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    重庆时时彩杀号技巧: 一种H7N9亚型禽流感病毒检测试剂盒及其使用方法.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201510745998.2

    申请日:

    2015.11.05

    公开号:

    CN105603058A

    公开日:

    2016.05.25

    当前法律状态:

    撤回

    有效性:

    无权

    法律详情: 发明专利申请公布后的视为撤回 IPC(主分类):C12Q 1/68申请公布日:20160525|||实质审查的生效IPC(主分类):C12Q 1/68申请日:20151105|||公开
    IPC分类号: C12Q1/68; C12Q1/70; G01N33/53 主分类号: C12Q1/68
    申请人: 江苏省疾病预防控制中心
    发明人: 祁贤; 章倩云; 宋勇春; 汤奋扬; 王慎骄; 余慧燕; 邓婓
    地址: 210009 江苏省南京市鼓楼区江苏路172号
    优先权:
    专利代理机构: 南京知识律师事务所 32207 代理人: 胡锡瑜
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201510745998.2

    授权公告号:

    ||||||

    法律状态公告日:

    2019.03.12|||2016.06.22|||2016.05.25

    法律状态类型:

    发明专利申请公布后的视为撤回|||实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明属于生物技术领域,涉及一种H7N9亚型禽流感病毒PCR-ELISA检测试剂盒及使用方法。检测试剂盒由RT-PCR反应体系、ELISA检测体系、3个靶基因(甲型流感病毒M基因、H7N9亚型病毒HA基因和H7N9亚型病毒NA)阳性质粒(pMD-M、Pmd-H7和Pmd-N9)、阴性质控品和3个靶基因的特异性引物探针组成。用这3组生物素标记的特异性引物,通过RT-PCR进行特异性扩增,扩增产物变性后与地高辛标记的特异性探针杂交,杂交产物包被链霉亲和素包被的96孔微板,加入辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体通过ELISA法进行检测。本发明涉及3组特异性引物探针在环境标本鉴别诊断和H7N9亚型禽流感病毒分离株分型鉴定中的用途。

    权利要求书

    1.一种基于RT-PCR-ELISA的H7N9亚型流感病毒分型检测试剂盒,其特征是试剂盒的组成部分为AMV反转录体系、PCR反应体系、阳性质控品、阴性质控品和3种H7N9亚型流感病毒靶基因特异性引物探针,3种流感病毒靶基因特异性引物探针名称和序列分别是:M-Fttctaaccgaggtcgaaacgtatgt、M-RBIO-acggtgagcgtgaaaacaaaccc、M-PDIG–tcaggccccctcaaagccgagat、H7-Fcaaataacaggaaaattaaaccggc、H7-RBIO-ccccgaagctaaaccaaagtatcac、H7-PDIG–gagagagaatgctgaagaagatggc、N9-Fcacttcagccactgctatcataa、N9-RBIO-attgttccgtttgagtgtttccct和N9-PDIG–tgggaaagacaatgcagtaagaa。2.根据权利要求1所述一种基于RT-PCR-ELISA的试剂盒的使用方法,其特征是由以下步骤构成:(1)RT-PCR反应:采用TaKaRa公司的一步法试剂盒进行PCR扩增反应,反应条件为:50℃逆转录30min,94预变性2min,热循环参数为94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸90s,35个循环后,72℃延伸7min,得到生物素标记的PCR产物,同时设置空白对照组;(2)ELISA检测:取扩增好的生物素标记的PCR产物5μL,加至10μL的0.1mol/LNaOH溶液中,于室温下变性10min,再加入10nmol/L地高辛标记的特异性探针,用含有300mmol/LNaCl,100mmol/LTris-HClpH6.5,10mmol/LEDTA,0.1%Twee-20的杂交液稀释,50℃孵育10min,随后,取100μL液体加至链霉亲和素包被的96孔微板中,50℃孵育60min,弃去孔中液体,加入300μLPBST洗板5次,然后加入辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体100μL,37℃孵育60min,洗板5次,最后加入TMB显色液进行显色,3min后加入终止液终止显色,于酶标仪450nm波长处测定其吸光度值OD;(3)结果判定:本实验需设置两个或两个以上重复,同时以PCR扩增反应中的空白对照作为阴性对照组,若实验组的OD值>2倍阴性对照组平均OD值,则判定为阳性,反之则为阴性。

    说明书

    一种H7N9亚型禽流感病毒检测试剂盒及其使用方法

    技术领域

    本发明属于生物技术领域,具体涉及一种分型检测H7N9亚型禽流感病毒核酸的RT-PCR-ELISA试剂
    盒及其使用方法。

    背景技术

    甲型流感病毒分类上属于正粘病毒科,基因组由8个单链负义RNA节段组成。甲型流感病毒宿主较
    广,可以感染人、禽和其它哺乳动物。根据病毒表面2个糖蛋白血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原
    性,甲型流感病毒可以分为不同的血清亚型。目前已在甲型流感病毒的自然储存宿主野生水禽中发现16
    种HA亚型(H1-H16)和9种NA亚型(N1-N9)。一般情况下,禽流感病毒不会突破种属障碍感染人。
    但自1997年香港H5N1禽流感病毒感染人事件以来,禽流感病毒(包括H5、H9和H7亚型)感染人事件
    的发生越来越频繁。2013年初,在我国长三角地区出现一种新的通过基因重配产生的H7N9亚型禽流感病
    毒,该病毒能够跨物种感染人并引起严重疾病。目前中国大陆的省份和地区都有病例报道,截止,对
    人类健康和公共卫生造成新的重大威胁。

    目前针对H7N9亚型禽流感病毒感染的核酸检测方法主要有基因测序法、Real-timetimePCR法和环等
    温扩增(LAMP)法等?;虿庑蚍ㄊ欠肿诱锒系慕鸨曜?,但耗时费力,一般需要24-48小时,对实验人
    员的技术要求高,同时试验仪器和试剂昂贵,一般实验室难以开展。Real-timetimePCR法和LAMP法具
    有很好的特异性和敏感性,但前者同样依赖昂贵的仪器和试剂;而后者难以实现多重检测。因此,建立一
    种成本低、通量高、适合现场诊断的H7N9亚型核酸分子检测方法,对于疾病的临床救治和防控意义重大。

    发明内容

    本发明需要解决的问题是提供一种分型检测H7N9亚型禽流感病毒核酸的多重PCR-ELISA试剂盒及
    其使用方法。

    本发明提供的检测H7N9亚型禽流感病毒核酸的多重PCR-ELISA的试剂盒由RT-PCR反应体系;3个
    靶基因甲型流感病毒M基因、H7N9亚型病毒HA基因和H7N9亚型病毒N9基因的阳性质粒:pMD-M、
    Pmd-H7和Pmd-N9;阴性质控品和3个靶基因的特异性引物探针(表1)组成,探针的5端用生物素(BIctO)
    标记。

    表1靶基因的特异性引物探针


    本发明所述一种多重PCR-ELISA试剂盒在H7N9亚型禽流感病毒分型检测中的使用方法:

    (1)病毒核酸提?。翰捎贸9娣椒ㄌ崛×俅脖茄适米颖瓯净虿《九嘌锖怂?,-70℃冰箱放置备用。

    (2)多重PRT-PCR反应:采用TaKaRa公司的一步法试剂盒进行PCR扩增反应,反应体系为:10×
    ExTaqBuffer4μL,25mMMgCl5μL,2.5mMdNTPs6μL,TaqDNA聚合酶5U,M、H7和N9上下游
    引物各0.75μL,模板1.6μL,加DEPC水至50μL.。扩增程序为:50℃逆转录30min,94预变性2min,
    热循环参数为94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸90s,35个循环后,72℃延伸7min,得到生物素标
    记的PCR产物,同时设置空白对照组。

    (3)ELISA检测:取扩增好的生物素标记的PCR产物5μL,加至10μL的0.1mol/LNaOH溶液中,
    于室温下变性10min,再加入10nmol/L地高辛标记的特异性探针(用含有300mmol/LNaCl,100mmol/L
    Tris-HClpH6.5,10mmol/LEDTA,0.1%Twee-20的杂交液稀释),50℃孵育10min。随后,取100μL液体
    加至链霉亲和素包被的96孔微板中,50℃孵育60min,弃去孔中液体,加入300μLPBST洗板5次。然
    后加入辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体100μL,37℃孵育60min,洗板5次,最后加入TMB显色液
    进行显色,一定时间后加入终止液终止显色,于酶标仪450nm波长处测定其吸光度值(OD)。本实验需设
    置两个或两个以上重复,同时以PCR扩增反应中的空白对照作为阴性对照组,若实验组的OD值>2倍阴
    性对照组平均OD值,则判定为阳性,反之则为阴性。

    与现有技术相比,本发明的有益效果是:。

    设计针对H7N9流感病毒3个靶基因的特异性引物探针,通过PCR-ELISA方法,可以对临床、环境
    及动物标本和病毒分离物进行H7N9亚型流感病毒分型鉴定,具有快速、敏感、特异等特点;且无需昂贵
    仪器设备,便于操作,为H7N9亚型流感监测和临床救治提供一种新的检测方法,是一种成本低、通量高、
    适合现场诊断的H7N9亚型核酸分子检测方法。

    附图说明

    图1通过M、H7、N9质粒比较普通PCR和PCR-ELISA的敏感性

    具体实施方式

    下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案,但本发明技术的应用不限于实施例。

    实施例1:靶基因质粒构建

    设计特异性引物,分别针对甲型流感病毒M基因、H7亚型病毒HA基因和N9亚型病毒NA基因,
    通过RT-PCR法扩增获得3个目的基因片段,回收纯化后的分别与T载体连接,获得靶基因阳性质粒,分
    别命名为pMD-M、Pmd-H7和Pmd-N9。

    实施例2:PCR-ELISA法敏感性

    (1)PCR反应:分别将靶基因克隆质粒pMD-M、Pmd-H7和Pmd-N9稀释100倍,再按10倍梯度稀释
    成10-2-10-9共八个浓度,以此为模板,使用上述由生物素标记的引物,采用TaKaRa公司的一步法试剂盒
    进行PCR扩增反应。反应条件为:94℃预变性5min,热循环参数是94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延
    伸90s,35个循环后,72℃延伸7min,得到地高辛标记的PCR产物,同时设置空白对照组。将所得到的
    地高辛标记的PCR产物分别通过ELISA、1.5%琼脂糖凝胶电泳两种方法来确定各自的敏感性。

    (2)ELISA检测:取扩增好的生物素标记的PCR产物5μL,加至10μL的0.1mol/LNaOH溶液中,
    于室温下变性10min,再加入10nmol/L地高辛标记的特异性探针(用含有300mmol/LNaCl,100mmol/L
    Tris-HClpH6.5,10mmol/LEDTA,0.1%Twee-20的杂交液稀释),50℃孵育10min。随后,取100μL液体
    加至链霉亲和素包被的96孔微板中,50℃孵育60min,弃去孔中液体,加入300μLPBST洗板5次。然
    后加入辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体100μL,37℃孵育60min,洗板5次,最后加入TMB显色液
    进行显色,3min后加入终止液终止显色,于酶标仪450nm波长处测定其吸光度值(OD)。本实验需设置
    两个或两个以上重复,同时以PCR扩增反应中的空白对照作为阴性对照组,若实验组的OD值>2倍阴性
    对照组平均OD值,则判定为阳性,反之则为阴性。

    表1PCR-ELISA检测靶基因敏感性比较

    片段
    传统RT-PCR检测最低拷贝数(copies/μL)
    PCR-ELISA检测最低拷贝数(copies/μL)
    M
    1.43×104
    1.43×103
    H7
    1.04×103
    1.04×101
    N9
    8.80×105
    8.80×103

    由表格中可以看出,相比于传统的RT-PCR扩增技术,本实验中所建立的PCR-ELISA方法敏感度是
    其10-100倍,很好的解决了RT-PCR技术敏感性较差这一问题。

    实施例3:PCR-ELISA法特异性

    以肠道病毒、呼吸道冠状病毒、鼻病毒、呼吸道合胞体病毒、甲型流感病毒H1、H3、H5、H7和H9
    亚型和乙型流感核酸为模板,用上述3套引物进行PCR-ELISA实验。结果4套引物对肠道病毒、呼吸道
    冠状病毒、鼻病毒、呼吸道合胞体病毒核酸不能扩增,不同亚型流感病毒之间也不存在交叉反应,表明建
    立的PCR-ELISA方法具有较好的特异性。。

    实施例3:临床标本检测

    收集98份临床和环境标本,其中H1N1型流感病毒15份,H3N2型流感病毒15份,B型流感病毒5
    份,H9N2型流感病毒15份,H7N9型流感病毒40份,阴性标本8份,所有标本都经过细胞培养进行病毒
    分离。

    (1)病毒RNA提取

    采用酚氯仿法提取病毒RNA,具体步骤:1.取临床标本(鼻咽拭子或病毒分离物)100μL,加入含有
    300ulDEPC水的1.5mlEP中,充分混匀后加入200ul水饱和酚,剧烈震荡混匀,静置3min,加入200ul
    氯仿,充分震荡混匀,12000g室温离心15分钟。2.吸取上清液,加入两倍上清体积的异丙醇,再加入1/10
    上清体积3M醋酸钠约40ul,充分混匀后-20℃静置2h;取出于4℃下,12000g,离心20min。3.弃上清,
    加入75%乙醇1ml,4℃,12000g,离心20min。4.弃上清,室温干燥,加入40ulDEPC水溶解RNA。

    (2)RT-PCR反应:取5ul核酸,使用上述由生物素标记的引物,采用TaKaRa公司的一步法试剂盒
    进行PCR扩增反应。反应条件为:94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸90s,35个循环后,72℃延伸
    7min,得到生物素标记的PCR产物,同时设置空白对照组。

    (3)ELISA检测:取扩增好的生物素标记的PCR产物5μL,加至10μL的0.1mol/LNaOH溶液中,
    于室温下变性10min,再加入10nmol/L地高辛标记的特异性探针(用含有300mmol/LNaCl,100mmol/L
    Tris-HClpH6.5,10mmol/LEDTA,0.1%Twee-20的杂交液稀释),50℃孵育10min。随后,取100μL液体
    加至链霉亲和素包被的96孔微板中,50℃孵育60min,弃去孔中液体,加入300μLPBST洗板5次。然

    后加入辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体100μL,37℃孵育60min,洗板5次,最后加入TMB显
    色液进行显色,一定时间后加入终止液终止显色,于酶标仪450nm波长处测定其吸光度值(OD)。本实验
    需设置两个或两个以上重复,同时以PCR扩增反应中的空白对照作为阴性对照组,若实验组的OD值>2
    倍阴性对照组平均OD值,则判定为阳性,反之则为阴性。

    通过多重PCR-ELISA检测了104临床样本,其中H1N1型流感病毒49个,H3N2型流感病毒44个,
    B型流感病毒11个,结果均与细胞培养一致。



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