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    官方重庆时时彩奖金: 一种抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体.pdf

    摘要
    申请专利号:

    重庆时时彩单双窍门 www.4mum.com.cn CN201610051163.1

    申请日:

    2014.03.13

    公开号:

    CN105602907A

    公开日:

    2016.05.25

    当前法律状态:

    实审

    有效性:

    审中

    法律详情: 实质审查的生效IPC(主分类):C12N 5/20申请日:20140313|||公开
    IPC分类号: C12N5/20; C07K16/10; G01N33/577; G01N33/571; C12R1/91(2006.01)N 主分类号: C12N5/20
    申请人: 华中农业大学; 武汉华大瑞尔科技有限公司
    发明人: 肖运才; 王喜亮; 石德时; 刘锡玲; 苏金玲; 都跃; 毕丁仁; 周祖涛; 李自力; 刘梅
    地址: 430070 湖北省武汉市洪山区狮子山街1号
    优先权:
    专利代理机构: 武汉宇晨专利事务所 42001 代理人: 张红兵
    PDF完整版下载: PDF下载
    法律状态
    申请(专利)号:

    CN201610051163.1

    授权公告号:

    |||

    法律状态公告日:

    2016.06.22|||2016.05.25

    法律状态类型:

    实质审查的生效|||公开

    摘要

    本发明属于动物传染病免疫检测领域,具体涉及一种抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体,该单克隆抗体是由杂交瘤细胞株XYCDY-1BV-3G5分泌的,该细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC?NO:C201450。所述的另一个单克隆抗体是由抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株XYCDY-1BV-1E6分泌的,该细胞株保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC?NO:C201454。本发明的杂交瘤细胞株可在制备检测鸡传染性支气管炎病毒抗原的单克隆抗体中应用。

    权利要求书

    1.一种分泌抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株
    XYCDY-1BV-3G5,保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCCNO:C201450。
    2.一种分泌抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株
    XYCDY-1BV-1E6,保藏在中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCCNO:C201454。
    3.权利要求1所述的分泌抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株
    XYCDY-1BV-3G5在制备检测鸡传染性支气管炎病毒抗原的单克隆抗体中的应用。
    4.权利要求2所述的分泌抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株
    XYCDY-1BV-1E6在制备检测鸡传染性支气管炎病毒抗原的单克隆抗体中的应用。

    说明书

    一种抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体

    本发明是申请号为2014100921707申请案的分案申请,原案申请日为2014年3月13日。

    技术领域

    本发明属于动物免疫应用技术领域。具体涉及一种抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体,
    该单克隆抗体可在禽三种呼吸道疾病(禽流感H5亚型和H9亚型、新城疫及鸡传染性支气管
    炎)病原检测的三联快速检测试剂盒中应用。本发明制备的试剂盒可一次同时完成对禽三种
    呼吸道疾病如禽流感H5亚型和H9亚型、新城疫及鸡传染性支气管炎病原的快速检测。

    背景技术

    禽的呼吸道感染在养禽生产实践中是一类极为常见的疾病,尤其是该类疾病的发生复杂
    多变,给养禽业带来了巨大的经济损失。引发禽的呼吸道感染的病原主要包括病毒、细菌及
    支原体,其中均由RNA病毒引起的三种疾病禽流感(Avianinfluenza,AI)、新城疫(Newcastle
    disease,ND)及鸡传染性支气管炎(Infectiouslaryngotrache,IB)是在养鸡场中较为常见。三种疾
    病在临床上有相似的呼吸道症状,加之临床表现多为非典型性,疾病感染多为混合性,仅据
    临床症状和病理表现难以确诊,因此如何快速准确地做出诊断是有效预防治疗疾病,避免造
    成严重经济损失之根本。

    目前,对禽流感、新城疫及鸡传染性支气管炎确诊的方法主要为分子生物学诊断法和血
    清学诊断法。分子生物学诊断技术主要有RT-PCR,核酸探针技术,限制性酶切片段长度多态
    性分析等。血清学诊断主要有琼脂扩散试验(AGID),血凝试验和血凝抑制试验(HA/HI),
    免疫荧光法,酶联免疫法(ELISA)和免疫层析法等。分子生物学诊断法具有特异性强、灵
    敏度高等特点,但是对实验设备、实验人员具有较高的要求。血清学诊断法中琼脂扩散试验,
    血凝试验和血凝抑制试验操作较为简单,但其特异性和灵敏度不高,其他如免疫荧光,酶联
    免疫法同样对设备,人员及操作有高要求。上述方法大多耗时较长(如RT-PCR需1.5~2小时;
    琼脂扩散试验需24~48小时;血凝抑制试验需2~3小时;ELISA试验需3~5小时等),不
    便于适时和快速诊断,所以均无法在基层大范围地推广使用。

    胶体金免疫层析(gold-immunochromatographyassayGICA)是以胶体金作为示踪物,基于
    胶体金标记技术应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。其核心技术是以硝酸纤维素
    膜为固相载体,因毛细管作用而促使样品溶液在层析条上泳动,并使样品中的待检物与层析
    膜上针对待检物的受体(如抗原或抗体)在短时间内发生高特异性、高亲和性的免疫反应。它
    具有简便,快速,特异性强,灵敏度高,费用低的优点。

    基于该技术,国内外在人医疾病监测,环境危害监控,食品安全保障及畜禽疾病检测等
    领域,都已经研制出了多种胶体金免疫层析快速检测测试卡。在鸡疫病诊断和检测方面,鸡
    新城疫、鸡传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊及鸡毒霉形体抗体免疫胶体金快速检测试剂盒
    获得相关专利(专利号:200710169103.0;200710169105.X;200710169104.5;200710169106.4)。

    但是上述试剂盒是对相关疾病或疫苗免疫后抗体水平的检测,而不能准确的反应鸡群是
    否感染疫病。虽然目前也有部分针对单个病原的免疫胶体金检测方法,如专利申请号为
    200510042631.0的“禽流感病毒抗原检测方法及其金标快速诊断试剂盒和制备方法”,专利申
    请号为200510057023.7的文献“禽流感免疫胶体金诊断试纸条和测试卡”公开了几种检测禽流
    感病毒抗原的制备方法,但是对于混合感染的病例的诊断效果并不佳,使用多个单检胶体金
    试纸条进行检测又造成了时间和资源的浪费。而多元检测可以一次性的针对多个病原进行检
    测,从而很好的解决了这个问题。三元的联合检测试剂盒(测试卡)可使所耗降低至三分之
    一,从而为社会节省出大量资源,为疾病有效的快速治疗提供了更为充足的时间。

    本发明通过分别制备禽流感、新城疫及鸡传染性支气管炎单克隆抗体各两株,利用双抗
    夹心免疫层析技术,用单个测试卡同步即可检测样品中是否为禽流感、新城疫及鸡传染性支
    气管炎病原。

    发明内容

    本发明的目的在于克服现有检测技术的缺陷,提供一种抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆
    抗体,该单克隆抗体可在禽三种呼吸道疾病(禽流感H5亚型和H9亚型、新城疫及鸡传染性
    支气管炎)病原检测的三联快速检测试剂盒中应用。本发明的试剂盒特异性强、灵敏度高、
    操作简便,可用于同步完成禽流感H5和H9亚型、新城疫及鸡传染性支气管炎病毒三种禽呼
    吸道疾病病原的检测。

    本发明还涉及六株分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株的构建与开发利用。

    本发明的总体技术路线图如图1所示。

    本发明通过以下技术方案实现:

    为了实现本发明,申请人分别制备了两种针对不同抗原位点且能分抗禽流感病毒(简称
    AIV)杂交瘤细胞株XYCSJL-AIV-2B8及XYCSJL-AIV-4B7,两种分泌抗新城疫病毒(简称
    NDV)杂交瘤细胞株XYCDY-NDV-3E11及XYCDY-NDV-4B10和两种分泌抗鸡传染性支气管
    炎病毒(简称IBV)杂交瘤细胞株XYCDY-1BV-3G5及XYCDY-1BV-1E6。上述六株细胞均已于
    2014年3月11日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏,对应的保
    藏信息汇总于如表1。

    表1本发明制备的六株杂交瘤细胞株的保藏信息


    在此基础上申请人提供了禽三种呼吸道疾病的三联快速快速禽流感(H5和H9亚型)、
    新城疫及鸡传染性支气管炎病毒的试剂盒,该试剂盒包括测试卡和样品稀释液,其中测试卡
    由样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸收垫(4),PVC背衬(9)和测试卡壳(10)
    组成,其具体结构是:在PVC背衬(9)上按顺序依次粘附有样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸
    纤维素膜(3)、吸收垫(4);将试纸条装入测试卡壳(10)中构成测试卡。在所述的金标垫(2)
    上包被有所述的三种金标单克隆抗体混合溶液(该溶液含有抗禽流感病毒单克隆抗体
    XYCSJL-AIV-2B8-胶体金标记物、抗新城疫病毒单克隆抗体XYCDY-NDV-3E11-胶体金标
    记物和抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体XYCDY-1BV-3G5-胶体金标记物);所述的硝酸
    纤维素膜(3)上包被有抗禽流感病毒单克隆抗体XYCSJL-AIV-4B7,抗新城疫病毒单克隆抗
    体XYCDY-NDV-4B10和抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体XYCDY-1BV-1E6分别构成的
    检测线T1(5)、T2(6)和T3(7);质控线(8)含有兔抗鼠IgG。

    申请人提供一种快速制备适用于禽流感H5亚型和H9亚型、新城疫及鸡传染性支气管炎
    病毒病原的三联快速检测试剂盒的方法,具体步骤如下:

    1)禽流感病毒重组血凝素HA1蛋白(简称AIV-HA1),鸡新城疫病毒重组血凝素HN蛋
    白(简称NDV-HN)和鸡传染性支气管炎病毒重组核衣壳N蛋白(简称IBV-NP)的表达制备。通
    过对禽流感HA1基因、新城疫HN基因和鸡传染性支气管炎N基因的序列克隆,并连接相应
    载体从而构建三种重组蛋白表达载体pKG-HA1,pKG-HN和pKG-NP。其中表达载体
    pKG-HA1的物理构建图谱参见文献:中国知网学位论文库:吴仁蔚,禽流感病毒重组蛋白粘
    膜免疫研究及N-ELISA抗体检测方法的建立[D]华中农业大学,
    2006//epub3.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx?dbcode=CDFD&QueryID=9&CurRec=1&dbna
    me=CDFD9908&filename=2006190169.nh&urlid=&yx=&uid=WEEvREcwSlJHSldTTGJhYkhsd0
    Z6ODd6RU81ZVo0ODlGZ2hITVNLZlMwRHM5RzdZNG1mdWJmU3NZZFBoeTAwbg==&v=M
    TM0NThSOGVYMUx1eFlTN0RoMVQzcVRyV0。而表达载体pKG-HN和pKG-NP的物理构
    建图谱如图4和5所示。

    2)AIV-HA1,NDV-HN和IBV-NP三种蛋白的纯化。重组蛋白纯化所用层析柱为
    GSTrapTMFFcolumns(购买自GEHealthcare.USA)。纯化重组蛋白按GSTrapTMFFcolumns说
    明书进行。

    3)用纯化后的三种重组蛋白AIV-HA1,NDV-HN和IBV-NP分别免疫Balb/C小鼠(购
    自武汉生物制品研究所实验动物中心),得到抗禽流感病毒(AIV)杂交瘤细胞株
    XYCSJL-AIV-2B8和XYCSJL-AIV-4B7,抗新城疫病毒(NDV)杂交瘤细胞株
    XYCDY-NDV-3E11和XYCDY-NDV-4B10,抗鸡传染性支气管炎病毒(IBV)杂交瘤细胞株
    XYCDY-1BV-3G5和XYCDY-1BV-1E6,将杂交瘤细胞株注入经处理过的Balb/C小鼠,得到
    含单抗的腹水,经辛酸-硫酸铵法(朱立平主编《免疫学常用实验方法》,人民军医出版社,2000
    版)得到纯化的单克隆抗体。六株细胞均已于2014年3月11日送交中国.武汉.武汉大学中国
    典型培养物保藏中(CCTCC),保藏信息分别为:杂交瘤细胞株XYCSJL-AIV-2B8,其保藏号:
    CCTCCNO:C201449;杂交瘤细胞株XYCSJL-AIV-4B7,其保藏号:CCTCCNO:C201453;
    杂交瘤细胞株XYCDY-NDV-3E11,其保藏号:CCTCCNO:C201451;杂交瘤细胞株
    XYCDY-NDV-4B10,其保藏号:CCTCCNO:C201455;杂交瘤细胞株XYCDY-IBV-3G5,
    其保藏号:CCTCCNO:C201450;杂交瘤细胞株XYCDY-IBV-1E6,其保藏号:CCTCCNO:
    C201454;

    4)提取小鼠IgG免疫健康新西兰兔(购自武汉生物制品研究所实验动物中心),得到兔
    抗鼠IgG抗体;

    5)用柠檬酸三钠与氯金酸(购自sigma公司)反应制备胶体金;

    6)将步骤3)制备的抗AIV抗体(XYCSJL-AIV-2B8),抗NDV抗体(XYCDY-NDV-3E11)
    和抗IBV抗体(XYCDY-1BV-3G5)分别加入步骤5)制备的胶体金中,得到三种单克隆抗体
    -胶体金标记物按一定体积混合浓缩之后构成金标混合物;

    7)将三种金标混合物包被在金标垫(2)上;

    8)将步骤3)制备的抗AIV抗体(XYCSJL-AIV-4B7),抗NDV抗体(XYCDY-NDV-4B10)
    和抗IBV抗体(XYCDY-1BV-1E6)依次包被在硝酸纤维素膜(3)上分别构成检测线T1(5),
    T2(6)和T3(7);并将兔抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜(3)上构成质控线(8);

    9)在所述的PVC背衬(9)上按顺序依次粘附所述的样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤
    维素膜(3)、吸收垫(4),得到所述的AIV(H5或H9),NDV和IBV的多元检测免疫胶体
    金试纸条。

    10)将9)中所述试纸条装入测试卡壳(10)中构成测试卡。

    很显然,本发明制备六个分泌特定单克隆抗体的杂交瘤细胞可以按同种病毒种
    类分成三组成对使,用即组成双抗体夹心使用,其中:

    分泌抗禽流感病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞XYCSJL-AIV-2B8和XYCSJL-AIV-4B7在制
    备检测禽流感病毒H5和H9亚型抗原中是成对使用。

    分泌抗新城疫病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞XYCDY-NDV-3E11和XYCDY-NDV-4B10
    在制备检测新城疫病毒抗原中是成对使用。

    分泌抗鸡传染性支气管炎病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞XYCDY-1BV-3G5和
    XYCDY-1BV-1E6在检测新城疫病毒抗原中是成对使用。

    由于本试剂盒采用了上述双抗体夹心法包被抗体,因而可以大大提高了本发明的试剂盒
    的检测效果。

    本发明的原理是采用双抗体夹心法(为报道的常规方法),以检测线T1包被抗AIV抗体
    (XYCSJL-AIV-4B7)检测样品中是否含有禽流感病毒(AIVH5或AIVH9)为例进行说明,
    当待检样品中含有AIV(H5或H9)时,样本中的AIV(H5或H9)会在金标垫位置和金标
    抗AIV抗体(XYCSJL-AIV-2B8)发生反应,反应复合物层析到检测线位置时,包被在检测
    线T1上的抗AIV抗体会和复合物中的AIV(H5或H9)发生反应,从而在检测线位置形成
    “金标抗体-AIV-包被抗体”双抗体夹心复合物,由于在复合物中有一种抗体是胶体金标记
    的,所以在检测线位置就会出现肉眼可见的红色条带,这样就得到阳性结果。未参与反应的
    金标抗体层析到质控线位置,被包被的兔抗鼠的lgG所捕获而显色。相反,如果样品中不含
    AIV(H5或H9)时,在检测线位置不含双抗体夹心复合物,就不会出现红色条带,这样就
    得到了阴性结果。本发明试剂盒中的检测试纸条(结构图如图2所示)由样品垫(1)、金标垫
    (2)、硝酸纤维素膜(3)、吸收垫(4)按图示的顺序依次粘附在PVC背衬(9)上组装而成的,试纸
    条装入测试卡壳(10)中构成测试卡。

    与现有技术相比,本发明具有以下突出的优点:

    1、本发明的多元快速检测禽流感H5和H9亚型、新城疫及鸡传染性支气管炎病毒胶体金
    试剂盒,具有特异性强,灵敏度高,检测时间短(10-15分钟)判断直观等优点。

    2、本发明的试剂盒不需要任何特殊仪器、设备,检测成本低。同时由于本发明实现对三
    种禽主要呼吸道疾病(禽流感H5和H9亚型、新城疫及鸡传染性支气管炎病毒)病原的同
    时检测,从而更有效地节约了检测时间和检测成本。

    3、本发明的试剂盒操作简便。

    4、本发明的试剂盒储存方便,对储存温度要求不高,在4℃下的保质期至少为90天。

    附图说明

    图1:本发明的总体技术路线图。

    图2:本发明检测试纸条的组装示意图。

    图中1-样品垫,2-金标垫,3-硝酸纤维素膜,4-吸收垫,5-检测线T1,6-检测线T2,
    7-检测线T3,8-质控线,9-PVC背衬,10-测试卡壳。

    图3:本发明检测试卡结果判定示意图。

    图中:11:表示检测AIV,NDV,IBV均为阳性结果;12:表示检测AIV为阳性,NDV
    和IBV均为阴性结果;13:表示检测NDV为阳性,AIV和IBV均为阴性结果;14:表示检
    测IBV为阳性,AIV和NDV均为阴性结果;15:表示检测AIV,NDV,IBV均为弱阳性结
    果;16、17:表示测试卡失效。

    图4:本发明涉及NDV-HN的重组蛋白表达质粒的物理构建图。

    图5:本发明涉及IBV-NP的重组蛋白表达质粒的物理构建图。

    具体实施方式

    实施例1

    1.AIV-HA1蛋白,NDV-HN蛋白和IBV-NP蛋白的制备

    AIV-HA1蛋白,NDV-HN蛋白和IBV-NP蛋白的制备方法主要参见文献:萨姆布鲁克J,
    弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T主编(金冬雁,黎孟枫等译).分子克隆实验指南.第二版,科学出
    版社,1992中提供的方法进行。

    1.1禽流感病毒HA1基因的克隆与测序及表达载体pKG-NS1的构建

    本发明涉及的禽流感病毒HA1基因及其重组表达质粒pKG-HA1的构建方法及构建图谱
    已于2006年中国知网上公开发表,参见文献:中国知网学位论文库:吴仁蔚,禽流感病毒重
    组蛋白粘膜免疫研究及N-ELISA抗体检测方法的建立[D]华中农业大学,2006;参见网址:
    //epub3.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx?dbcode=CDFD&QueryID=9&CurRec=1&dbname=
    CDFD9908&filename=2006190169.nh&urlid=&yx=&uid=WEEvREcwSlJHSldTTGJhYkhsd0Z6O
    Dd6RU81ZVo0ODlGZ2hITVNLZlMwRHM5RzdZNG1mdWJmU3NZZFBoeTAwbg==&v=MTM
    0NThSOGVYMUx1eFlTN0RoMVQzcVRyV0;

    1.2新城疫HN基因的克隆与测序及表达载体pKG-HN的构建

    本发明涉及的新城疫HN基因的序列及克隆方法及表达载体pKG-HN的构建方法参考文
    献:中国知网学位论文库:孙淑娜,新城疫病毒F基因和HN基因的克隆表达及其ELISA抗体
    检测方法的初步建立[D],华中农业大学,2006;参见网址:
    //epub3.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx?dbcode=CMFD&QueryID=7&CurRec=1&dbname=
    CMFD9908&filename=2006190369.nh&urlid=&yx=&uid=WEEvREcwSlJHSldTTGJhYlNcGZ2O
    HlzRkwxL0k2RVBNdlRoYWMzMllid1d5bUVYOXE3ZU9jcm11MC91WmJUeA==&v=MjI3OT
    h6TVYxMjdHTEt4SHRMS3BwRWJQSVI。

    具体实施方法如下:用华中农业大学微生物与免疫实验室冻干保存的一株新城疫NDVLa
    Sota系毒株于尿囊腔接种NDV于9-11日龄健康SPF(无特定病原体)鸡胚(购自武汉生物制品
    研究所),弃24小时前死胚,收集24-96小时的鸡胚尿囊液;4℃条件下4,000rpm离心30min,
    取上清;4℃条件下30,000rpm离心60min浓缩病毒。用pH7.2的PBS(DEPC处理水配制)溶解
    沉淀,分装后-70℃保存备用。根据GenBank收录的NDVLaSota系分离株HN基因序列(登录
    号:AJ629060.1)设计并合成引物,扩增HN基因。上游引物P1:
    ATAGGATCCGGGGCTAGCACACTTA;下游引物P2:AGCAAGCTTCTAGCCAGACTTGG
    CT。P1位于启动子上游,加有BamHI位点,P2包含有终止密码子,加入了HindIII位点,两酶
    切位点用下划线标出。两引物之间为缺失胞质区和跨膜区序列的HN基因。取适量病毒悬液提
    取RNA,按TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver.2.1说明书中提供的方法,扩增出DNA,采用
    UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒(E.Z.N.AGelExtractionKit)回收纯化RT-PCR扩增产物,将
    回收的RT-PCR产物直接与购自TaKaRa公司的克隆载pMD18-T进行连接反应,然后将连接产
    物转化到试剂盒(购自TaKaRa公司的商业试剂盒)中感受态细胞大肠杆菌DH5α中,挑取阳
    性克隆,采用碱裂解法(萨姆布鲁克J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T主编(金冬雁,黎孟枫等译).分
    子克隆实验指南.第二版,北京科学出版社,1992版)提取重组质粒DNA,并对重组质粒DNA
    进行鉴定。将鉴定正确的重组质粒命名为pMT-HN,并送上海生工生物工程有限公司进行测
    序,然后将序列测定结果与GeneBank中的有关数据进行同源性比较和分折。

    pMT-HN用BamHI和HindIII酶切,回收1590pb左右的片段,然后将此片段与用同样的酶
    酶切的AmershamBiosciences公司的表达载体pGEX-KG连接,构建表达载体。重组表达载体
    转化新鲜制备的DH5α感受态细胞,并将转化菌涂布含氨苄青霉素的LB琼脂平板37℃培养过
    夜。挑数个单菌落培养过夜后用碱裂解法小量制备质粒,进行酶切分析和PCR扩增鉴定。将
    得到的阳性克隆命名为pKG-HN。对阳性克隆用碱裂解法大量制备质粒DNA,并分装冻存于
    -20℃。重组表达质粒pKG-HN构建流程如图4所示。

    1.3鸡传染性支气管炎N基因的克隆与测序及表达载体pKG-NP的构建

    本发明涉及的新城疫、鸡传染性支气管炎N基因的序列及克隆方法及表达载体pKG-NP
    的构建方法参考文献:中国知网学位论文库:李中华,传染性支气管炎病毒纤突蛋白、核蛋
    白基因的克隆、表达及其在抗体检测中的初步应用[D],华中农业大学,2006;参见网址:
    //epub3.cnki.net/KCMS/detail/detail.aspx?dbcode=CMFD&QueryID=14&CurRec=1&dbname
    =CMFD9908&filename=2006190367.nh&urlid=&yx=&uid=WEEvREcwSlJHSldTTGJhYlNPcGZ
    2OHlzRkwxL0k2RVBNdlRoYWMzMllid1d5bUVYOXE3ZU9jcm11MC91WmJUeA==&v=MjQ5
    NDY2ZlpPZHVGeXpnVnJ6SVYxMjdHT。具体实施方法如下:用华中农业大学兽医微生物与
    免疫实验室冻干保存的一株鸡传染性支气管炎IBV(H52strain)毒株于尿囊腔接种NDV于
    9-11日龄健康SPF(无特定病原体)鸡胚(购自武汉生物制品研究所),弃24小时前死胚,收
    集24-96小时的鸡胚尿囊液;4℃条件下4,000rpm离心30min,取上清;4℃条件下30,000rpm
    离心60min浓缩病毒。用pH7.2的PBS(DEPC处理水配制)溶解沉淀,分装后-70℃保存备
    用。根据GenBank收录的IBV的N基因序列(登入号:EF602459.1)对其N基因中较为保守
    的序列设计并合成引物,扩增N基因。上游引物P1:GGATCCATGGCAAGCGGTAAA
    GCAG;下游引物P2:CCGAGCTCTCAAAGTTCATTCTCTCC。P1位于启动子上游,
    加有BamHI点,P2包含有终止密码子,加入了ScaⅠ位点,两酶切位点用下划线标出。两引
    物之间为N基因中较为保守的片段。取适量病毒悬液提取RNA,按TaKaRaRNAPCRKit
    (AMV)Ver.2.1说明书中提供的方法,扩增出DNA,采用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒
    (E.Z.N.AGelExtractionKit)回收纯化RT-PCR扩增产物,将回收的RT-PCR产物直接与购
    自TaKaRa公司的克隆载pMD18-T进行连接反应,然后将连接产物转化到试剂盒(购自
    TaKaRa公司的商业试剂盒)中感受态细胞大肠杆菌DH5α中,挑取阳性克隆,采用碱裂解法
    (萨姆布鲁克J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T主编(金冬雁,黎孟枫等译).分子克隆实验指南.第
    二版,北京科学出版社,1992版)提取重组质粒DNA,并对重组质粒DNA进行鉴定。将鉴
    定正确的重组质粒命名为pMT-N,并送上海生工生物公司进行测序,然后将序列测定结果与
    GeneBank中的有关数据进行同源性比较和分折。

    pMT-N用BamHI和ScaⅠ酶切,回收1.2kb左右的片段,然后将此片段与用同样的酶酶
    切的AmershamBiosciences公司的表达载体pGEX-KG连接,构建表达载体。重组表达载体
    转化新鲜制备的DH5α感受态细胞,并将转化菌涂布含氨苄青霉素的LB琼脂平板37℃培养
    过夜。挑数个单菌落培养过夜后用碱裂解法小量制备质粒,进行酶切分析和PCR扩增鉴定。
    将得到的阳性克隆命名为pKG-NP。对阳性克隆用碱裂解法大量制备质粒DNA,并分装冻存
    于-20℃。重组表达质粒pKG-NP构建流程如图5所示。

    1.4AIV-HA1,NDV-HN和IBV-NP三种蛋白的表达

    用重组质粒pKG-HA1、pKG-HN和pKG-NP及表达载体pGEX-KG分别转化大肠杆菌
    BL21(DE3),涂含氨苄青霉素(Amp)的LB平板(1%(W/V)Tryptone,0.5%(W/V)YeastExtract,
    0.5%(W/V)NaCl,0.1mg/mLAmp和1.5%(W/V)Agar),置37℃恒温箱培养,挑取单菌落,接
    种于2.0mL含氨苄青霉素(Amp)的液体LB培养基(1%(W/V)Tryptone;0.5%(W/V)Yeast
    Extract;0.5%(W/V)NaCl和0.1mg/mLAmp)内,37℃250-300r/min振荡培养,当OD600nm
    达到0.6-1.0时。分别接种1.0mL菌液到10.0mL含氨苄青霉素(Amp)的液体LB培养基内,
    37℃250-300r/min振荡培养3h,而后加入终浓度为0.024mg/mL的诱导剂IPTG(异丙基-β-D-
    硫代吡喃半乳糖苷),诱导4小时,离心收集菌体进行SDS-PAGE检测。

    1.5AIV-HA1,NDV-HN和IBV-NP三种蛋白的纯化

    (1)上清的纯化

    按照上述1.4中的条件大量诱导表达,将诱导后的细菌培养物于8,000r/min离心10min,
    沉淀用PBS(磷酸盐)缓冲液(140mMNaCl,2.4mMKCl,10mMNa2HPO4.12H2O,1.8mM
    KH2PO4pH7.4)(约为原菌液体积的l/10)重悬,加DTT(二硫苏糖醇)至终浓度为10mmol/L,
    用压力破碎仪破碎至液体变为透明,4℃,12,000r/min离心15min,用0.22μm的滤膜过滤破
    碎后的上清,用GSTrapTMFFcolumns层析柱经AKTA蛋白纯化系统AKTAexplorer10(购自
    GEHealthcare公司,USA)对上述上清液进行纯化。

    (2)包涵体的纯化与复性

    将上述(1)中破碎离心后的沉淀用PBS(pH7.4)洗2次,加19.7mL缓冲液A(50mM
    Tris-Cl,0.5mMEDTA,50mMNaCl,5%(W/V)Glycerol)及0.3mL20%(W/V)SKL(十
    二烷基肌氨酸钠)贮存液,剧烈搅动,使其溶解,静置2h,于4℃12000r/min离心10min,
    弃沉淀,取上清,加20%(W/V)PEG-4000(聚乙二醇4000)至终浓度为0.2%,加50mmol/L
    的氧化型谷胱苷肽至终浓度为1mmol/L,加100mmol/L的还原型谷胱苷肽至终浓度为2
    mmol/L,静置2h,以PBS(pH7.4)透析2~3天,-70℃保存备用。

    (3)蛋白浓度的测定及鉴定

    用核酸蛋白测定仪分别测定蛋白质溶液在280nm和260nm波长下的光吸收值为A280、
    A260。依据公式计算出蛋白浓度,将达到要求浓度的蛋白溶液分装成100μL/管,取50μL进
    行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定和Western-blot分析,其余置-70℃
    保存备用。

    SDS-PAGE检测:取上述收集的菌体,用40.0μLddH2O充分重悬菌体,加入等体积的加
    样缓冲液(250mMTris-HCl,10%(W/V)SDS,0.5%(W/V)溴酚蓝,50%(V/V)甘油,
    5%(V/V)β-巯基乙醇),水浴煮沸3-5min,然后冰浴等待加样电泳。按萨姆布鲁克J,弗
    里奇EF,曼尼阿蒂斯T主编;金冬雁,黎孟枫等译,《分子克隆实验指南》,第二版,1992
    版所述方法制备分离胶和积层胶,加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液(25mMTris-base,0.1%
    (W/V)SDS,0.25MGlycine),取处理的样品点样,电泳2h,取下凝胶,考马斯亮蓝R250
    染色液(0.1%(W/V)考马斯亮蓝R250,25%(V/V)异丙醇,10%(V/V)冰醋酸)染色2h,
    然后用SDS-PAGE脱色液(5%(V/V)乙醇,10%(V/V)冰醋酸)脱色,观察照相。并通过
    凝胶薄层扫描分析所表达的外源蛋白含量。

    Western-blot分析:为了分析所表达的带GST标签的融合蛋白AIV-HA1、NDV-HN和
    IBV-NP的免疫学活性,按如上所述方法进行SDS-PAGE电泳,电泳后的凝胶,不经染色,
    直接用转印装置将蛋白带电转印到NC膜上,以15V电转印1.5h。转印结束后,将NC膜于
    TBST(150mMNaCl,20mMTris-HCl,0.05%Tween20)中漂洗一下,再将NC膜转入可加热密封
    的塑料袋中,按0.1mL-0.15mL/cm2(NC膜面积)加入封闭液(含1%(W/V)牛血清白蛋白
    的TBST),尽可能排尽袋内的气泡后,加热密闭袋口,室温平缓摇动1-2h或4℃过夜。然后
    弃封闭液,将膜取出,将膜转入新的塑料袋中,按0.1mL-0.15mL/cm2的量加入经TBST稀释
    (1:150)的鸡抗AIV高免血清,同上排除气泡并密封袋口,在摇床上室温作用1h,用TBST洗
    6次,每次5mim,将膜转入新塑料袋中,按0.1mL-0.15mL/cm2加入经TBST稀释(1:5000)
    的兔抗鸡IgG-HRP(购自GenScript公司),室温反应1h,TBST洗6次,每次5min,最后再
    用TBS漂洗2次,加入以0.01mol/LTris-Cl(pH7.6)配制的底物溶液(DAB-H2O2)显色,
    一旦出现蛋白带,立即用ddH2O终止,即可观察并照相。

    根据公式计算(蛋白质浓度(mg/mL)=l.45×A280-0.74×A260)获得纯化的目标蛋白浓度分
    别为:HA1--0.45mg/mL;HN--0.53mg/mL;N--0.90mg/mL。利用Western-blot分析结果表明
    本发明重组的AIV-HA1蛋白(62KDa),NDV-HN蛋白(84KDa),IBV-NP蛋白(72和60KDa)
    分别与相应的阳性血清发生了特异性的反应,证实这几种表达产物均具有较好的抗原性。

    2.抗AIV抗体,抗NDV抗体和抗IBV抗体的制备:

    利用申请人所制备的三种重组蛋白AIV-HA1,NDV-HN和IBV-NP分别免疫Balb/C小鼠
    (购自武汉生物制品研究所实验动物中心),免疫程序是取蛋白含量100μg的溶液与等体积的
    弗氏完全佐剂(购自sigma公司)乳化,注射小鼠腹腔,21天后加强免疫,换用弗氏不完全
    佐剂(购自sigma公司)乳化,最后于融合前三天,(最好与上次免疫相隔4周以上),腹腔强
    化免疫,抗原量加倍(200μg),不加佐剂。融合时,取经最后强化免疫的Balb/C小鼠一只,
    眼眶放血处死(收集血清,即为阳性血清),在75%酒精中浸泡5min消毒。无菌取出小鼠脾脏,
    分离出脾细胞,与复苏的SP2/0骨髓瘤细胞(SP2/0骨髓瘤细胞由卫生部武汉生物制品研究所
    惠赠)按1~2×107个SP2/0与108个免疫细胞(1:10~1:15)的比例于50mL离心管中混匀,
    1500rpm,离心10min。倒净上清(可用灭菌的滤纸吸干),轻轻敲击管底,使细胞沉淀略加松
    动。将装有细胞混合物的离心管放于37℃水浴中。然后在1min内慢慢滴入预温至37℃的50%
    PEG0.8mL(购自sigma公司),边加边轻轻用吸管尖搅拌,继续搅拌1min。然后慢慢加入
    37℃预温的10mLRPMI-1640基础培养液(购自GIBCO公司)。具体方法为:第一分钟逐滴
    滴入1mL,第二分钟加1ml,第3~4分钟加3mL,第5分钟加入其余的5mL,每次加时需
    缓慢加入,并不断轻轻地搅拌。最后加入30mL1640液,也需慢慢加入。800rpm离心5min,
    去上清,于37℃放置5~8min。用HAT(购自GIBCO公司)培养基悬浮,同时也用HAT培养
    基悬浮制备好的饲养脾细胞并与融合后的细胞混合,根据需要补加适量的HAT培养基(培养
    基的成分:80mL的RPMI-1640基础培养液,20mL灭菌小牛血清,1mL100%的HAT,1mL
    的10,000U/mL的青链霉素双抗),分种于96孔培养板中,约250μL/孔。一次融合可接种4~
    8块96孔板。根据需要也可少种,一般按SP2/0骨髓瘤细胞的细胞数计算,每孔接种量约含
    104左右个SP2/0骨髓瘤细胞。于37℃,5%CO2培养箱中培养。融合后第二天开始观察有无
    污染,于第4天补加1滴HAT培养基,第8~10天吸去100μL培养基换HT(购自GIBCO
    公司)培养基100μL。待融合细胞集落长至培养孔1/4,培养基略变黄时,进行抗体检测。对
    于AI融合孔用AIV-HA1融合蛋白和AIV尿囊液分别作为包被原,ND融合孔包被原为
    NDV-HN融合蛋白和NDV尿囊液,IB融合孔包被原为IBV-NP融合和IBV尿囊液,均用双
    筛选检测,利用常规的ELISA方法筛选出分泌相应单克隆抗体的阳性孔。对筛选出来的阳性
    孔立刻用有限稀释法(参照薛庆善,《体外培养的原理与技术》,科学出版社,2001年版)进
    行克隆、筛选。经过3~4次克隆,最终筛选出分泌得到抗禽流感病毒(AIV)抗体杂交瘤细胞
    XYCSJL-AIV-2B8和XYCSJL-AIV-4B7,抗新城疫病毒(NDV)抗体杂交瘤细胞
    XYCDY-NDV-3E11和XYCDY-NDV-4B10和抗鸡传染性支气管炎病毒(IBV)抗体杂交瘤细胞
    XYCDY-1BV-3G5和XYCDY-1BV-1E6共6株细胞(生物保藏信息参见本说明书的《发明内
    容》部分)。对上述6株细胞进行染色体计数,结果显示,SP2/0骨髓瘤细胞的染色体的平均
    数为70条,脾细胞染色体数为40条,而杂交瘤细胞的染色体数目在80~94之间。均高于两
    亲本细胞的染色体数目,说明融合细胞的确是SP2/0骨髓瘤细胞与脾细胞的杂交产物,杂交
    瘤细胞的染色体数目明显多于SP2/0骨髓瘤细胞的染色体。用相加ELISA鉴定抗同一病原的
    两株细胞系均是针对不同抗原表位产生的抗体。将本发明的6株细胞(1×106个)分别注射
    Balb/C小鼠腹腔,生产单克隆抗体。采用ROCKLAND公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒(Mouse
    MabIsotypingTestKit)对本发明所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定,结果均为小鼠IgG2b亚
    类。

    3.单克隆抗体的纯化

    参照朱立平等,《免疫学常用实验方法》,人民军医出版社,2000版中报道的方法:取
    所得的小鼠腹水5mL与适量的二氧化硅混合,加入等体积的巴比妥缓冲液(配方:氯化钠
    85.00g,巴比妥5.75g,巴比妥钠3.75g,叠氮钠2.00g,用蒸馏水定容至2000mL),室温振荡
    1h后,在室温下静置30min,取上清于洁净离心管中,于4℃,3000rpm离心10min;取上
    清液8mL,加入16mL0.06mol醋酸钠缓冲液,用HCl调pH值至4.5,充分搅拌下缓缓加入
    辛酸132μL后,室温搅拌30min,然后转入4℃冰箱充分沉淀2h,4℃,15000rpm离心30min,
    得上清液22mL,加入2.2mL0.1M的磷酸缓冲液(简称PB,配方:10mMNa2HPO4.12H2O和
    1.8mMKH2PO4pH7.2),用NaOH调pH值至7.6,搅拌下缓缓加入硫酸铵至终浓度为
    0.277g/mL,4℃冰箱充分沉淀2h后,于4℃,12000rpm离心30min,弃上清,沉淀用5mL0.01M
    的PBS缓冲液(配方:140mMNaCl,2.4mMKCl,10mMNa2HPO4.12H2O,1.8mMKH2PO4
    pH7.2)重悬,装入透析袋,对5000mL0.01MpH7.2PBS缓冲液充分透析后,再对2000mL
    蒸馏水透析,最后对3000mL三蒸去离子水透析,将充分透析好的蛋白溶液用PEG-20000浓
    缩至3mL,然后于4℃,12000rpm离心30min,弃沉淀,收集上清液,测得六株单抗浓度在
    1.0-2.2mg/mL之间。经SDS-PAGE鉴定为纯化的单克隆抗体,其纯度大于95%。该单克隆抗
    体可用于制备免疫胶体金。

    4.兔抗鼠IgG抗体的制备:

    利用Balb/C小鼠IgG免疫健康新西兰大白兔,制备高特异性、高效价的兔抗鼠IgG高免
    血清,对高免血清采用饱和硫酸铵沉淀法(参考文献:朱立平等,《免疫学常用实验方法》,
    人民军医出版社,2000版)进行粗提,经G-200过柱后得到高纯度的兔抗鼠IgG抗体。我
    们利用该抗体是作为试剂盒的质控线的核心试剂。

    5.单克隆抗体-胶体金标记物的制备

    (1)胶体金的制备:

    用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%,置磁力加热搅拌器上搅拌煮沸,按每100mL
    0.01%氯金酸加入1.5mL1%柠檬酸三钠,继续煮沸,直到液体呈橙红色即停止加热,冷却至
    室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物,置4℃保存。

    (2)单克隆抗体-胶体金标记物的制备:

    将所得的抗AIV抗体XYCSJL-AIV-2B8,抗NDV抗体XYCDY-NDV-3E11和抗IBV抗
    体XYCDY-1BV-3G5分别标记胶体金颗粒。具体步骤如下:于磁力搅拌下,用0.1M碳酸钾
    溶液调胶体金的pH值至8.0,按5~7.2μg抗体/mL胶体金加入上述三种单克隆抗体(抗AIV
    抗体XYCSJL-AIV-2B8,抗NDV抗体XYCDY-NDV-3E11和抗IBV抗体XYCDY-1BV-3G5),
    继续搅拌混匀30min,加入10%BSA(牛血清白蛋白)至终浓度为1%,静置30min。12000
    rpm,4℃离心30min,弃上清,沉淀用0.02MpH9.0的硼酸盐缓冲液(配方:硼酸0.1237g,
    PEG-200001g,用三蒸水定容至1000mL,调pH至9.0)洗涤两次,用二十分之一初始胶体
    金体积的0.02MpH9.0的硼酸盐缓冲液(配方:硼酸0.1237g,PEG-200001g,用三蒸水定容
    至1000mL,调pH至9.0)将沉淀重悬,置4℃备用,保质期60天。

    6.金标垫的包被

    将金标垫浸泡于封闭液(配方:2%BSA,2.5%蔗糖,0.3%PVPK-30,0.02%NaN3,0.5%
    Teewn-20,0.5%PEG-2000,10mMNa2HPO4.12H2O和1.8mMKH2PO4pH7.2)中30min后,
    于37℃烘干。取等体积的上述制备的三种单克隆抗体(抗AIV抗体XYCSJL-AIV-2B8,抗NDV
    抗体XYCDY-NDV-3E11和抗IBV抗体XYCDY-1BV-3G5)的抗体金标物充分混合后浓缩,
    用Biodot点膜仪将制备好的单克隆抗体-胶体金标记物均匀包被在金标垫上,每厘米金标垫
    包被9μL抗体-胶体金标记物,真空干燥(按常规方法),真空封装(按常规方法),置4℃
    备用。

    7.样品垫的处理

    将样品垫浸泡于封闭液(含2%BSA,2.5%蔗糖,0.3%PVPK-30,0.02%NaN3,0.5%
    Teewn-20,0.5%PEG-2000,10mMNa2HPO4.12H2O和1.8mMKH2PO4pH6.4)中30min后,
    于37℃烘干,真空封装,置4℃备用。

    8.硝酸纤维素膜的包被

    用包被液(含3%甲醇,1%蔗糖的0.01MpH7.4PBS缓冲液)将抗AIV抗体XYCSJL-
    AIV-4B7,抗NDV抗体XYCDY-NDV-4B10和抗IBV抗体XYCDY-1BV-1E6稀释10-18μg/mL,
    用Biodot点膜仪将其依次包被于硝酸纤维素膜上作为检测线(检测线依次为T1,T2和T3),
    包被量为0.7μL/cm,该检测线靠近金标垫端,距金标垫垫端约5mm;用包被液将兔抗鼠IgG
    抗体稀释到500μg/mL,用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜作为质控线,包被量为
    0.7μL/cm,该质控线靠近吸收垫,距吸收垫约5mm,质控线或检测线两两之间距离为3~4mm。
    37℃烘干30-40min,备用。

    9.试剂盒的组装

    将样品垫(1)、金标垫(2)、硝酸纤维索膜(3)、吸收垫(4)按图2所示的顺序依次粘附在PVC
    背衬(7)上,切成4mm宽的小条,封装于测试卡壳(10)中组成测试卡,制备完成后将该试
    剂盒内的测试卡真空封装。于4℃保存,保质期至少为90天。

    实施例2(应用实施例)

    禽主要呼吸道疾病三联快速检测试剂盒的使用方法

    1.试剂盒的组成,包括:

    ①测试卡25条

    ②样品稀释液一瓶(10mL/瓶)

    2.样品的制备

    2.1样品稀释液:样品稀释液为0.85%氯化钠溶液。配制方法:8.5gNaCl,加蒸馏水定容至
    1000mL。

    2.2样品制备

    样本采集和处理的详细操作方法如下:

    (1)气管咽部样本:先用手将鸡的嚎拨开,然后用手或镊子将鸡的舌头拉出,露出咽部,
    将棉拭子插入咽部气管内,搅动几下取出,再放入事先己加入500μL样品稀释液的样品管内,
    用力搅拌、挤压,尽可能使棉拭子上的样品洗脱下来,静置15min后,管内液体上清即为待
    检样品;

    (2)泄殖腔样本或运禽车辆上的粪渍样本:直接用棉拭子从鸡的泄殖腔取样或蘸取运禽车辆
    上的粪渍,然后将棉拭子放入事先己加入500μL样品稀释液的样品管内,同上洗脱样品,弃
    去棉拭子,静置后管内的上清液即为待检样品;

    (3)肌肉或内脏样本:取胸肌或大腿处肌肉一小块或内脏器官一小块(l-2g),在研磨器内加
    入1-3mL样品稀释液充分研磨后,冻融一次,4,000r/min,离心5min,上清即为待检样品。

    3.检测:取出试剂盒,室温平衡20分钟;打开包装袋,取出测试卡,取100-120μL制备
    好的样品滴入测试卡的加样孔中,10~15分钟内判定结果。

    4.结果判定:如图4所示,NC膜上的检测线T1,T2和T3分别对应检测AIVH5或AIVH9,
    NDV和IBV。当测试卡中NC膜上的质控线出现肉眼可见的紫红色,而相对应的检测线如T1
    (或T2或T3)没有出现肉眼可见的紫红色,检测样品中不含AIVH5或AIVH9(或NDV
    或IBV),结果判为阴性,记为“-”;当测试卡出现肉眼可见的紫红色质控线,同时相对应
    的检测线如T1(或T2或T3)出现肉眼可见的紫红色,检测样品中含AIVH5或AIVH9(NDV
    或IBV),结果判为阳性,记为“+”;检测线颜色深度与被检血清中的病毒量呈正相关,颜
    色越深说明被检测样品的病毒含量越高,质控线无条带出现则判为检测测试卡失效。

    实施例3

    1禽主要呼吸道疾病三联快速检测试剂盒的应用举例

    1.1鸡标准抗原的检测

    ①特异性试验:分别将商购的禽流感H5亚型HI抗原、禽流感H9亚型HI抗原、鸡新城
    疫HI抗原、传染性支气管炎HI抗原(上述生物材料购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究
    所)、减蛋综合征(EDSV-76)HI抗原、鸡传染性法氏囊(IBD)琼扩抗原、鸡毒霉形体抗原,
    鸡传染性喉气管炎(AILT)病毒抗原(上述生物材料购自北京.中国兽医药品监察所)、0.85
    %氯化钠溶液和阴性尿囊液按本发明实施例2所述方法(GICA)进行试验。本发明试剂盒中
    的检测测试卡检测禽流感H5亚型HI抗原、禽流感H9亚型HI抗原、鸡新城疫HI抗原、
    传染性支气管炎HI抗原时,质控线及对应的检测线均出现明显的紫红色条带,非对应的检
    测线则不显紫红色条带(如检测禽流感H5亚型HI抗原时,质控线与检测线T1同时出现
    紫红色条带,而检测线T2和T3不出现条带;而同时检测3种上述抗原,是质控线与检测
    线T1,T2和T3同时出现紫红色条带);而检测0.85%氯化钠溶液(空白)、阴性尿囊液、
    减蛋综合征(EDSV-76)HI抗原、鸡传染性法氏囊(IBD)琼扩抗原、鸡毒霉形体抗原和鸡传
    染性喉气管炎病毒抗原,仅质控线出现紫红色条带。这表明本发明试剂盒中的测试卡特异
    性高,表明与禽的其它重要疾病抗原无任何交叉反应。

    表2应用本发明的测试卡对禽标准抗原特异性检测结果


    注:“+”检测线显色,“-”表示检测线不显色。

    ②敏感性试验:用0.85%氯化钠溶液对禽流感H5(H9)亚型HI抗原、鸡新城疫HI抗原、
    传染性支气管炎HI抗原分别先稀释10倍后倍比稀释,最终稀释度为1∶10240,各取
    100-120μL稀释好的样品按本发明的试剂盒测试卡进行试验。结果见表3。当禽流感H5(或
    H9)亚型HI抗原倍比稀释至1:2560时,鸡新城疫HI抗原倍比稀释至1:1280时,传染性支
    气管炎HI抗原倍比稀释至1:640测试卡仍呈阳性反应,表明本试剂盒中的测试卡灵敏度较高。
    同时制备AIV,NDV及IBV三种病原的单项检测的测试卡测试其敏感性,结果表明本发明
    试剂盒中的测试卡与三种病原的单检测试卡并无差异。

    表3本发明测试卡检测三种标准抗原的敏感性试验结果


    1.2本发明的试剂盒对送检样品的检测及其与病毒分离检测方法的比较

    用本发明的试剂盒对湖北省武汉市周边养鸡场共采集118份气管拭子样品进行了检测
    (样品的制备参见实施例2),同时对样品进行病毒分离和鉴定,以血凝(HA)与血凝抑制
    (HI)检测为对照,其中检测AIV参见中华人民共和国国家标准GB/T18936-2003,检测NDV
    参见中华人民共和国国家标准GB/T16550-2008,检测IBV参见中华人民共和国国家标准
    GB/T23197-2008。二者之间对比的检测结果见表4-6,由表4中可以看出,当检测AIVH5(或
    H9)亚型时,本发明的试剂盒与HA和HI检测的阳性符合率70%和阴性符合率90.7%,总符
    合率为92.3%。由表5中可以看出,当检测NDV时,本发明的试剂盒与HA和HI检测的阳
    性符合率76.5%和阴性符合率91.7%,总符合率为96.2%。而由表6中可以看见,当检测IBV
    时,本发明的试剂盒与HA和HI检测的阳性符合率70.6%和阴性符合率95.3%,总符合率为
    95.7%。结果表明本发明的试剂盒与HA与HI检测方法的检测结果基本一致,符合率较好。

    表4本发明的试剂盒与血凝(HA)和血凝抑制(HI)检测的临床检测AIV结果


    表5本发明的试剂盒与血凝(HA)和血凝抑制(HI)检测的临床检测NDV结果


    表6本发明的试剂盒与血凝(HA)和血凝抑制(HI)检测的临床检测IBV结果


    实施例4

    本发明的禽三种呼吸道疾病三联快速检测试剂盒稳定性的考核

    将分别在4℃和37℃放置的真空封装的本发明的试剂盒测试卡,在第7、16、35、54、70、
    90天取出,用禽流感H5亚型HI抗原、禽流感H9亚型HI抗原、鸡新城疫HI抗原和传染性支气管
    炎HI抗原用0.85%氯化钠溶液30倍稀释后进行检测。结果如表7,本发明的试剂盒在4℃的保
    存期较长,保存期至少为90天。

    表7试剂盒不同贮存条件下的保存期试验结果


    注:“+”检测线显色,“-”表示检测线不显色。

    尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明,但是不能认为是对本发明范围的限制,本
    发明的范围由所附权利要求书限定。另外,本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围
    内对本发明进行各种改动或修饰,这些改动或修饰形式同样落在本发明的?;し段?。

    关 键 词:
    一种 传染性 支气管炎 病毒 单克隆抗体
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