureMed.11,1294,
    2008)。这些数据表明了神经胶质祖细胞在模型神经变性疾病中的治疗益处,并且其它研究
    表明,神经胶质祖细胞疗法在其它神经变性疾病或障碍中是有益的,所述其它神经变性疾
    病或障碍包括但不限于帕金森氏症、阿兹海默氏病、亨廷顿舞蹈症和亚历山大病
    (Maragakis和Rothstein,NatureClinicalPracticeNeurology2,679,2006)、多发性硬
    化症(Windrem等,CellStemCell.2008Jun5;2(6):553-65;Hardison等,Exp
    Neurol.2006Feb;197(2):420-9)、其它脱髓鞘疾病(Duncan,JInheritMetabDis.2005;
    28(3):357-68)和脊髓损伤(Keirstead等,JNeurosci.2005May11;25(19):4694-705;
    Mitsui等,JNeurosci.2005Oct19;25(2):9624-36)。

    因此,本发明的另一方面涉及用于使用按照本发明制造的哺乳动物GRP细胞在哺
    乳动物中治疗神经胶质细胞相关的神经变性疾病或障碍以及神经系统或其一部分的损伤
    或损坏的方法。所谓损伤或损坏,它指的是包括由任何原因引起的损坏或损伤,包括但不限
    于创伤、药物、辐射和免疫介导的损坏或损伤。此外,据预期,通过提供产生相关生长因子等
    的健康神经胶质细胞,本发明的细胞将可用于治疗哺乳动物中的不涉及具体神经胶质细胞
    的神经变性疾病或障碍以及神经系统的损伤。在这些治疗方法中,可以使用本技术领域的
    专业神经外科医生熟悉的导管或针,通过直接实质移植施用在1百万和1亿个之间的按照本
    发明制造的细胞。这些移植可以在通过使用颅穿洞术或椎板切除术直接接近神经组织后执
    行??裳〉?,可以由本技术领域的专业介入放射科医生,通过CT引导的经皮递送方法不需直
    接目测接近神经靶组织而将移植物导入脊髓中。此外,可以通过腰椎穿刺术将细胞施用到
    CSF而不是直接施用到实质。最后,对于这些疾病,使用其它神经细胞类型的几个临床试验
    目前正在进行之中。在这些使用其它神经细胞的临床试验中所使用的相似的流程和程序可
    以由本技术领域的专业人员通过常规改造以用于按照本发明制造的GRP。

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