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    重庆时时彩冷热后三: 一种猪脂肪干细胞分离培养及鉴定的方法.pdf

    关 键 词:
    种猪 脂肪 干细胞 分离 培养 鉴定 方法
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    摘要
    申请专利号:

    CN201610073412.7

    申请日:

    2016.02.03

    公开号:

    CN105602896A

    公开日:

    2016.05.25

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):C12N 5/0775申请日:20160203|||公开
    IPC分类号: C12N5/0775(2010.01)I; C12Q1/02; C12Q1/68; G01N15/14 主分类号: C12N5/0775
    申请人: 广西大学
    发明人: 杨素芳; 韩杰; 李海洋; 邓彦飞; 石德顺; 朱鹏; 杨海燕; 韦精卫; 李湘萍; 黄奔
    地址: 530004 广西壮族自治区南宁市西乡塘区大学东路100号广西大学动物科学技术学院
    优先权:
    专利代理机构: 代理人:
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    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201610073412.7

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2016.06.22|||2016.05.25

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明公开了一种猪脂肪干细胞分离培养及鉴定的方法,包括以下步骤,1)脂肪干细胞的分离培养和纯化;2)脂肪干细胞的传代培养;按照本发明方法所得到的脂肪干细胞遗传稳定性好,体外连续培养到15代仍然保持遗传稳定性;干性好,体外培养传代到第18代仍具有间充质干细胞表面抗原特性;多向分化性能好,具有向成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞分化的能力。

    权利要求书

    1.一种猪脂肪干细胞分离培养的方法,包括以下步骤:
    1)将猪脂肪组织消化后进行细胞筛过滤,细胞筛过滤后进行梯度离心,
    所述的细胞筛过滤和梯度离心重复两次,然后进行细胞培养,
    所述消化采用LiberaseTL进行,所述消化的温度为37℃,时间为1~3h;
    所述的LiberaseTL的浓度为15~25μg/mL,LiberaseTL与脂肪组织的体积比
    为0.5~1∶1;
    2)将所述培养得到的细胞进行传代培养。
    2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤1)中所述的脂肪组
    织消化前还包括以下步骤:
    采集猪脂肪组织;
    将所述采集到的猪脂肪组织清洗后剪碎,所述清洗采用的清洗液为含有
    0.45~0.5g/L青霉素和0.6~1.0g/L链霉素的PBS溶液。
    3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的脂肪组织消化后还
    包括终止消化,所述终止消化具体为:
    使用含体积分数为7.5~15%FBS的低糖DMEM培养液终止消化,所述的
    低糖DMEM培养液为葡萄糖含量低于1000mg/L的DMEM培养液。
    4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的细胞筛过滤按照时
    间顺序包括第一细胞筛过滤和第二细胞筛过滤;
    所述第一细胞筛过滤中细胞筛的孔径为100μm,所述第二细胞筛过滤中
    细胞筛的孔径为70μm。
    5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的梯度离心按照时间
    顺序包括第一离心和第二离心;
    所述第一离心的转速为1000~1400rpm,所述第一离心的时间为8~12min;
    所述第二离心的转速为8000~1200rpm,所述第二离心的时间为8~12min。
    6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述传代培养采用的培养
    液为含有体积分数为7.5~15%%FBS的低糖DMEM培养液,所述的低糖
    DMEM培养液为葡萄糖含量低于1000mg/L的DMEM培养液。
    7.一种猪脂肪干细胞的鉴定方法,包括以下步骤:
    将猪脂肪干细胞进行生物学特性鉴定、表面抗原检测和诱导分化检测。
    8.根据权利要求7所述的鉴定方法,其特征在于所述生物学特性鉴定包
    括测定生长曲线、测定细胞集落和分析细胞核型。
    9.根据权利要求7所述的鉴定方法,其特征在于:所述脂肪干细胞表面
    抗原检测前还包括:
    将所述脂肪干细胞依次进行预消化和消化;
    所述预消化采用LiberaseTL进行,所述LiberaseTL的浓度为
    15~25μg/mL,所述预消化的时间为1~3min,所述预消化的温度为37℃,所述
    预消化的环境中的CO2的体积比例为5%,所述预消化的环境中的湿度为饱
    和湿度;所述消化采用胰蛋白酶和EDTA进行,所述胰蛋白酶的质量浓度为
    0.25%,所述EDTA的质量浓度为0.03~0.05%,所述消化的温度为37℃,CO2
    饱和湿度为5%,所述消化的时间为1~3min。
    10.根据权利要求7所述的鉴定方法,其特征在于,所述的脂肪干细胞
    诱导分化检测,包括以下步骤:
    培养猪脂肪干细胞,当细胞汇合度达到80%-90%时,加入成脂诱导液、
    成骨诱导液和成软骨诱导液进行为期2~4周的成脂、成骨和成软骨细胞诱导;
    将诱导培养到期的细胞分别进行油红O、茜素红和阿尔新蓝染色;
    将诱导培养到期的细胞进行成脂特异性基因Ppar-2、成骨特异性基因
    Osteocalcin和成软骨特异性基因CollagenII检测;
    所述的油红O、茜素红和阿尔新蓝染色和所述的成脂特异性基因Ppar-2、
    成骨特异性基因Osteocalcin和成软骨特异性基因CollagenII检测之间无时间
    顺序限定。

    说明书

    一种猪脂肪干细胞分离培养及鉴定的方法

    技术领域

    本发明涉及动物细胞培养领域,尤其涉及一种猪脂肪干细胞分离培养及
    鉴定的方法。

    背景技术

    胚胎干细胞的研究遇到伦理、法律的瓶颈之后,成体干细胞日益成为研
    究的热点。间充质干细胞(mesenchymalstemcells,MSCs)是存在于脐带血、
    骨髓、肌肉、皮肤和脂肪等组织中的一类成体干细胞,MSCs来源可靠,具有
    自我更新,且具有向多种组织分化潜能,可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、
    神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞。脂肪干细胞(Adipose-derivedstemcells,
    脂肪干细胞)是近年来从脂肪组织中分离得到的一类成体间充质干细胞,具
    有自我更新及向分化潜能。脂肪干细胞由于具有安全、易获得、可迅速扩增
    和多向分化能力等特点使其成为现有干细胞生物工程研究的最理想来源。目
    前临床上已利用这种细胞进行基因治疗、干细胞治疗及骨组织工程的修复等,
    在再生医学领域具有广泛的应用前景。

    2006年,国际细胞治疗协会(间充质干细胞委员会)(Mesenchymaland
    TissueStemCellCommitteeoftheInternationalSocietyforCellularTherapy)认
    为人类的MSCs的必须满足以下三个条件:(1)在标准的细胞培养条件下,
    MSCs必须具备可贴壁性生长;(2)MSCs应该高表达CD73、CD90、CD105;
    而应低表达或不表达CD14、CD45、CD11b、CD34、CD79、CD19以及人白
    细胞抗原(HLA-DR)。(3)在特定的诱导液培养下,MSCs必须具有向骨、
    脂肪和软骨分化的能力。由于目前脂肪干细胞并没有特定的表面标志,因此
    对它们的鉴定主要采用流式细胞仪检测细胞表面标志和将脂肪干细胞进行成
    脂、成骨和成软骨的诱导分化来确定它们是否为脂肪干细胞。这是目前公认
    的间充质干细胞鉴定方法。

    在现有技术中,猪脂肪干细胞在体外连续培养后,容易老化,核型发生
    改变、表面抗原发生变化、且多向分化能力仅局限于向成骨或成骨和成脂肪
    细胞方向分化(Zhangetal.(2014).PLoSONE9(1):e85089.
    doi:10.1371/journal.pone.0085089;Huangetal.StemCellResearch&Therapy
    (2015)6:77),没有向成软骨细胞方向诱导成功的报道。脂肪干细胞的老化限
    制了其在脂肪组织工程及其他组织工程中研究和应用。

    发明内容

    有鉴于此,本发明的目的在于提供一种遗传稳定性好,干性好,多向分
    化性能好的脂肪干细胞培养的方法。

    为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:

    一种猪脂肪干细胞分离培养的方法,包括以下步骤:

    1)将猪脂肪组织消化后进行细胞筛过滤,细胞筛过滤后进行梯度离心,所述
    的细胞筛过滤和梯度离心重复两次,然后进行细胞培养,

    所述消化采用LiberaseTL进行,所述消化的温度为37℃,时间为1~3h;
    所述的LiberaseTL的浓度为15~25μg/mL,LiberaseTL与脂肪组织的体积比
    为0.5~1∶1;

    2)将所述培养得到的细胞进行传代培养。

    优选的,步骤1)中所述的脂肪组织消化前还包括以下步骤:

    采集猪脂肪组织;

    将所述采集到的猪脂肪组织清洗后剪碎,所述清洗采用的清洗液为含有
    0.45~0.5g/L青霉素和0.6~1.0g/L链霉素的PBS溶液。

    优选的,所述的脂肪组织消化后还包括终止消化,所述终止消化具体为:

    使用含体积分数为7.5~15%FBS的低糖DMEM培养液终止消化,所述的
    低糖DMEM培养液为葡萄糖含量低于1000mg/L的DMEM培养液。

    优选的,所述的细胞筛过滤按照时间顺序包括第一细胞筛过滤和第二细胞筛
    过滤;

    所述第一细胞筛过滤中细胞筛的孔径为100μm,所述第二细胞筛过滤中
    细胞筛的孔径为70μm。

    优选的,所述的梯度离心按照时间顺序包括第一离心和第二离心;

    所述第一离心的转速为1000~1400rpm,所述第一离心的时间为8~12min;

    所述第二离心的转速为8000~1200rpm,所述第二离心的时间为8~12min。

    优选的,所述传代培养采用的培养液为含有体积分数为7.5~15%%FBS的
    低糖DMEM培养液,所述的低糖DMEM培养液为葡萄糖含量低于1000mg/L
    的DMEM培养液。

    本发明还提供了一种猪脂肪干细胞的鉴定方法,包括以下步骤:

    将猪脂肪干细胞进行生物学特性鉴定、表面抗原检测和诱导分化检测。

    优选的,所述生物学特性鉴定包括测定生长曲线、测定细胞集落和分析
    细胞核型。

    优选的,所述脂肪干细胞表面抗原检测前还包括:将所述脂肪干细胞依
    次进行预消化和消化;

    所述预消化采用LiberaseTL进行,所述LiberaseTL的浓度为
    15~25μg/mL,所述预消化的温度为37℃,所述预消化的时间为1~3min,

    所述预消化的环境中的CO2的体积比例为5%,所述预消化的环境中的湿
    度为饱和湿度;

    所述消化采用胰蛋白酶和EDTA进行,所述胰蛋白酶的质量浓度为
    0.25%,所述EDTA的质量浓度为0.03~0.05%,所述消化的温度为37℃,CO2
    饱和湿度为5%,所述消化的时间为1~3min。

    优选的,所述的脂肪干细胞诱导分化检测,包括以下步骤:

    培养猪脂肪干细胞,当细胞汇合度达到80%-90%时,加入成脂诱导液、
    成骨诱导液和成软骨诱导液进行为期2~4周的成脂、成骨和成软骨细胞诱导;

    将诱导培养到期的细胞分别进行油红O、茜素红和阿尔新蓝染色;

    将诱导培养到期的细胞进行成脂特异性基因Ppar-2、成骨特异性基因
    Osteocalcin和成软骨特异性基因CollagenII检测;

    所述的油红O、茜素红和阿尔新蓝染色和所述的成脂特异性基因Ppar-2、
    成骨特异性基因Osteocalcin和成软骨特异性基因CollagenII检测之间无时间
    顺序限定。

    本发明的有益效果:本发明提供方法所得到的脂肪干细胞体外连续培养
    到15代,细胞增殖力强,仍然保持遗传稳定性;所得到的脂肪干细胞干性好,
    体外培养传代到第18代仍具有间充质干细胞表面抗原特性(CD90+、CD44+、
    CD29+、CD105+、CD31-、CD45-和HLA-DR-);尤其是不表达HLA-DR,说
    明脂肪干细胞无免疫排斥反应;所得到的脂肪干细胞的多向分化性能好,具
    有向成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞分化的能力。本发明的方法操作简
    单、方便实用、可重复性强,建立了一套规范标准的猪脂肪干细胞的分离、
    培养和鉴定的方法,为今后利用脂肪干细胞建立模式动物,研究人类疾病、
    器官移植、家畜常见疾病,以及在提高优良家畜繁殖力,定向改造家畜遗传
    性状等研究奠定了基础。

    附图说明

    图1为本发明实施例2广西巴马小型猪脂肪干细胞P3、P5、P10和P15
    不同代数下的生长曲线;

    图2为广西巴马小型猪P3脂肪干细胞在21天时吉姆萨染液染色后得到
    的细胞集落图;其中A,B和C分别表示常光、显微镜40×和100×的示意图;

    图3为广西巴马小型猪脂肪干细胞的核型分析图(2n=28);

    图4为猪脂肪干细胞向成脂、成骨和成软骨方向分化图;

    图5为广西巴马小型猪脂肪干细胞特异性基因检测结果;其中,M1、M2、
    M3为DL500Marker,2、5、8为阳性对照GAPDH(230bp),3、6、9为空
    白对照;1:PPAR-2(238bp),4:Osteocalcin(205bp),7:CollageII(240bp);

    图6为广西巴马小型猪脂肪干细胞P6代的表面抗原的流式检测结果图;

    图7为广西巴马小型猪脂肪干细胞P12代的表面抗原的流式检测结果图;

    图8为广西巴马小型猪脂肪干细胞P18代的表面抗原的流式检测结果图。

    具体实施方式

    本发明提供了一种猪脂肪干细胞分离培养的方法,包括以下步骤:

    1)将猪脂肪组织消化、离心后进行细胞培养;

    2)将所述培养得到的细胞进行传代培养。

    本发明对所述猪的种类没有特殊的限定,优选的为广西巴马小型猪,广
    西巴马小型猪是广西地方品种猪,其体型小,解剖结构、组织、生理等方面
    与人类相似,是较好的实验动物模型。

    本发明将猪脂肪组织进行消化,优选在消化前进行如下步骤:

    采集猪脂肪组织;

    将所述采集到的猪脂肪组织清洗后剪碎,所述清洗采用的清洗液为含有
    0.45~0.5g/L青霉素和0.6~1.0g/L链霉素的PBS溶液。

    本发明优选的首先采集猪脂肪组织,所述采集优选具体为:

    用体积分数为75%酒精消毒广西巴马小型猪的腹部,然后从腹部采集脂
    肪组织。

    采集到猪脂肪组织后,本发明将所述采集到的猪脂肪组织清晰后剪碎。
    在本发明中,所述清洗用清洗液优选为含有0.45~0.5g/L青霉素和0.6~1.0g/L
    链霉素的PBS溶液,所述的PBS溶液的pH值优选为7.2~7.4,更优选的为7.3;
    所述清洗的次数优选为2~4次;

    本发明将清洗干净后的脂肪组织优选剪碎成1×1×(1~3)mm的小块。

    得到小块脂肪组织后,本发明优选将所述小块脂肪组织放于含有
    0.45~0.5g/L青霉素和0.6~1.0g/L链霉素的高抗PBS中。

    本发明在上述的处理好的脂肪组织进行消化。在本发明中,所述消化优
    选采用LiberaseTL进行。在本发明中,所述的LiberaseTL是一种高纯度研究
    级别酶混合物,由中性蛋白酶(非梭菌蛋白酶)和高纯度CollagenaseI+
    CollagenaseII混合组成,采用Liberase可以增加细胞产率、细胞活性和细胞
    功能性。在本发明中,所述脂肪组织与LiberaseTL的体积比优选为1∶(1~1.2);
    所述LiberaseTL的浓度优选的为15~25μg/mL,更优选的为20μg/mL。在本
    发明中,所述脂肪组织消化的温度为37℃;所述的组织消化时间优选的为
    1~3h,更优选的为2h。

    在本发明中,所述的脂肪组织消化优选在恒温水浴摇床中进行,所述恒
    温水浴摇床的转速优选的为80~120rpm,更优选的为100rpm。

    在脂肪组织消化后,本发明优选进行脂肪组织消化的终止。在本发明中,

    所述消化终止的终止液优选为含体积分数为7.5~15%FBS的低糖DMEM,
    更优选的为含体积分数为10%FBS的低糖DMEM培养液,所述的低糖DMEM
    培养液为葡萄糖含量低于1000mg/L的DMEM培养液。

    脂肪组织消化结束后,本发明对消化后的脂肪组织进行过滤和离心,去
    除未消化的脂肪组织。在本发明中,所述过滤和离心优选具体为:

    将所述消化后的脂肪组织进行第一细胞筛过滤、第一离心、第二细胞筛
    过滤和第二离心。

    在本发明中,所述第一过滤使用的细胞筛孔径为100μm;

    第一过滤后,本发明收集滤液,将所述滤液进行第一离心。在本发明中,
    所述第一离心的转速优选的为1000~1400rpm,更优选的为1100~1300rpm,最
    优选为1200rpm;所述第一离心的时间优选的为8~12min,更优选的10min;

    第一离心后,本发明收集细胞沉淀,将所述细胞沉淀进行第二细胞筛过
    滤。本发明在进行所述第二细胞筛过滤前,优选使用含体积分数为7.5~15%
    的FBS的低糖DMEM重悬沉淀细胞,所述的低糖DMEM培养液为葡萄糖含
    量低于1000mg/L的DMEM培养液。在本发明中,所述第二过滤使用的细胞
    筛孔径为70μm;

    第二过滤后收集滤液,本发明将所述滤液进行第二离心。在本发明中,
    所述第二离心的转速优选的为800~1200rpm,更优选的为900~1100rpm,最优
    选为1000rpm;所述第二离心的时间优选的为8~12min,更优选的为10min;

    第二离心后收集沉淀细胞,本发明优选向所述沉淀细胞中加入体积分数
    为7.5~15%FBS低糖DMEM细胞培养液重悬细胞,所述的低糖DMEM培养
    液为葡萄糖含量低于1000mg/L的DMEM培养液。

    所述过滤和离心后,本发明将所述离心得到的细胞进行传代培养。本发
    明优选将上述收集到的细胞进行计数,并接种于T25的培养瓶里,置于CO2
    培养箱中培养,24h后更换新的培养液并除去未贴壁的细胞,之后每隔2~4d
    更换一次新的培养液。

    本发明在上述细胞培养过程中,当细胞汇合程度达到80~90%时,进行传
    代培养。在所述传代培养前,本发明优选的对细胞进行传代培养预处理,传
    代培养预处理包括清洗、消化、消化的终止步骤;所述的清洗具体的为使用
    PBS溶液清洗细胞1~3次,更优选的清洗2次;所述的消化步骤优选的为加
    入细胞体积0.25%的胰蛋白酶,消化温度为37℃,消化时间优选的为1~3min,
    更优选的为2min;所述的消化终止步骤优选的为消化后加入体积分数为
    7.5~15%FBS低糖DMEM细胞培养液终止消化,将终止消化后的细胞离心收
    集细胞沉淀,所述离心的转速优选的为1000~1400rpm,更优选的为1200rpm,
    离心时间优选的为2~4min,更优选的为3min。

    本发明所述的传代培养具体的为向上述细胞沉淀中加入体积分数为

    7.5~15%FBS低糖DMEM细胞培养液重悬沉淀,优选的按(4~6)×104
    个细胞/cm2的密度进行传代,更优选的密度为5×104个细胞/cm2,传代培养
    优选的每隔2~4d更换一次新的培养液,更优选的为每3d更换一次新的培养
    液。

    本发明在对猪脂肪干细胞进行传代培养后,优选的对培养的猪脂肪干细
    胞进行冻存,所述的猪脂肪干细胞冻存优选的包括以下步骤:重悬细胞、分
    装细胞和冻存细胞。

    本发明中所述的重悬细胞具体的为使用细胞冷冻液重悬细胞至单细胞状
    态,调整细胞密度优选的为2~3×105/mL,更优选的为2.5×105/mL,所述的细
    胞冷冻液为血清和二甲基亚砜以8∶2的体积比混合得到的;所述的分装细胞具
    体的为将上述重悬细胞进行分装,分装体积优选的为1~3mL,更优选的为
    2mL;所述的冻存细胞具体的为对分装好的细胞进行标记,将其放入-80℃冰
    箱,20~28h后移至液氮中长期保存。

    本发明在需要使用猪脂肪干细胞时,对冻存的猪脂肪干细胞进行复苏。
    在本发明中,所述的复苏优选为:

    将冻存的猪脂肪干细胞置于水浴中解冻;

    将所述解冻后的猪脂肪干细胞离心后培养。

    在本发明中,所述解冻温度优选的为35~40℃,更优选的为37℃。待细
    胞悬液完全溶解时,将细胞悬液移至含有培养液的离心管中离心,收集细胞
    沉淀,用细胞培养液重悬细胞并接种于T25的细胞培养瓶中,放置于培养箱
    中培养。

    本发明还提供了一种猪脂肪干细胞的鉴定方法,包括猪脂肪干细胞的生
    物学特性鉴定,猪脂肪干细胞表面抗原检测和猪脂肪干细胞诱导分化检测。

    本发明中所述的猪脂肪干细胞的生物学特性鉴定包括生长曲线测定、细
    胞集落测定和细胞核型分析。

    所述的生长曲线测定具体的为:

    将不同代数生长状况良好的猪脂肪干细胞接种于96孔板中,进行细胞培
    养;

    测定培养后猪脂肪干细胞的吸光度值;

    以培养时间为横坐标,以吸光度值为纵坐标,得到生长曲线。

    本发明优选在每孔中接种1500~2500个细胞,更优选为2000个;

    优选的每隔22~26h随机取4~6个孔,每个孔加入10μL的CCK-8,1~3h
    后用酶标仪测各个孔中细胞的吸光度值,以吸光度值(4~6孔的平均值,连续
    检测6~8d)为纵坐标,培养天数为横坐标,绘制生长曲线。

    本发明所述的细胞集落测定具体包括猪脂肪干细胞的培养、培养细胞的
    吉姆萨染色和统计分析三个步骤。

    本发明所述的猪脂肪干细胞的培养具体的为取P3代生长状态良好的猪脂

    肪干细胞,稀释至800~1200个细胞/mL,然后取50~150μL稀释后的细
    胞接种于直径为10cm的培养皿中,然后将接种后的细胞放置于培养箱中培
    养,培养时间优选的为18~22d,更优选的为20d。

    本发明所述的培养细胞的吉姆萨染色即为本领域所熟知的吉姆萨染色,
    染色后进行拍照,无其他特殊要求。

    本发明所述的统计分析具体的为统计分析形成的细胞集落数,试验所得
    数据由SPSS(version17.0)软件进行ANOVA统计分析,试验每一次重复,均为
    同一批次试验,所有试验均重复3次,P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差
    异极显著。

    本发明所述的猪脂肪干细胞核型分析具体的包括以下步骤:猪脂肪干细
    胞的预处理,猪脂肪干细胞的制片,猪脂肪干细胞的核型统计分析。

    本发明所述的猪脂肪干细胞的预处理包括选择不同代数的细胞,秋水仙
    素处理细胞,KCL低渗细胞;具体的为选取P5、P10和P15代生长状况良
    好的猪脂肪干细胞,当细胞生长汇合度达到70%-80%时,用秋水仙素的培养
    液处理细胞,所述的秋水仙素培养液的质量浓度优选的为0.1~0.3μg/mL,更
    优选的为0.2μg/mL,所述处理时间优选的为3-4h;所述的KCL低渗细胞具体
    的为收集上述细胞,加入KCL溶液,吹打混匀后移入37℃恒温箱内进行低渗
    处理,所述的KCL溶液的体积为5mL,所述的KCL溶液优选的摩尔浓度为
    为0.075M,所述KCL溶液的温度优选的为35~40℃,更优选的为37℃,所
    述的KCL低渗细胞的时间优选的为20~40min,更优选的为30min。

    本发明所述的猪脂肪干细胞的制片具体的包括预固定,固定和制片。所
    述的预固定具体的为收集低渗处理后的细胞,向收集到的细胞中加入固定液
    进行预固定,所述预固定的时间优选的为1~3min,更优选的为2min,所述的
    固定液为醋酸-甲醇(体积比1∶3),所述的固定液优选的为在4℃预冷5~10min
    的固定液,所述固定液的体积优选的为1~3mL,更优选的为2mL;所述的固
    定具体的为收集预固定后的细胞,向其中加入固定液,所述固定的温度为
    28℃,所述固定的时间优选的为20~40min,更优选的为30min;所述固定步
    骤优选的重复两次。

    本发明所述的制片具体的为收集固定后的细胞,加入200~400μL固定液,
    吹打均匀;取细胞悬液进行制片。

    本发明中所述的猪脂肪干细胞的核型统计分析具体的为:所述制片完成
    后用油镜观察细胞的染色体数目并拍照,对拍照的核型进行计数分析。

    本发明对猪脂肪干细胞表面抗原进行检测,具体的包括消化分装和抗原
    检测两步。本发明中所述的消化分装具体的为取培养的猪脂肪干细胞,当细
    胞汇合度达到80%-90%时,对其进行消化分装,所述的消化步骤具体的为先
    采用15~25μg/mL的LiberaseTL在37℃培养箱预消化细胞1~3min,预消化后
    加入细胞体积0.25%的胰蛋白酶和0.04%的EDTA继续消化2-3min,然后震
    荡细胞,使细胞从贴壁状态中游离出来,加入含体积分数为10%FBS的低糖

    DMEM培养液终止消化,收集细胞,用PBS清洗2~3遍后,离心收集细
    胞,再加入PBS混匀细胞,所述的分装步骤与上述猪脂肪干细胞冻存中的分
    装步骤相同;所述的抗原检测步骤具体的为:分别向分装后的猪脂肪干细胞
    中加入以下抗体CD29-AF647,CD44-FITC,CD31-FITC,CD45-FITC,
    HLA-DA-FITC,CD90-FITC,CD105-PE,IgG1-AF647,IgG1-FITC,IgG2a-FITC,
    IgG2a-PE和IgG2b-FITC,进行避光孵育,所述孵育的时间优选的为
    30min-60min,更优选的为45min,所述孵育的温度优选的为25~30℃,更优
    选的为28℃;所述的孵育完成后使用PBS溶液清洗,所述的清洗的次数优选
    的为2~4次,更优选的为3次;所述的清洗完成后用多聚甲醛重悬固定细胞,
    所述的多聚甲醛的质量浓度优选的为0.5~1.5%,更优选的为1%;所述的固定
    细胞于4℃避光保存过夜后进行流式细胞检测。

    本发明的鉴定方法还包括猪脂肪干细胞诱导分化检测,包括猪脂肪干细
    胞成脂细胞诱导分化检测,成骨细胞诱导分化检测和成软骨细胞诱导分化检
    测。

    本发明所述的猪脂肪干细胞成脂细胞诱导分化检测包括细胞接种和两步
    成脂诱导。所述的细胞接种具体的为取P3代生长状态良好的猪脂肪干细胞,
    当细胞汇合度达到80%-90%时,按照(2.5~3.5)×104细胞/mL的接种量接种
    至48孔板中培养;所述的两步诱导具体的为当细胞生长汇合度达到85~95%
    时,加入成脂诱导液,所述的两步诱导优选的先使用IM诱导液诱导细胞1~3d
    后,再使用MM诱导液诱导1~3d,1~3换一次液体,如此操作重复12~16d
    后进行油红O染色和成脂特异性基因检测。

    本发明中所述的成脂诱导液的为IM和MM,所述的IM为10%FBS,1%
    双抗,0.5mMIBMX,1μM地塞米松,100uM吲哚美辛,10μg/mL胰岛素,
    余量的DMEM;所述的MM为10%FBS,10μg/mL胰岛素,1%双抗,余量的
    DMEM。

    本发明所述的猪脂肪干细胞向成骨细胞诱导分化检测包括细胞接种和成
    骨诱导,所述的细胞接种步骤与成脂细胞诱导分化中细胞接种的步骤相同;
    所述的成骨诱导具体的为当细胞生长汇合度达到90%时,加入成骨诱导液,
    每1~3d更换一次成骨诱导液,诱导18~24d后进行茜素红染色和成骨特异性
    基因检测。

    本发明所述的成骨诱导液为10%FBS,1%双抗,10mMβ-甘油磷酸钠,
    0.1μM地塞米松,0.2mM抗坏血酸盐,余量的DMEM。

    本发明所述的猪脂肪干细胞向成软骨细胞诱导分化检测包括细胞接种和
    成软骨诱导,所述的细胞接种步骤与成脂细胞诱导分化中细胞接种的步骤相
    同;所述的成软骨诱导具体的为:当细胞生长汇合度达到90%时,加入成软
    骨诱导液,每1~3d更换一次成软骨诱导液,诱导18~24d后进行阿尔新蓝染
    色和成软骨特异性基因检测。

    本发明所述的成骨诱导液为10%FBS,10ng/mLTGFβ1,6.25μg/mL胰岛
    素,0.05mM抗坏血酸盐,1%双抗,余量的DMEM。

    下面结合实施例对本发明提供的猪脂肪干细胞分离培养及鉴定的方法进
    行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明?;し段У南薅?。

    实施例1猪脂肪干细胞分离培养

    选取出生24h内的一头死的广西巴马小型公猪腹股沟处脂肪组织块,经
    75%酒精消毒后随即用高抗的PBS清洗组织3次,再转移至含有培养液的无
    菌离心管(规格为50mL)中带回实验室。在无菌超净台中将脂肪组织充分剪
    碎为大小约1mm×1mm×1mm小块并转移至50mL无菌离心管,脂肪体积约为
    5mL/管,每管加入1倍脂肪体积的20μg/mLLiberaseTL,充分混匀,然后放
    入37℃恒温水浴摇床(100rpm/min)消化2h,之后取出离心管并加入20mL
    含10%FBS的低糖的DMEM终止消化,轻轻混匀消化混合物,使用100μm
    细胞筛过滤去除未消化的脂肪组织,1200rpm离心10min,弃上清;用含
    10%FBS的低糖DMEM培养液重悬沉淀后,再用使用70μm细胞筛过滤去除
    未消化的脂肪组织,1000rpm离心10min,弃上清。取细胞悬液与混合(体比
    为1∶1)后进行血细胞计数板计数,以5×104细胞/cm2的密度接种于T25的培
    养瓶里,置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养,24h后换液观察发现
    细胞呈梭型,淘汰未贴壁的细胞,之后每3d换液一次。当细胞丰度达80-90%
    时,弃除培养皿的DMEM部分,用PBS液清洗并弃除PBS液,随后加入0.25%
    的胰蛋白酶-EDTA500μL进行消化2min,加入两倍胰蛋白酶体积的DMEM
    (即:1mL)终止消化,将细胞重悬并转移到15mL离心管,离心弃上清,重
    悬沉淀,按5×104个细胞/cm2的密度进行传代,每隔3天换一次培养液。

    实施例2猪脂肪干细胞的生物学特性鉴定

    收集实施例1中生长状况良好的广西巴马小型猪脂肪干细胞的P3、P5、
    P10和P15代,进行细胞计数以每孔2000个细胞的密度接种到96孔板,设置
    空白孔(无细胞)和对照孔(培养基不加药,有细胞),每组设定3个复孔。
    按照CCK-8测定说明方法进行操作。连续测定一周,时间为横坐标,酶标仪
    的读数(5孔的平均数)为纵坐标绘生长曲线图,生长曲线图如附图1所示。

    由生长曲线图可知,传代后的猪脂肪干细胞增殖速度快,但随着传代次
    数的增加,其增长速度有所下降。

    选取P3代生长状态良好的广西巴马小型猪脂肪干细胞,经血细胞计数板
    记数稀释至1000个细胞/mL,然后取100μL稀释后的细胞接种于直径为10cm
    的培养皿中,按此法每种细胞接种3皿。将接种后的细胞置于培养箱中培养,
    21d后停止培养,弃细胞培养液,PBS清洗三次;4%的多聚甲醛固定15min
    后,PBS再洗三次;然后吉姆萨染色30min,PBS洗三次,拍照并统计分析形
    成的细胞集落数,集落图片如说明书附图2A、B和C所示,说明脂肪干细胞
    在体外增殖速度快。

    取P5、P10和P15代状态稳定的广西巴马小型猪脂肪干细胞,当细胞丰
    度为70~80%时,将原培养液换成含0.2μg/mL秋水仙素的培养液,继续培养
    4h。随即二次离心后弃上清,并加入5mL的0.075MKCL溶液,恒温箱内进
    行30min低渗处理,离心弃上清。加入新鲜配置的预冷(4℃)的醋酸-甲醇(1∶
    3)固定液2mL,预固定2min。离心弃上清,加入新鲜的固定液5mL,气泡
    吹打均匀细胞,室温固定30min,离心后弃上清,重复固定一次,加入300μL
    新鲜固定液混匀。取细胞悬液,从80cm高处,垂直将1-2滴细胞悬液滴在-20℃
    预冷载玻片上,酒精灯外焰上过5次固定细胞,72℃烘箱过夜烘干玻片。将
    玻片进行Giemsa染液染色30min,流水冲洗后室温风干。在油镜下观察染色
    体数后拍照,计数分析拍照的核型,如说明书附图3所示。由图3的核型图
    可知,P5代巴马香猪脂肪干细胞的核型正常率达到90%以上,随着传代次数
    的增加,其核型正常率有不同程度的下降,但是P15代仍有83%以上的核型
    正常率。说明脂肪干细胞在体外连续培养下,能保持相对的遗传稳定性。本
    发明对得到的广西巴马小型猪脂肪干细胞的核型进行分析,结果如表1所示,
    表1为本发明实施例2得到的广西巴马小型猪脂肪干细胞核型分析结果。

    表1本发明实施例2得到的广西巴马小型猪脂肪干细胞核型分析结果

    代数
    整二倍体的个数(2n)
    非整二倍体的个数(≠2n)
    正常率
    P5
    29
    3
    90.63%
    P10
    42
    6
    87.50%
    P15
    30
    6
    83.33%

    由表1可以看出,P5代巴马香猪脂肪干细胞的核型正常率达到90%以上,

    随着传代次数的增加,其核型正常率有不同程度的下降,但是P15代仍
    有83%以上的核型正常率,说明本发明所述的方法培养的猪脂肪干细胞遗传
    稳定性好。

    实施例3广西巴马小型猪脂肪干细胞表面抗原的流式检测

    取实施例1中不同代数且生长状况良好的广西巴马小型猪脂肪干细胞,当细
    胞丰度达到80%-90%时,先采用LiberaseTL(20μg/mL)在CO2培养箱预消
    化脂肪干细胞2min,之后再加入0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA继续消化
    2-3min,然后取出培养瓶,用力震荡底部,使细胞从贴壁状态中游离出来。加
    入培养液终止消化,收集细胞,离心弃上清。PBS洗2次后,离心弃上清,
    再加入适量的PBS混匀细胞,之后将脂肪干细胞分装成12管,依次分别加入
    抗体CD29-AF647,CD44-FITC,CD31-FITC,CD45-FITC,HLA-DA-FITC,
    CD90-FITC,CD105-PE,IgG1-AF647,IgG1-FITC,IgG2a-FITC,IgG2a-PE
    和IgG2b-FITC,避光室温孵育35min;PBS洗3次,用适量的1%多聚甲醛重
    悬固定细胞,4℃避光保存过夜,第二天进行流式细胞检测。检测结果如说明
    书附图6-8和表2所示。图6是广西巴马小型猪脂肪干细胞P6代的表面抗原
    的流式检测结果图;其中CD90、CD44、CD29和CD105的阳性率分别为84.71、
    70.73、92.27和69.74;CD31、CD45和HLA-DR的阳性率分别为6.92、6.25
    和5.59;图7为广西巴马小型猪脂肪干细胞P12代的表面抗原的流式检测结
    果图;其中CD90、CD44、CD29和CD105的阳性率分别为82.05、63.18、89.04
    和68.21;CD31、CD45和HLA-DR的阳性率分别为7.26、9.63和6.75;图8
    为广西巴马小型猪脂肪干细胞P18代的表面抗原的流式检测结果图;其中
    CD90、CD44、CD29和CD105的阳性率分别为96.43、98.67、97.58和40.08;
    CD31、CD45和HLA-DR的阳性率分别为2.75、3.55和1.94。流式检测结果
    表明,所分离培养的不同代数的细胞(包括第18代)均表达间充质干细胞相
    关的细胞表面抗原CD29、CD44、CD90,和CD105,均不表达造血干细胞相
    关的细胞表面抗原CD31、CD45和HLA-DR。

    表2本发明实施例3得到的不同代数广西巴马小型猪脂肪干细胞表面抗原流
    式检测结果

    抗原
    P3
    P6
    P9
    P12
    P15
    P18
    平均
    CD31-FITC
    1.44
    6.92
    4.61
    7.26
    4.59
    2.75
    4.60
    CD45-FITC
    2.35
    6.25
    4.82
    9.63
    5.86
    3.55
    5.41
    HLA-DR-FITC
    1.01
    5.59
    4.19
    6.75
    3.88
    1.94
    3.89
    CD90-FITC
    91.29
    84.71
    83.36
    82.05
    80.09
    96.43
    86.32
    CD44-FITC
    90.74
    70.73
    64.66
    63.18
    93.54
    98.67
    80.25
    CD29-FITC
    94.60
    92.27
    91.75
    89.04
    94.74
    97.58
    93.33
    CD105-PE
    76.15
    69.74
    78.26
    68.21
    59.46
    40.08
    65.32

    由图6~8和表2可以看出,本发明所述的方法培养的猪脂肪干细胞保持
    间充质干细胞的特性。

    实施例4广西巴马小型猪脂肪干细胞的诱导分化鉴定

    取P3代生长状态良好的广西巴马小型猪脂肪干细胞,当细胞汇合度达到
    80%-90%时,胰酶消化,收集细胞,离心弃上清。用细胞培养液重悬混匀后,
    调整细胞密度为3×104个/mL,接种至48孔板中,每孔加入细胞悬液300μL,
    每3d换一次新鲜的培养液。当细胞生长汇合度达到90%时,加入成脂、成骨
    和成软骨诱导液。具体诱导液配方和诱导方法如表3所示。

    表3诱导液配方和诱导方法


    体外诱导后组织染色结果如说明书附图4所示。由图4可知,在成脂
    诱导中,随着诱导时间的增加,猪脂肪干细胞内开始出现脂滴并逐渐变大、
    变多;诱导结束后,用油红“O”染色,检测结果表明细胞胞质内的出现红色的
    脂质物沉积。成骨诱导中,诱导前,猪脂肪干细胞呈成纤维样生长,诱导过
    程中细胞体形逐渐变大;诱导结束后,茜素红染色结果表明,细胞出现红色
    钙化的结点。成软骨诱导中,诱导后的细胞以集落状生长且随着培养时间的
    增加,细胞集落慢慢隆起形成“克隆”状,阿尔新蓝染色结果显示细胞间存在软
    骨特异性蛋白多糖的聚积。以上结果从组织学上表明:本发明分离培养的广
    西巴马小型猪脂肪干细胞具有成脂、成骨和成软骨的分化能力。

    特异性基因检测:对诱导后细胞提取总RNA

    <1>收集广西巴马小型猪脂肪干细胞诱导后的产物,胰酶消化后,转移至
    1.5mLEP管中,PBS清洗、离心、弃上清,此步骤重复3次。

    <2>加入1mL的裂解液,冰上裂解5min。

    <3>加入200μL氯仿,后冰上放置5min。

    <4>4℃条件下12000rpm离心15min。

    <5>吸取上清,加入等体积预冷的异丙醇,充分混匀后冰上放置5min。

    <6>4℃条件下12000rpm离心10min。

    <7>弃上清,加入75%乙醇(用DEPC水新鲜配置),洗涤沉淀部分。

    <8>4℃条件下7500rpm离心8min。

    <9>重复步骤(7)和(8)各一次。

    <10>EP管管口敞开,于超净台内风干RNA。加20-30μLDEPC水溶解。

    <11>取2μgRNA消化DNA后用于反转录。剩余RNA放-80℃冰箱保存。

    DNA消化体系如表4。

    表4DNA酶消化体系


    放入PCR仪,37℃消化40min;加入1μLEDTA,65℃10min终止消化。

    cDNA制备(参照AMV反转录酶使用说明书)

    反转录体系如表5。

    表5反转录体系


    反转录PCR反应条件:25℃5min,42℃60min,95℃5min,4℃结束反
    应。

    取适量所得cDNA用于PCR扩增,剩余cDNA4℃保存。

    PCR扩增引物如表6所示

    表6PCR扩增引物


    PCR反应体系如表7所示

    表7PCR反应体系


    PCR反应条件:采用降落PCR反应条件,即94℃4min;94℃30s,62℃30s,
    72℃30s进行4个循环;94℃30s,60℃30s,72℃30s,4个循环;94℃30s,
    58℃30s,72℃30s,15个循环;94℃30s,56℃30s,72℃30s,15循环;最
    后72℃,7min;4℃结束。反应结束后,取4μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电
    泳。

    通过以上特异性基因检测步骤可知,结果显示的成脂、成骨和成软骨诱
    导产物分别表达特异性标志基因PPAR-2、Osteocalcin和CollagenII,如说明
    书附图5所示。该特异性基因检测的试验表明,本发明所分离培养广西巴马
    小型猪脂肪干细胞在特定培养基下可向成脂、成骨和成软骨分化,而对照组
    未分化。说明在此培养体系下可以维持其体外未分化的状态,同时也有良好
    的体外分化潜能。

    通过本发明方法分离培养的细胞,经过流式细胞仪检测其表面抗原,结
    合体外诱导分化试验的结果充分表明,所分离培养的细胞鉴定为广西巴马小
    型猪脂肪干细胞。

    由以上实施例可知,本发明所述的方法所得到的脂肪干细胞细胞增殖力
    强,遗传稳定性好;所得到的脂肪干细胞干性好,体外培养传代到第18代仍

    具有间充质干细胞表面抗原特性无免疫排斥反应;所得到的脂肪干细胞
    的多向分化性能好,具有向成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞分化的能力。
    本发明的方法操作简单、方便实用、可重复性强,建立了一套规范标准的猪
    脂肪干细胞的分离培养和鉴定的方法。

    以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普
    通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润
    饰,这些改进和润饰也应视为本发明的?;し段?。

    关于本文
    本文标题:一种猪脂肪干细胞分离培养及鉴定的方法.pdf
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